专利名称：预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽，特别涉及一种可作为抗细胞增生失调疾病的预防与治疗药物的多肽。
背景技术：
现有的防癌或抗癌相关技术，是以预防性诊断技术或打疫苗为主，对于此类疾病的预防性医疗策略可分为(A)内源性致癌诊断这部份包括年龄、遗传、种族及性别等，其可供预防控制的因子较少，可用下列的技术来实施(i)癌症基因筛检对具有家族遗传因素或高危人群，依其相关基因变异如BRCA-I和BRCA-2基因等作癌症基因筛检；(ii)癌症预防性切除手术依据癌症基因筛检结果及参考其家族中罹癌的比率，在可能的病患部位作手术切除。(B)外源性致癌诊断(i)化学性毒物预防诊断化学性毒物，如香烟的多环 烃化合物、食品的黄曲毒素、食品附加剂的着色剂、调味剂及防腐剂，环境因子，如有机化学废料、焦油、芳香族美容剂染料、农药类、杀虫剂、生殖荷尔蒙、砷及水银等。预防诊断层级可依癌症发生时程介入时间的差异分为一级化学预防(primary chemo-prevention),即预防癌症初生成，及二级化学预防(secondary chemo-prevention),即针对已摧癌但经适当治疗，病情得已控制者。这些诊断后所使用的治疗药物如Vit A retinyl palmitate及ADT (5-[p-Methoxyphenyl]_l, 2-dithiole-3_thione)用于肺癌、维生素 A 酸用于头颈癌、抗动情激素药物Tamoxifen用于乳癌及Sulindac用于大肠癌等；(ii)物理性预防诊断评估长期性曝露在有放射线及紫外线照射的环境。(C)生物性致癌因子预防诊断病毒及生物性毒素(如黄曲毒素)和某些肿瘤的发生有直接相关性如肝癌与B型肝癌病毒、子宫颈癌与人类乳突病毒(HPV)，注意公共卫生安全及安全性生活等为防治诊断的重点。(D)癌症疫苗接种利用打疫苗的方式，使个体产生免疫力，阻断癌症发生如HPV疫苗(预防特定性别的HPV病毒感染)与B型肝炎疫苗(阻断B型肝炎一肝硬化一肝癌三部曲)。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种预防与治疗(chemo-prevention andchemo-therapy)细胞增生失调疾病的多肽。所谓抗细胞增生失调的药物预防，定义为使用天然、合成或生物化学合成方式所生产的药物，用以逆转(reverse)、抑制(suppress)或防治(prevent)癌变的进程(参见 Anne S. Tsao, MD ；Edward S. Kim, MD ；ffaun Ki Hong, MD ；CA Cancer J Clin 2004 ；54 :150-180)。为达上述目的，本发明采取了以下技术方案。一种预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，该多肽的氨基酸序列为NH2_Lys TrpLys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Ala GlyPro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-COOH，使用于预防与治疗可能发生细胞增生失调疾病的对象。进一步地，该多肽具有两个阿法螺旋以AGP三个氨基酸为转折区形成U字形三维空间结构，而显现出对细胞增生失调疾病防治与治疗的功效。进一步地，该多肽用于细胞增生失调的高危群体的早期罹病预防。进一步地，该多肽用于罹病经治疗后的防治复发。进一步地，该可能发生细胞增生失调疾病的对象为人体。进一步地，该多肽使用于人体的给药途径包含经皮下以及静脉给药。进一步地，该多肽使用于人体的给药频率为每周5次，而每次给药剂量为每公斤体重给予50毫克。进一步地，该细胞增生失调疾病包含癌症。
