大规模生产果实细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大规模生产果实细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及大规模体外 生产果实细胞的方法，其包括初级和次生代谢物。
【背景技术】
[0002] 大规模方法为本领域已知且为工业化生产各种材料所必需。由于大规模方法不能 通过与小规模方法相同的方式进行，因此即使存在小规模生产方法，也必须设计大规模生 产材料的特定方法。
[0003] 营养保健品有时是使用合成方法制备的，提供希望的活性成分，如多酚，其是在果 实细胞中天然发现。然而，使用合成方法未与活性成分一起提供有时有助于配制物的效力 的天然成分。
[0004] 其它类型的营养保健品是从天然植物中制备的；然而，所有已知的从植物中制备 营养保健品的大规模生产方法包括从制备的植物细胞中提取，以获得希望的活性成分。然 而，当提取例如含有多酚的植物时，最终产物也许是苦味的。仅一部分植物可以被成功提 取，因为仅其含有希望量的活性成分。
[0005] 制备果实细胞的小规模方法为本领域已知；然而，大规模方法更难以设计，因为其 趋于扩大初级代谢物的生产，同时使次生代谢物的产生最小化。由于活性成分如多酚是次 生代谢物，因此其大规模生产是复杂的。
[0006] 已知源自含有多酚的果实的营养保健品的有益作用。红葡萄酒作为这些调节性 成分的来源的用途因为其较高的乙醇含量和糖分而受限。此外，已经显示葡萄酒和酿酒葡 萄的治疗性作用依赖于种类、位置、年份（年度气候）、加工等，及因此依赖红葡萄酒、葡萄 或葡萄种子作为这些调节性化合物的来源导致无法进行原材料的均一的或一致的供应。此 外，果实通常被残余的杀真菌剂、病原体、杀虫剂和污染物等污染。
[0007] 此外，来自红葡萄酒和果实提取物的多酚的胃肠道输送的潜在益处受限于其靶组 织和细胞的生物利用度。由于其通过肠道时的生物利用度的明显差异，在指定食物中某一 多酚的丰度与其作为体内活性化合物的浓度之间无相关性可描绘。例如小肠中类黄酮的吸 收范围为剂量的0-60%范围，消除半衰期为2-48小时。大多数多酚在肠道中经历广泛代 谢，主要以甲基葡糖苷酸或葡糖苷酸硫酸盐形式存在于血清和尿液中。在已知的多酚中， 在红葡萄、红葡萄酒及其它食物如不同种类的浆果和花生中发现的植物抗毒素白藜芦醇 (反式-3, 5, 4' -三羟基芪）（RES)已经引起众多关注。确信其是造成"法国悖论（French paradox) "的原因，这是与尽管高脂饮食但心血管疾病的低发生率相关的一个现象，是适度 引用红葡萄酒的结果。然而，RES的物理化学性质如低水溶性及其高肝脏摄取有损于其生物 利用度。此外，由于快速和广泛代谢随之形成各种代谢物，RES的口服生物利用度非常低。
[0008] 关于RES活性和作用的研宄主要依赖于白藜芦醇的三个来源，即纯合成的RES，天 然植物来源的RES(例如Poligonumcupcidatum提取物）产物，或者较低程度的完整红葡 萄或其产物（红葡萄酒、葡萄汁、葡萄提取物）。红葡萄细胞（RGC;FruituraBioscience Ltd,Israel)是一种天然的专利保护的培养细胞配制物，源自葡萄（VitisviniferaL.)栽 培品种的果实，包含多酚的全部基质，包括白藜芦醇及天然存在于红葡萄中的其它成分。
[0009]RES结构中的芳香基团使其可以作为抗氧化剂及防止在疾病过程中的重要反应， 如在动脉粥样硬化中发生的LDL氧化。RES也显示调节慢性疾病如癌症和糖尿病的炎性应 答。动物研宄已经显示RES参与减弱疼痛以及急性炎症。
[0010] 因此，需要从天然材料制备果实细胞的大规模方法，包括产生果实细胞的初级及 次生代谢物。需要可以在大规模生产方法中制备的天然（植物）组合物，其中活性成分的 量是一致及复现的（例如克隆制品），是高生物利用度的，及易于施用以治疗和预防各种疾 病和失调。
【发明内容】
[0011] 在本发明的实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织 培养物的大规模方法，包括：将葡萄细胞在瓶中生长；将葡萄细胞从瓶接种到第一生物反 应器中；将葡萄细胞从第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中另一个生物反应 器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中第一生物反应器和另一生物反应器 至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；其中将从最后的生物反应 器中收获的葡萄细胞干燥。
[0012] 在本发明的一些实施方案中，用于所述方法中的每个生物反应器的大小大于葡萄 细胞先前在其中生长的生物反应器的大小。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器，则 进行将葡萄细胞接种于另一中间生物反应器或者接种于最后的生物反应器的额外步骤。
