一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物质能源领域，更具体涉及一种开放式培养池规模培养产油微 藻Graesiella sp.WBG-1 的培养方法。 技术背景
[0002] 微藻生物柴油被认为是有望解决未来交通运输燃油问题的可再生能源之一 (Chisti 2008,Trends in Biotechnology 26(3):126-131；ffijffels and Barbosa 2010, Science 329(5993): 796-799)。微藻培养是获取生物柴油原料的基本环节，产油微藻规模 培养技术的研发在微藻生物柴油产业化进程中具有极其重要的作用（Sheehan，Dunnahay et al.1998,A look back at the US Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae；Avagyan 2008 , Clean Technologies and Environmental Policy 10(4):313-317；Eriksen 2008,Biotechnology Letters 30(9): 1525-1536)。一般来说，微藻培养具有开放式及封闭式两类(Stephens,Ross et al.2010， Trends in Plant Science)，其中的开放式培养池培养技术被认为是利用太阳光能资源大 规模培养微藻生产生物柴油原料的主要方法之一(Sheehan，Dunnahay et al. 1998，A look back at the US Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae)，不但因为开放式培养池培养技术已在螺旋藻等藻类的规模生产上取得了成功，还 因为开放式培养池具有比封闭反应器更为低廉的造价、较低的运行费用和简单的操作方 法。
[0003] 然而，相比于螺旋藻、盐藻的开放式培养，利用开放系统培养产油微藻还面临一些 技术难题：
[0004] (1)缺乏生长快、生物质产量高、油脂含量高、适合开放池规模培养的产油微藻藻 种。
[0005] 尽管国内外文献资料中已报道的产油微藻很多(Gouveia and Oliveira 2009， Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 36(2):269~274；Griffiths and Harrison 2009,Journal of Applied Phycology 21(5):493-507；Liu,Chen et al.2011,Progress in Natural Science:Materials International 21(4):269-276)，但 真正适合于开放池规模培养的产油藻种却是寥寥无几(Sheehan,Dunnahay et al.1998,A look back at the US Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae ；Benvenuti ,B〇sma et al. 2015,Biotechnology for Biofuels 8:100)。适合 于开放池大规模培养的产油微藻不但需要生长快、油脂含量高，更需要微藻对光、温、pH等 环境条件的变化具有很强的适应能力（Gouveia and Oliveira 2009，Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 36(2):269-274;Griffiths and Harrison 2009,Journal of Applied Phycology 21(5):493-507)〇
[0006] (2)开放池培养产油微藻易发生生物污染。
[0007] 生物污染是微藻开放池培养的最大障碍之一。常见的污染生物大致有四类:浮游 动物、杂藻、溶藻细菌和病毒（Wang,Zhang et al.2013,Bioresource Technology 128: 745-750)。浮游动物(轮虫、纤毛虫等)污染主要是吞噬(摄食)藻细胞，细菌污染主要通过分 泌物抑制或分解藻细胞，而杂藻和病毒侵染机制较为复杂，主要包括营养竞争、化感作用、 分泌物抑制以及病毒致死等（Rego,Redondo et al.2015,Bioelectrochemistry 103:60-64)。对产油微藻危害最大的是浮游动物(轮虫、纤毛虫等）的摄食，导致藻细胞密度和生物 质产量大幅降低，甚至引起培养的崩溃（McBride, Lopez et al.2014, Industrial Biotechnology 10(3): 221-227)。截至目前，还没有行之有效的方法可以完全控制生物污 染（Wang,Zhang et al.2013,Bioresource Technology 128:745-750;Zhou , Li et al.2015,Applied Microbiology And Biotechnology 99(3):1531-1541)〇
[0008] (3)大规模培养产油微藻油脂含量低。