进一步地，该癌症包含肺癌。进一步地，该可能发生细胞增生失调疾病的对象为选自由肿瘤患者、生活于空气高度污染地区者、抽烟者以及吸二手烟者所组成的群组。由此可知，本发明提供一种预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，该多肽的氨基酸序列为NH2_Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys ValPhe Lys LysHe Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-COOH,且使用于予页防与治疗可能发生细胞增生失调疾病的对象。本发明所设计的多肽，包含Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys以及Ala Gly Pro的氨基酸序列，其序列结构可数学化地表示为AMl+AM2+AlaGly Pro+AM3 ;当中 AMl = AM2 = AM3 = Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys0 该多妝序列是以 AlaGly Pro三个氨基酸片段来衔接(AM1+AM2)及AM3 (注AM1，AM2及AM3可为不同的组成设计)。将AMI、AM2及AM3设置成全相同的目的(亲水性区三重复的结构模式)，是要形成一个可与癌细胞表面组成(大部分为硫酸肝素)键结的区段并能以EKKWKV的形式出现，以便与硫酸肝素能形成键结的模式XBBXBX吻合，此处B代表碱性的氨基酸，而X表示任意一种其他种氨基酸(参见 I. Capila and R. J. Linhardt,Heparin-protein interactions,Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2002 ；41 :391)。如此设计，可使本多肽药物不但具有与癌细胞表面较大的亲和力且总电荷数能提高至+12。该高正电荷数对带有负电荷的癌细胞膜表面，其结合能力就可大为增强。基本上，该多肽在水溶液中并无结构(即所谓的无规卷曲)，在其遇到如细胞膜的极性环境时，才会形成两个阿尔法螺旋形(a-helix)以AGP(即Ala GlyPro)为转折区的三维空间结构。这种U字形的结构，可让该多肽灵活地切入细胞膜且动态地与不同层次的细胞表面作用，而迅速瓦解细胞。此外，该多肽对于增生失调细胞具有高度选择性，其水解癌细胞的能力大于正常细胞；此外，本发明所要求的抗细胞增生失调的作用，在预防与治疗性的给药及能够发挥药效作用的药物浓度范围内(含高剂量使用)，不会引起生物不良反应或明显的药物副作用。本发明所公开的多肽，其抗细胞增生失调的特点、所衍生的作为癌症预防与治疗药物的优点，以及本发明的目的可通过以下具体实施方式
了解。
具体实施例方式本发明基于以下实施例中所公开的试验结果，发现一种抗细胞增生失调的多肽，该多妝的氨基酸序列为 NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp LysVal Phe Lys Lys He Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-COOH，使用于预防与治疗可能发生细胞增生失调疾病的对象，其序列结构可数学化地表不为AM1+AM2+Ala Gly Pro+AM3 ;其中 AMl = AM2 = AM3 = Lys Trp Lys Val Phe LysLys He Glu Lys0该多肽可用于细胞增生失调的高危群体的早期罹病预防或罹病经治疗后的防治复发，用于人体的给药途径可选择经皮下或静脉给药，其中，该细胞增生失调疾病的对象包含肿瘤患者、生活于空气高度污染地区者、抽烟者或吸二手烟者等，该细胞增生失调疾病包含癌症，如肺癌。此外，该多肽对癌症具有优良的预防与治疗效果，且即使在高频率(每周5次)及高剂量(50mg/kg)使用下，也不会诱发生物不良反应及产生明显药物副作用。实施例I本发明的多肽是采用被称为“固态肽合成法”(solid-phase peptide synthesis ；由 Prof. R. B. Merrifield, Rockefeller University, USA ; 1984Nobel Laureate 所发明)的方法制造而成。这个方法的基本构想是把活化的氨基酸经耦合作用，共价结合在固体基质树脂(rasin)上即把所要合成的多肽依其序列，由N端(NH2端)起的第一个氨基酸 (Lys-I)开始耦合键结，然后依次键结(Trp-2、LyS-3、Val-4、Phe-5、LyS-6、LyS-7、Ile_8、
