大规模生产果实细胞以及用此类细胞治疗疾病的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大规模生产果实细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及大规模体外 生产果实细胞的方法，其包括初级和次生代谢物。本发明进一步涉及通过施用果实细胞的 细胞系愈伤组织培养物治疗、预防、缓解或减轻与代谢综合征或代谢疾病相关联的一或多 种病症或并发症的方法。
【背景技术】
[0002] 大规模方法为本领域已知且为工业化生产各种材料所必需。由于大规模方法不能 通过与小规模方法相同的方式进行，因此即使存在小规模生产方法，也必须设计大规模生 产材料的特定方法。
[0003] 营养保健品有时是使用合成方法制备的，提供希望的活性成分，如多酚，其是在果 实细胞中天然发现。然而，使用合成方法未与活性成分一起提供有时有助于配制物的效力 的天然成分。
[0004] 其它类型的营养保健品是从天然植物中制备的；然而，所有已知的从植物中制备 营养保健品的大规模生产方法包括从制备的植物细胞中提取，以获得希望的活性成分。然 而，当提取例如含有多酚的植物时，在提取物中，多酚（包括白藜芦醇）的量可能非常高，因 此，最终产物也许是苦味的。仅一部分植物可以被成功提取，因为仅其含有希望量的活性成 分。
[0005] 制备果实细胞的小规模方法为本领域已知；然而，大规模方法更难以设计，因为其 趋于扩大初级代谢物的生产，同时使次生代谢物的产生最小化。由于活性成分如多酚是次 生代谢物，因此其大规模生产是复杂的。
[0006]因此，本领域需要从天然物料制备果实细胞的大规模方法，其包括生产果实细胞 的初级代谢产物和次生代谢产物。
[0007] 代谢异常与肥胖症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量下降、II型糖尿病（DMII)、血脂异 常、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性变相关。这些异常使中风、心血管疾病的风险上升。代谢综 合征的病因学被认为是多因素的，涉及遗传学影响和环境影响。
[0008] 动脉粥样硬化是血管床疾病，是由血管壁中形成脂肪沉积物使得血管内血流通道 狭窄引起的。这一过程可能影响所有的动脉，尤其是冠状动脉，并且可能导致最终的冠状动 脉堵塞，结果是心脏病发作，其是美国早逝的主要原因。
[0009] 脂肪肝疾病涵盖一系列的临床病症，其组织学特征主要在于肝的大泡性脂肪变 性。脂肪肝疾病的组织病理学谱的范围是从简单的脂肪肝（脂肪变性）到脂肪性肝炎一一 脂肪肝的一种，其具有不同程度的纤维化。脂肪性肝炎可以是渐进性的，并且可以导致肝硬 化、肝衰竭以及肝细胞性肝癌，并且可能是隐源性肝硬化的主要原因。脂肪肝疾病的通常的 风险因素是肥胖症、II型糖尿病和高脂血症。
[0010] II型糖尿病是最普通的慢性人疾病，在美国影响成年人群的8%以及65岁以上年 龄的人口的19%。
[0011] 代谢综合征也称为"死亡四重奏"或"综合征X"或"胰岛素抗性综合征"，是一系列 各种疾病的风险因素，所述疾病例如心血管疾病、中风和II型糖尿病（即胰岛素抗性）、高 胰岛素血症、腹部肥胖症（由腹部内脂肪积聚引起）、升高的血清脂质以及高血压。25%在 美国生活的成年人被诊断为患有代谢综合征。有人认为代谢综合征的病理生理学与胰岛素 抗性相关。风险因素包括如下：升高的腰围（男性彡l〇2cm，女性彡88cm)、升高的甘油三酯 (>150mg/dL)、降低的高密度脂蛋白（HDL)胆固醇（男性<40mg/dL，女性<50mg/dL)、升高的 血压（>130/85mm Hg)以及升高的空腹血糖（>100mg/dL)。其它风险因素也可能促成代谢综 合征。另外，在不同人群中所述风险因素可能改变。
[0012] 空腹血糖异常（IFG)是与胰岛素抗性相关联的血糖代谢障碍的糖尿病前状态，定 义为空腹血糖水平101_126mg/dL。
[0013] 糖耐量异常（IGT)是与胰岛素抗性相关联的血糖代谢障碍的糖尿病前状态，其定 义与IFG的定义相似，或者定义为口服高葡萄糖饮食，通常是75克葡萄糖，之后两小时血糖 水平 141-199mg/dL。
[0014] 许多代谢疾病的特征在于甘油三酯积聚和胰岛素抗性。