[0009] 很多产油微藻在实验室条件下油脂含量高达生物质干重的50%以上，甚至更高， 但将其培养规模扩大之后油脂含量大幅下降。Li et al(2013,Biotechnology and Bioengineering 110( 1):97-107)报道一株凯氏拟小球藻在实验室条件下油脂含量约为干 重的55.3%，但在室外250L反应器中培养时，油脂含量仅约为干重的25% ;即使是布朗葡萄 藻(一株公认的产油微藻，总脂含量可达干重的60%以上），在室外2000L培养池中培养时油 脂含量也仅为干重的 19% (Ashokkumar and Rengasamy 2012，Bioresource Technology 104(2012): 394-399)。由此看来，产油微藻大规模培养过程中的油脂积累特性及其生理调 控技术还需要更多更深入的研究。
[0010] ⑷微藻采收难度大，能耗高。
[0011]目前的微藻采收方法包括过滤、离心、气浮等（Brennan and Owende 2010， Renewable and Sustainable Energy Reviews 14(12):557_577)。根据目前的报道，产油 微藻多为单细胞藻类，过滤法并不适合产油微藻的采收，而离心、气浮采收方法虽然可以用 于产油微藻的采收，但其能耗成本在微藻生物柴油生产总成本中的比例过高（Schenk, Thomas-Hall et al.2008,Bioenergy Research 1(1):20-43；Brennan and Owende 2010, Renewable and Sustainable Energy Reviews 14(12) :557-577)，显著降低了微藻生物柴 油能量的产出/投入比例，甚至不能实现能量的净产出，严重阻碍了微藻生物柴油的产业 化。
[0012] 鉴于上述困难，产油微藻室外大规模培养且获得高油脂含量的成功案例未见报 道，也未形成一套成熟的大规模产油微藻培养工艺路线。目前公开的报道中，在室外培养产 油微藻，培养体积约在1000L~2000L的水平，最终达到的油脂含量也仅为干重的20 % (Rodolf?,Chini Zittelli et al·2009,Biotechnology and Bioengineering 102(1): 100-112；Ashokkumar and Rengasamy 2012,Bioresource Technology 104(2012):394-399;Li,Pribyl et al.2013,Biotechnology and Bioengineering 110(1):97_107)，与培 养初始的油脂含量相差无几，即大量培养过程中并没有显著的油脂的积累过程。因此，发展 微藻生物柴油，亟待建立适合于产油微藻规模培养的技术方法。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是在于提供了一种开放式培养池规模培养产油微藻Graesiella sp.WBG-1的培养方法，方法易行，培养方便，通过增加藻液静置沉降过程，使离心处理的水 量减少到原来的1/50以下，显著降低了采收环节的能耗;控制了藻液中生物质的密度，使单 位生物质获得更多的光能，实现了开放池大规模培养条件下油球藻Graesiella sp.WBG-1 细胞油脂的大量积累，总脂含量达到干重的30%以上。
[0014] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
[0015] 其技术构思是:针对上述产油微藻开放式规模培养面临的技术难题，申请人首先 通过大量的藻种资源采集、分离、室内外培养，筛选到一株生长快、油脂含量高、藻细胞个体 大、环境适应性强的产油微藻Graesiella sp.WBG-1，为大规模培养提供优质藻种。针对产 油微藻规模培养过程中易发生生物污染的问题，申请人首先利用液体过滤器(HFL-0820，10 Mi滤芯)对培养用水进行过滤(前处理），去除或减少培养用水中的生物污染源，尽量避免生 物污染源通过培养用水进入培养系统;其次，利用油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞大(8~ 12μπ〇、对原生动物摄食具有抵抗能力的特性，一定程度上减小了开放池培养中藻细胞被原 生动物吞食的风险;并且利用油球藻Graesiella sp.WBG-Ι耐受高pH环境的特性，在培养过 程中维持藻液高pH(9.0~10.0)，从而一定程度上减少了生物污染，尤其是原生动物污染的 发生。培养液高pH有助于抑制原生动物的生长，这一点在微藻大规模培养中已经多次证实 (Becher 1994;Liu and Lu 1990;Wang，Zhang et al.2013)。通过综合应用以上技术措施， 申请人解决了微藻开放池培养过程中原生动物污染的技术难题。
[0016] 申请人通过精细地调节和优化氮源浓度，控制藻液中生物质的密度，使单位生物 质获得更多的光能，实现了开放池大规模培养条件下油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞油 脂的大量积累，总脂含量达到干重的30%以上。
[0017]申请人利用油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞较大的特点，发明了自然沉降+离心 脱水的采收工艺，通过增加藻液静置沉降过程，使离心处理的水量减少到原来的1/50以下， 显著降低了采收环节的能耗。
[0018]通过上述