[0014] 在本发明的一些实施方案中，第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10、 10-50、50-200、200-1000 或 1000-5000 升生物反应器。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，葡萄细胞在Gamborg B5培养基中生长。
[0016] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有（enrichedwith)镁、磷 酸盐或硝酸盐或者其组合。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有KN03、MgS04、MgN03或 NaH2P04或其组合。
[0018] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成的。
[0019] 在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼 龙层制成的。
[0020] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基不包含植物激素。
[0021] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基包含植物激素。
[0022] 在本发明的一些实施方案中，GamborgB5培养基补充有2-4%的蔗糖。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，提供粉末形式的组合物，其包含在大规模生产方法 中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无 种子栽培种的葡萄胚或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜 芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。
【附图说明】
[0024] 本发明附图（仅作为示例）加以描述。具体关于附图的详细描述，需要强调的是 图中显示的事项只是为了举例及论述本发明优选的实施方案，及是为了提供确信最有效和 易于理解的本发明的原理描述和观点而呈现。在这方面，未尝试显示比基本理解本发明必 需的更详细的本发明的结构详情，结合附图的描述使得本领域技术人员了解可以实施的本 发明的一些形式。
[0025] 图1证实在角叉菜胶注射之前用RGC制备物、吲哚美辛和水（作为对照）处理的 大鼠中足水肿的测量（体积％ )，。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检 定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著 差异（p〈0. 001)。对照组与RGC-制备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异 (p<0. 001) 〇
[0026] 图2显示在研宄期间通过热板（HotPlate)测量的每组的痛觉过敏作用分布（结 果以与时间成函数的"热板延时，自基线％ "表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用 Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著 差异（P〈〇. 01)。
[0027] 图3显示通过热板测量的每组的痛觉过敏作用分布（结果以与时间成函数的"热 板延时8,基线-实际时间"表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用Bonferroni事后 检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显 著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC-处理的小鼠（3M)对比在4小时显示统计学显著差 异（p〈0. 01) 〇
[0028] 图4显示4个不同批次的在补充的GamborgB5培养基的大规模一次性生物反应 器中生长的红葡萄细胞的生长曲线。在20直至40天，细胞经历指数生长，产生500gr/l鲜 生物量。
[0029] 图5提供了白藜芦醇（RES)在水中的溶解性结果，比较RGC-RES、合成的RES和植 物RES的溶解性。
[0030] 图6A和6B显示在施用一剂RGCRES之后反式-RES的血浆含量，其中图9A显示 总反式-RES，图9B显示游离反式-RES。呈现的数值是平均数（n= 15)。
[0031] 发明详述
[0032] 在如下详细描述中，阐述了很多具体细节以充分理解本发明。然而，本领域技术人 员应理解本发明可以不用这些具体细节而实施。在其它情况中，未详细描述熟知的方法、程 序和成分免得使本发明模糊不清。