[0015] 各种身体组织如肌肉、肝和胰腺组织中的甘油三酯积聚被认为是导致代谢疾病 产生的器官特异性胰岛素抗性的重要因素。此外，组织中脂滴（其与术语脂肪粒（lipid body)相同）的积聚在胰岛素抗性的产生中早期出现，并且与其严重性相关。
[0016] 持续性高血压是一些疾病和失调的风险因素之一。高血压是缺血性中风，西方世 界的第三大致死原因的单一最重要的可修正的风险因素。在血压（BP)读数高于120/80毫 米萊柱（mm Hg)，中风的风险开始增加。多数对高血压的判断表明，当高血压定义为收缩血 压（SBP)彡160mm Hg和/或舒张血压（DBP)彡95mm Hg时，中风的相对风险为大约4〇
[0017] 基于社区的研究证明在多达50-60 %的患者中高血压促成心脏衰竭的产生。 在高血压患者中，心脏衰竭的风险上升，男性上升2倍，女性上升3倍。根据弗雷明汉 (Framingham)研究，高血压占心脏衰竭案例的约四分之一。
[0018] 高血压不仅是确定的心血管风险因素，还增加动脉粥样硬化的风险。临床试验显 示，在DBP最高的五分之一中，即使具有额外的高胆固醇和吸烟的风险，高血压仍然显著促 成动脉粥样硬化的风险。
[0019] 据报道，在85%-95%的患有慢性肾病（CKD)的患者中出现高血压。未控制的高 血压是产生CKD的风险因素，并且是美国末期肾脏疾病的第二主要原因。
[0020] 过去，多数注意力关注于DBP ;但是现在认识到高SBP和高脉压差（SBP和DBP之 间的数值差异）也是风险因素。重要的是，有人证明了，将SBP和DBP组合评估相较于评估 2个单独因素改进了心血管风险预测。尽管如此，DBP仍然是重要的心血管风险因素。在 Franklin等的研究中，单独的舒张高血压是心血管风险因素。患有单独的舒张高血压的对 象占高血压人群的14%，且发现其心血管风险是具有正常BP的对象的约两倍（Schillaci 等，2009)。此外，中国全国范围的数据库确定了，单独的舒张高血压是心血管疾病的独立的 风险因素。
[0021] 脂质过氧化是指细胞损害中的过程中的脂质氧化变质。脂质过氧化可能是一种若 干风险因素可以通过其促进心血管疾病的机制。
[0022] 发现脂质过氧化与心血管风险因素，如年龄、甘油三酯、吸烟、胆固醇高密度脂蛋 白（HDL)和体重指数（BMI)，高度相关。
[0023] 怀孕、卵巢切除和绝经后的女性显示比未怀孕、卵巢未切除和绝经前的女性更高 的脂质过氧化水平，并且这些状态过程中的高脂质过氧化水平是其上升的CVD风险的原 因，至少是部分原因。
[0024] 从患有原发性高血压的患者费力的低密度脂蛋白（LDL)显示上升的氧化倾向。因 此，氧化的LDL (Ox-LDL)可能倾向于加速的动脉粥样硬化，并且脂质过氧化的LDL的倾向可 能是与LDL血浆浓度本身同样重要的动脉粥样硬化的风险因素。
[0025] 流量介导的扩张（FMD)，内皮功能紊乱的表现，可以作为若干疾病的指标。FMD对 于冠状动脉疾病有高度预测性，FMD每下降百分之一的优势比为1. 32 (p = 0. 001)。不仅在 动脉粥样硬化中，FMD还在系统性硬化中与疾病进展高度相关。FMD值与疾病持续时间负相 关。
[0026] 在绝经后的女性中，低FMD值与产生高血压的想到风险的升高相关。
[0027] FMD与缺血性晚期慢性心脏衰竭（ACHF)患者中升高的死亡风险相关（Shechter 等，2009)。此外，无论对心脏衰竭（HF)和动脉粥样硬化风险因素的治疗情况如何，持续性 低FMD均是慢性缺血性HF患者中的心脏事件的预测指标。
[0028] 中风患者具有比非中风患者显著更低的流量介导的扩张（FMD)值。经调整年龄、 性别和存在卵圆孔未闭（PF0)之后，FDM是隐源性中风的独立的预测指标。
[0029] 最后，在患有杂合的家族性高胆固醇血症（heFH)的儿童中，所述儿童易感于提早 的动脉粥样硬化，在结构性动脉粥样硬化性变化出现之前检测到降低的FMD。
[0030] 已知源自含有多酚的果实的营养保健品的有益作用。红葡萄酒作为这些调节性 成分的来源的用途因为其较高的乙醇含量和糖分而受限。此外，已经显示葡萄酒和酿酒葡 萄的治疗性作用依赖于种类、位置、年份（年度气候）、加工等，及因此依赖红葡萄酒、葡萄 或葡萄种子作为这些调节性化合物的来源导致无法进行原材料的均一的或一致的供应。此 外，果实通常被残余的杀真菌剂、病原体、杀虫剂和污染物等污染。
