巧36〇6日(：161'；[1111189.〔449)为模板（2012年11 月27日在中国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏编号为N0:CCTCC Μ 2012484)，根据幾基还原 酶化KRED20的基因序列设计引物，PCR的方法克隆获得该基因，并连入ρΕΤ 28a( + )，转入大 肠杆菌化2UDE3)中构建重组菌。也可W根据幾基还原酶化KRED20的序列信息在生物合成 公司直接合成该基因。
[0042] 幾基还原酶化KRED20的诱导表达:挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/ml)培养基 中，37°C，200巧m，培养16h，Wl%的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中（500ml 容量摇瓶装入200ml培养基），37°C，200rpm，培养化，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导后，30°C 继续培养至24h。离屯、（8000rpm，4°C，10mirO收集菌体，憐酸钟缓冲溶液(pH7.0、0.1M)洗 涂2次，离屯、，获得湿菌体。
[0043] 粗酶液和粗酶粉的获得：将上述获得的湿菌体重悬于憐酸钟缓冲液中（PH7.0、 0.1M)，经高压均质机破碎后，冷冻离屯、（12000rpm，4°C，20min)，得到的上清液即为粗酶液， 将其冷冻干燥后获得的酶粉即为粗酶粉。
[0044] 根据本领域一般常识，上述湿菌体(休止细胞）、粗酶液和粗酶粉均可作为生物催 化剂用于底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬的催化。
[0045] 幾基还原酶畑KR抓20的纯化采用的是儀柱亲和层析方法（美国Bio-Rad公司产 品），按照产品使用说明进行纯化。
[0046] 实施例2异丙醇浓度对生物催化过程的影响
[0047] 根据幾基还原酶生物催化的常识，可直接用NADH(NADPH)为辅酶，但是价格昂贵。 本发明设及的幾基还原酶畑KR抓20可利用异丙醇作为辅酶循环底物（J.Mol. Catal.B: Enz . 2014,102(4): 1-8)，只需要添加少量廉价的ΝΑ护便可实现辅酶高效循环。本发明生物 催化步骤的底物、产物关系可表示如下：
[004引
[0049]不同异丙醇浓度对底物转化效率的影响：
[(K)加]1ml憐酸钟缓冲液(pH 7.0，0.1M)中含有W下组分:幾基还原酶化KRED20纯酶3mg， 底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬0.05g(相当于底物浓度50g/l)，NAD+0.2mg，不同异丙醇 体积浓度。置于摇床上反应，37°C，200rpm，2h。异丙醇浓度10 %时，底物的转化率最高，将其 标准化为100%，其余异丙醇浓度时的相对转化率见表1。异丙醇浓度从5%~75%均能获得 良好转化率。
[0051]表1不同异丙醇浓度的转化率
[0化2]
[0053]~实施例3高浓度酬底物生物催化制备手性醇
[0化4] 10ml憐酸钟缓冲液(pH 7.0，0.1M)中含有W下组分:幾基还原酶化KRED20粗酶粉 9〇111旨，底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬1.5旨(相当于底物浓度150旨/1)，麻扩2111旨，异丙醇 1ml。置于摇床上反应，40 °C，150巧m。20h反应结束，转化率99.6 %，ee值>99 %。
[0055]实施例4" 一锅两步法"反应制备光学纯环氧化合物 [0化6] (1)生物催化过程：
[0化7] 10ml憐酸钟缓冲液(pH 7.0,0.1M)中含有W下组分:幾基还原酶化KRED20粗酶粉 8〇111邑，底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬1旨(相当于底物浓度100旨/1)，异丙醇11111(10%体积 浓度），NA护2mg。置于摇床上反应，35 °C，20化pm，1化。
[0058] 反应结束后，取50化1样品，加入等体积乙酸乙醋萃取，有机相W气相色谱测定其 转化率和产物ee值:底物转化率>99%，ee值(对映体过量值)〉99%。
[0059] 气相色谱测定条件:福立化li GC9790气相色谱仪，氨离子火焰FID检测器，手性柱 CP-CMraSil-DEX CB colu皿（Varian，USA)，进样口溫度260°C，检测器280°C。测定转化率 时柱溫150°C，测定产物ee值时柱溫90°C。
[0060] (2)环氧化：
[0061 ]上述（1)体系中均匀揽拌、缓慢加入化0扣容液（10 %质量浓度）10ml，置于摇床反 应，35°C，200rpm，1.5h。
[0062] 运个环氧化过程加入K0H溶液，也同样能得到本发明的效果。
[0063] 反应结束后，每次加入甲基叔下基酸20ml，萃取3次，合并有机相，无水硫酸钢干 燥，减压旋蒸，得到淡黄色液体，即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯化，得到(2S)-2-(3,4-二 氣苯基)环氧乙烧。