[0033] 本发明的实施方案涉及大规模体外生产果实细胞的方法。在本发明的一些实施 方案中，所述方法不包括果实细胞的提取。令人惊奇地，根据本文所述大规模方法产生的 果实细胞显示包含较高量的多酚，特别是次生代谢物白藜芦醇。本发明提供了独特的红葡 萄细胞（RGC)组合物，其是规模生产的结果，包括多酚的完全基质及红葡萄细胞中天然存 在的其它健康成分，与在新鲜葡萄中发现的浓度相比具有显著较高的葡萄白藜芦醇浓度 (40-800倍或更高）（见实验9和表9)。
[0034] 如本文所用，术语"多酚"是指天然存在的植物有机化合物，其具有一个以上的苯 酚基团。多酚可以是从简单分子如酚酸至大的高聚合的化合物如鞣酸。多酚的酚环通常与 各种糖分子、有机酸和/或脂质缀合。这种缀合的化学结构中的差异导致各种多酚化合物 的作用模式和健康性质中的化学分类和变化。举例的多酚包括但不限于花青素、生物类黄 酮（包括以下亚类：黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和二氢黄酮）、原花青素、氧杂蒽酮、酚酸、 芪类和木脂素。白藜芦醇（3, 4, 5-三羟基芪）是一种类型的多酚，是以其单体形式、反式白 藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式-葡糖苷和顺式-葡糖苷呈现的多酚芪。
[0035] 根据本发明的一个实施方案，果实是葡萄。葡萄可以是有色葡萄（例如红色、黑 色、紫色、蓝色及之间所有颜色变化）。或者，葡萄可以是无色葡萄（例如绿色或白色或者之 间的任何颜色）。
[0036] 本发明这个方面的果实可以是野生或栽培变种。举例的栽培种葡萄包括属于 葡萄属的那些葡萄。举例的葡萄属变种包括但不限于欧洲葡萄（Vitis vinifera，V. vinifera)、森林葡萄（V. silvestris)、V. muscadinia、圆叶葡萄（V. rotundifolia)、河 岸葡萄（V. riparia)、夏特沃氏葡萄（V. shuttleworthii)、V. lubrisca、V. daviddi、山葡 萄（V. amurensis)、V. romanelli、夏葡萄（V. aestivalis)、辛西安那葡萄（V. Cynthiana)、 V. cineria、V. palmate、V. munsoniana、霜葡萄（V. cordifolia)、Hybrid A23-7-71、 V. acerifolia、V. treleasei和桦叶葡萄（V. betulifolia)。
[0037] 根据一些实施方案，果实细胞源自有色或无色葡萄。如本文所述，根据一些实施方 案，果实细胞是从果实细胞培养物制备的。根据本发明的一些实施方案，果实细胞是从葡萄 浆果细胞培养物制备的。根据一些实施方案，葡萄浆果细胞的培养物源自一或多个葡萄浆 果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚或者葡萄 种皮。根据另一个实施方案，果实细胞培养物可以源自植物的任何部分，包括但不限于胚 乳、糊粉层、胚（或者其作为盾片和子叶的部分）、果皮、茎、叶、块茎、表皮毛（trichomes)和 根。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，尽管物质包括多酚的量在果实中可以变化，但是使 用制备果实细胞培养物的培养方案确保制备物及其含量的再现性。因此，从相同培养物制 备的不同批次的果实细胞具有典型的HPLC指纹。根据一些实施方案，每个批次中不同物质 的浓度可以变化，但是如上所述如果从相同的培养物制备，则所有批次的HPLC指纹是一致 的。
[0039] 在本发明的一些实施方案中，提供了粉末形式的组合物，其包含所述大规模方法 中的体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物源自一或多个葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或 无种子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄种皮；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含 的白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。在本发明的一些实施方案中，根据本发明所述大 规模方法的实施方案生产的葡萄细胞中至少90%的白藜芦醇是反式-葡糖苷白藜芦醇。
[0040] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中不同多酚的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。这在实施例3、表9中清晰可见，其中将在根据本发明的实施方案大规模 生产的干燥的葡萄细胞培养物中总的白藜芦醇与葡萄中白藜芦醇的量比较。根据一些实施 方案，某些多酚的量在所制备的果实细胞与其在农业葡萄果实中的量相比增加。根据一些 实施方案，白藜芦醇的量在果实细胞中增加