一种促进产油微藻细胞和油脂快速积累的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种促进产油微藻细胞和油脂快速积累的培养方法，属于生物能源领域。
【背景技术】
[0002]生物柴油以生物体油脂为原料，通过分解、酯化得到的长链脂肪酸甲酯，是一种可以替代化石燃料使用的环保、可再生能源。生物柴油的原料来自植物油脂(大豆油、玉米油等)、动物油脂(各种动物脂肪)、微藻油脂以及废弃食用油(地沟油)等。
[0003]目前，微藻作为生物柴油原料已在国际上得到广泛应用。与其它油脂原料相比，微藻具有细胞生长快，油脂含量高，不占用耕地等优点。微藻的培养方式主要有自养、异养和兼养三种培养方式。目前，微藻的产业化生产主要采用自养培养方式。自养培养细胞培养周期长，细胞产量低，从而导致油脂产量低和成本较高。兼养培养需要在灭菌的光生物反应器中进行藻细胞的培养，需要同时保证无菌培养和充足的光照条件，对培养设备的要求极高，且设备的放大较难。异养培养藻细胞生长较快，但油脂含量低，通常难以利用。因此，需要一种切实可行的培养方法来解决以上的问题。本发明利用二次培养的方法解决了微藻大规模培养生物量和油脂不能同时达到最大的问题。第一阶段以添加黄腐酸的培养基进行异养培养，能大量积累藻细胞，克服了自养培养细胞生长周期长，生物量低等困难;第二阶段以异养培养藻细胞作为种子液，在自养培养的条件下，米用氮、磷缺陷、高盐和植物诱导物诱导等环境压力来诱导藻细胞内油脂的积累。本发明采用添加植物诱导物的黄腐酸培养基进行光照培养，解决了藻细胞油脂产率低的问题。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种促进产油微藻细胞和油脂快速积累的培养方法，可以有效解决【背景技术】中的问题。
[0005 ]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
[0006]本发明提供一种促进产油微藻细胞和油脂快速积累的培养方法，包括以下步骤:
[0007]步骤1、制备基于黄腐酸的异养和自养培养基，具体为:异养培养阶段，选择kuhl培养基作为单针藻的基本培养基，分装300ml进入500ml的三角瓶中，按1g L—1的量加入葡萄糖作为碳源，调整pH值为6.8?7.1，加入80mg L—1的黄腐酸，自养培养阶段，选择kuhl培养基作为单针藻的基本培养基，调整pH值为7.0，在500ml的三角瓶中装入200ml的培养基，加入0、5、25、125、625mg L—1 的黄腐酸；
[0008]步骤2、接入产油单针藻进行异养-自养培养，具体为:高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，异养培养阶段，藻细胞密度控制在106个ml—1;自养培养阶段，接种量为2.3g L—S后进行摇瓶培养，光照强度为35001ux，培养温度为25°C，摇床转速为150r min—S
[0009]步骤3、制备生物柴油，将终培养液离心富集，转速为9000r min—1，时间为6min。湿细胞在_70°C下冷冻过夜，后进行抽真空冷冻干燥。添加干藻粉样品2倍质量的石英砂研磨20min后用氯仿-甲醇(2:1，v/v)进行油脂提取，有机溶剂重复提取3次后收集有机相浓缩称重。上述提取油脂加2mL 3%硫酸-甲醇进行甲酯化制备得到生物柴油。
[0010]本发明所达到的有益效果是:
[0011]1、本发明将黄腐酸与异养培养和自养培养有机的结合起来，不仅充分发挥了异养培养藻细胞快速生长的优势和自养培养阶段油脂快速积累的特点，而且巧妙的利用了黄腐酸能刺激藻细胞和油脂积累的特性。
[0012]2、本发明操作简单、成本低廉，只需要添加很少的黄腐酸就能极大地促进微藻的生长和油脂的积累，有利于微藻的大规模生产。
[0013]3、本发明异养阶段在黄腐酸的诱导下能大量的积累细胞量，与对照相比其细胞产率增加了52.18%;自养阶段黄腐酸能大幅度提高细胞的油脂含量，当黄腐酸的浓度为25mgL—1时，在诱导第六天时油脂含量可以提高到54%。该油脂含量与自养培养时的油脂含量相差不大，但其培养时间缩短了2/3。由此可见，利用黄腐酸两阶段诱导细胞生长和油脂的积累是一种有效可行的方法。该培养方法为解决工业生产过程中细胞和油脂含量不能同时达到最大提供了一种有效解决方法。
[0014]4、与传统的自养培养相比，本发明方法能缩短藻种的培养时间，培养面积小且单位培养面积的产率高。自养培养阶段藻种的接种量在2_5g L—I较大的接种量越不容易受到细菌、原生动物等生物的污染，因此，该方法能降低微藻自养培养过程中杂菌污染的概率。
[0015]5、与自养培养相比，该培养方法细胞密度高因而其采收成本相对较低，从而提高了生产效率，降低了生产成本。
[0016]综上所述，本发明操作简单，成本低，细胞量和油脂产率相对较高，是一种快速提高微藻细胞量和油脂含量的培养方法。
【具体实施方式】
[0017]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0018]本发明提供一种产油微藻细胞和油脂快速积累的培养方法，包括以下步骤:
[0019]步骤I中制备基于黄腐酸的培养基具体为:异养培养阶段，选择kuhl培养基作为单针藻的基本培养基，分装300ml进入500ml的三角瓶中，按1g L—1的量加入葡萄糖作为碳源，调整pH值为6.8?7.1，加入80mg L—1的黄腐酸。自养培养阶段，选择kuhl培养基作为单针藻的基本培养基，调整pH值为7.0，在500ml的三角瓶中装入200ml的培养基，加入5、25、125、625mg L—1的黄腐酸。
[°02°]步骤2中接入产油单针藻进行异养-自养培养具体为:高压高温灭菌20min，接入产油单针藻，异养培养阶段，藻细胞的初始浓度控制在16个ml—1;自养培养阶段，接种量为
2.3g L—1，后进行摇瓶培养，光照强度为35001uX，培养温度为25°C，摇床转速为150r min—1。[0021 ]步骤3中制备生物柴油具体为:将终培养液离心富集，转速为9000r min—1，时间为6min。湿细胞在-70°C下冷冻过夜，后进行抽真空冷冻干燥。添加干藻粉样品2倍质量的石英砂研磨20min后用氯仿-甲醇(2:1，v/v)进行油脂提取，有机溶剂重复提取3次后收集有机相浓缩称重。上述提取油脂加2mL 3%硫酸-甲醇进行甲酯化制备得到生物柴油。
[0022]实施例1
[0023]