[0064] 该步骤产物测定:气相色谱测定，福立化1 i GC9790气相色谱仪，氨离子火焰FID检 测器，手性柱CP-ChiraSi 1-DEX CB column(Varian，USA)，进样 口溫度260°C，检测器280°C， 柱溫110°C。
[0065] 经测定，上述（1)步骤得到的中间产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙醇已经完全 转化(>99%)成最终产物（2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧，（2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧 乙烧的ee值>99 %。
[0066] 实施例5制备级反应
[0067] 100ml憐酸钟缓冲液(pH 7.0,0.1M)中含有如下组分:幾基还原酶化KRED20粗酶粉 1.8g，底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬15g(相当于底物浓度150g/l)，异丙醇15ml(15%体 积浓度），NA护40mg。置于摇床上反应，38 °C，200巧m，2地。
[006引之后揽拌并缓慢加入化0扣容液（15%质量浓度）501111，置于摇床反应，40°(：， 200巧m,化。
[0069]反应结束后，每次加入甲基叔下基酸100ml，萃取3次，合并有机相，无水硫酸钢干 燥，减压旋蒸，得到淡黄色液体，即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯化，得到(2S)-2-(3,4-二 氣苯基)环氧乙烧l〇.95g，产物的收率为89%，纯度>99%，ee值>99%。
【主权项】
1. 一种制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 生物催化反应，以羰基还原酶作为生物催化剂，2-氯-1-(3,4-二氟苯基）乙酮为底 物，经不对称幾基还原生成(S) _2_氯_1_( 3，4-二氣苯基）乙醇。 (2) 环氧化，在上述反应体系中加入强碱，使生物催化获得的产物(S)-2-氯-1-(3,4-二 氟苯基）乙醇再进一步环氧化，生成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶为ChKRED20，其在NCBI数 据库中的登录号为KC342020。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物催化的反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰 基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-( 3，4-二氟苯基）乙酮、还原型辅酶NADH或者NADPH;或者， 反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-( 3，4-二氟苯基）乙酮、氧化 型辅酶NAD+、异丙醇。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强碱为NaOH或者KOH。5. 根据权利要求3所述的生物催化体系，其特征在于，所述磷酸钾缓冲液pH范围为pH 6.0~8.0，浓度为0.05~0.5M;所述羰基还原酶ChKRED20的浓度为0.1~20g/l;所述底物2-氯-卜(3，4_二氟苯基）乙酮浓度为0.1~300g/l;所述还原型辅酶NADH或者NADPH的摩尔浓 度大于等于反应体系中底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基）乙酮的摩尔浓度;所述氧化型辅酶NAD +的浓度为〇. 1~〇.5g/l;所述异丙醇体积占总反应体系体积的百分比为5%~75%。
【专利摘要】本发明涉及一种生物催化和化学反应结合的“一锅两步法”制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法。该方法首先利用羰基还原酶ChKRED20不对称还原2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮得到(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇；再在该反应体系中加入强碱性物质，使(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇脱氯后环氧化，得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷，ee值>99％。本工艺反应条件简单、温和、高效、专一性强，无副产物，获得的产物浓度高且易于提取分离，具有良好的工业应用前景。CCTCC NO:M201248420121127
【IPC分类】C12P17/02
【公开号】CN105671099
【申请号】CN201610051136
【发明人】吴中柳, 刘艳
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月26日