[0031] 此外，来自红葡萄酒和果实提取物的多酚的胃肠道输送的潜在益处受限于其靶组 织和细胞的生物利用度。由于其通过肠道时的生物利用度的明显差异，在指定食物中某一 多酚的丰度与其作为体内活性化合物的浓度之间无相关性可描绘。例如小肠中类黄酮的吸 收范围为剂量的0-60%范围，消除半衰期为2-48小时。大多数多酚在肠道中经历广泛代 谢，主要以甲基葡糖苷酸或葡糖苷酸硫酸盐形式存在于血清和尿液中。在已知的多酚中， 在红葡萄、红葡萄酒及其它食物如不同种类的浆果和花生中发现的植物抗毒素白藜芦醇 (反式-3, 5, 4'-三羟基芪）（RES)已经引起众多关注。确信其是造成"法国悖论（French paradox) "的原因，这是与尽管高脂饮食但心血管疾病的低发生率相关的一个现象，是适度 引用红葡萄酒的结果。然而，RES的物理化学性质如低水溶性及其高肝脏摄取有损于其生物 利用度。此外，由于快速和广泛代谢随之形成各种代谢物，RES的口服生物利用度非常低。
[0032] 关于RES活性和作用的研究主要依赖于白藜芦醇的三个来源，即纯合成的RES，天 然植物来源的RES (例如Poligonum cupcidatum提取物）产物，或者较低程度的完整红葡 萄或其产物（红葡萄酒、葡萄汁、葡萄提取物）。红葡萄细胞（RGC;Fruitura Bioscience Ltd, Israel)是一种天然的专利保护的培养细胞配制物，源自葡萄（Vitis vinifera L.)栽 培品种的果实，包含多酚的全部基质，包括白藜芦醇及天然存在于红葡萄中的其它成分。
[0033]因此，需要可以在大规模生产方法中制备的天然（植物）组合物，其中活性成分的 量是一致及复现的（例如克隆制品），是高生物利用度的，及易于施用以治疗各种疾病和失 调，包括与代谢失调或代谢疾病相关的病症或并发症。
【发明内容】
[0034] 在本发明的实施方案中，提供了治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的 方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物。
[0035] 根据一些实施方案，本发明提供用于治疗对象中的选自如下的一或多种病症的方 法：冠心病（动脉粥样硬化）、血压、缺血性疾病、心脏衰竭、动脉粥样硬化、慢性肾病（CKD) 和肾脏疾病、系统性硬化、慢性心脏衰竭、高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪 变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三 酯血症、抗炎症（脂联素）、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症，所述方法包括给所 述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物的步骤。在一些实 施方案中，所述对象被诊断为患有代谢综合征。
[0036] 根据一些实施方案，果实细胞的细胞系愈伤组织培养物根据大规模方法制备，所 述方法包括：将果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从瓶接种到第一生物反应器中；将果实 细胞从第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中另一个生物反应器是最后的生物 反应器或者是中间生物反应器，及其中第一生物反应器和另一生物反应器至少一个是一次 性的；及从最后的生物反应器中收获果实细胞；其中将从最后的生物反应器中收获的果实 细胞干燥。
[0037] 根据一些实施方案，使用补充有（enrichedwith)镁、磷酸盐或硝酸盐或者其组合 的GamborgB5培养基。
[0038] 在一些实施方案中，一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成的。在一些实施 方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成的。
[0039] 在一些实施方案中，提供用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方 法，所述方法包括施用包含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是 根据包括如下步骤的方法制备的：使果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从所述瓶接种到第 一生物反应器中；将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所 述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应 器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器收获果实细胞；其 中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。
[0040] 在一些实施方案中，提供用于治疗、减轻、缓解或预防炎症的方法，所述方法包括 施用包含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤 的方法制备的：使果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器 是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反 应器的至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器收获果实细胞；其中使从最后的生物 反应器收获的果实细胞干燥。
[0041] 在一些实施方案中，所述组合物可以每天施用一次。
[0042] 在一些实施方案中，提供粉末形式的组合物，其包含在大规模生产方法中体外生 长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物 源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培种的葡萄 胚或者葡萄种皮中的一或多种；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇 的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。
[0043] 在一些实施方案中，所述组合物的特征在于在施用一次所述组合物后血浆中白藜 芦醇的浓度的两个峰。
[0044] 在一些实施方案中，提供降低在静止状态和/或在运动中的舒张血压和收缩血压 和/或静息心率的方法，包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织 培养物的组合物的步骤。
【附图说明】
[0045]本发明附图（仅作为示例）加以描述。具体关于附图的详细描述，需要强调的是 图中显示的事项只是为了举例及论述本发明优选的实施方案，及是为了提供确信最有效和 易于理解的本发明的原理描述和观点而呈现。在这方面，未尝试显示比基本理解本发明必 需的更详细的本发明的结构详情，结合附图的描述使得本领域技术人员了解可以实施的本 发明的一些形式。
[0046] 图1证实在角叉菜胶注射之前用RGC制备物、吲哚美辛和水（作为对照）处理的 大鼠中足水肿的测量（体积％ )，。使用重复测量的双向AN0VA，然后用Bonferroni事后检 定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著 差异（p〈0. 001)。对照组与RGC-制备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异 (p<0. 001) 〇
[0047] 图2显示在研究期间通过热板（Hot Plate)测量的每组的痛觉过敏作用分布（结 果以与时间成函数的"热板延时，自基线％ "表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用 Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小 时显示统计学显著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著 差异（P〈〇. 01)。
[0048] 图3显示通过热板测量的每组的痛觉过敏作用分布（结果以与时间成函数的"热 板延时s，基线-实际时间"表示）。使用重复测量的双向AN0VA，然后用Bonferroni事后 检定进行统计学分析。对照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显 著差异（P〈〇. 05-0. 01)。对照组与RGC-处理的小鼠（3M)对比在4小时显示统计学显著差 异（p〈0. 01) 〇
[0049] 图4显示4个不同批次的在补充的Gamborg B5培养基的大规模一次性生物反应 器中生长的红葡萄细胞的生长曲线。在20直至40天，细胞经历指数生长，产生500gr/l鲜 生物量。这些细胞继续生长并且可以达到更高的生物量。
[0050] 图5显示高果糖饮食饲喂的大鼠中的收缩血压（BP)vs时间，补充或不补充不同量 的红葡萄细胞（RGC)，在基线以及饮食3周后和5周后。
[0051] 图6A是关于RGC中的白藜芦醇的LC-MS分析的UV色谱图（人=306nm)且图6B 是关于RGC中的白藜芦醇的LC-MS分析的提取离子色谱图（m/z-227. 0701-227. 0737)。
[0052] 图7显示阴性的代表性的反式-RES配糖体的ESI质谱（RT 4. 64min，m/ z389. 1250)，其中白藜芦醇（m/z 227. 0719)是m/z 389. 1250的源内片段化产物离子。
[0053] 图8提供了白藜芦醇（RES)在水中的溶解性结果，比较RGC-RES、合成的RES和植 物RES的溶解性。
[0054] 图9A和9B显示在施用一剂RGC RES之后反式-RES的血浆含量，其中图9A显示 总反式-RES，图9B显示游离反式-RES。呈现的数值是平均数（n = 15)。
[0055] 图10显示在食用RGC之后12周RGC对对象中血浆脂质过氧化的作用（一起显示 施用了 200mg和400mg RGC的对象）。
[0056] 图11显示FMD值相对阳性的变化70%的对象的百分比（*p〈0. 05, #p〈0. 005)。
[0057] 发明详述
[0058] 在如下详细描述中，阐述了很多具体细节以充分理解本发明。然而，本领域技术人 员应理解本发明可以不用这些具体细节而实施。在其它情况中，未详细描述熟知的方法、程 序和成分免得使本发明模糊不清。
[0059] 本发明的实施方案涉及治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或与代谢综合征相关 的任何病症或并发症的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组 织培养物的组合物，所述病症或并发症例如高血压、糖尿病（diabetes)、高脂血症、糖耐量 异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病（Diabetes Mellitus)、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症。 在本发明的一些实施方案中，所述细胞在如下所描述的大规模方法中生长。
[0060] 如本文所用，短语"果实细胞培养物"是指在大规模方法中体外生长的果实细胞的 细胞系愈伤组织培养物。所述果实细胞培养物可以是单一细胞培养物（如本文所用，果实 细胞系培养物或克隆培养物）或包含来源于具有不同基因型的果实（例如，不同品种）的 细胞或来源于单一果实的若干细胞类型或组织的异源细胞培养物。本发明的细胞培养物可 以源自果实的任何部分，例如，果皮、果肉、种皮和种仁（seed flesh)。
[0061] 如本文所用，术语"治疗（treating) "是指预防一些或全部与疾病、病症或失调相 关的症状。术语"治疗"也指缓解、改善或减轻症状或疾病的潜在原因，延长患有疾病的患 者的预期寿命，预防疾病以及完全从疾病复原。
[0062] 词语"治疗（treat) "或"治疗（treatment) "可以进一步指目的在于减缓（减轻） 不想要的生理学变化或失调的治疗。为了本发明的目的，有益的或想要的临床结果包括但 不限于缓和症状、减小疾病程度、稳定的（即不变坏）疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善 或减轻疾病状态以及缓解（部分或全部），无论可检测或不可检测。"治疗（treating)"还 可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。
[0063] 词语"预防（prevent) "和"预防（prevention) "涉及用于保护或防止没有给定病 症的个体进展到该病症的预防药或预防性手段。需要预防的个体包括易发或易感病症的那 些个体。
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