Glu-9,Lys-10........Glu-32)直至最后的Lys_33为止，将上述氨基酸一个个陆续接上后
形成肽，最后将合成完的肽自树脂洗下，从而获得所需要的肽。合成方法分为Boc与Fmoc两种，这两种方法是相似的，差别在于氨基酸N端的保护基不同而已。长度为2至50个氨基酸的肽可使用该方法来合成，产量可达到数克(g)甚至公斤至公吨以上。本发明的多肽，其长度为33个氨基酸，以该法来合成可得到纯度相当高的多肽(> 95% )。实施例2使用肺癌肿瘤球体的离体试验模式，测试多肽在肺癌细胞(NCI-H460)形成团块(in vitro肿瘤形成模式)之前及之后，做预先式药物给与，测定其对于癌细胞团块成长的抑制效果。其实验方法参照Timmins et al, Angiogenesis 7 :97-103, 2004所公开的过程，简述如下将细胞培养于培养皿中，待长满约70% -80%后，以胰蛋白酶将细胞与培养皿分离，转置入离心管中离心，随后计数细胞沉淀物数量，将每滴(其体积约为20 yl)中存在500个细胞的水滴，滴于培养皿上盖后，以悬滴培养法的方式静置，利用重力的吸引，让细胞聚集形成肿瘤球体。该多肽的给药方式可分为细胞悬吊后(未加药物)、悬吊同时及悬吊前等方式给予。结果显示未加药物于肿瘤细胞，则肿瘤团块成形；加入药物与让肿瘤细胞成形同时进行，则肿瘤团块成形但体积明显缩小；悬吊前预先给予药物后，再让肿瘤细胞成形，则观察到肿瘤团块并没有形成。该in vitro实验证实，本发明的多肽具有优异的抗肺癌细胞形成团块的效果。实施例3为评估本发明的多肽经血液循环途径(包含皮下或静脉给药途径)是否对血液中的红血球有细胞毒杀反应，而进行了红血球毒杀测试，该试验成果请参考Wu et al.,Peptides 30，839-848，2009。由实验结果显示，多肽的浓度小于25 y M时，对于红血球几乎无破坏能力，即使多肽浓度提高至200 u M，也仅对大约20%的红血球造成破坏，该作用效果类似于临床抗癌药物Doxorubicin(Dox)。而其他类的肽如melittin,则在很低的浓度(<5uM)下，就会对约90%的红血球造成破坏。由此显示，本发明的多肽对红血球的伤害性很低。
本发明所公开的多肽，在对离体(in vitro)肺癌细胞增生具有明显抑制作用、且不会对正常细胞(含正常血液细胞)产生明显药物毒杀的情况下，本发明还用活体(invivo)肺癌异体移植模式(xenograft model)试验,来验证该多肽在预先性给药模式的动物试验中对于肺癌肿瘤成长的抑制效果。该动物模型试验，是以免疫缺陷的裸鼠为对象，采用皮下注射(s. c.)方式作为药物进入动物身体的途径。试骀流稈在4只裸鼠(nude mice-NU/NU)的颈后侧部位预先给予本发明多肽 周(一周5次给药，每次50mg/kg)后，再以IX IO6数量的肺癌细胞(NCI-H460)注射于裸鼠的右侧腹部皮下(Dayl ;该组定义为药物试验组)，之后(Dayl至Day43)继续以一周5次,每次50mg/kg的频率给予药物并持续观察动物体重与肿瘤组织的体积变化。另外，阴性对照组的4只裸鼠，与药物试验组一样，以PH7. 2 7. 4的生理盐水预先给药一周(皮下注射，5次/周)后，再以I X IO6数量的肺癌细胞注射于裸鼠的右侧腹部皮下，之后(Dayl至Day43)继续以每周5次的频率给予生理盐水并持续观察动物体重与肿瘤组织的体积变化。而阳性对照组 的4只裸鼠在Dayl以I X IO6数量的肺癌细胞注射于裸鼠的右侧腹部皮下后，以小分子抗癌药物Dox，在其腹部附近施以静脉注射(每周一次，每次5mg/kg的剂量；具体方法参考FPastorino et. al. , Clin. Cancer Res. 14 (22) :7320-7329, 2008),并在 Day I 至 Day 43 持续观察动物体重与肿瘤组织的体积变化。与上述两组不同的是，该阳性对照组在Dayl前并未预先给药一周。以上三组(药物试验组、阴性对照组及阳性对照组)的动物，均观察至第43天(Day43)时进行实验动物剖检，并记录肿瘤组织的重量。试验结果表I及表2分别是本发明一实施例的裸鼠体重变化表以及裸鼠肿瘤组织体积变化表。结果显示，三组动物于试验前后的体重(见表I)及活动力并无显著的差异；但试验结束时的肿瘤成长(或大小)则有明显的不同(见表2):肿瘤于注射肺癌细胞约22天(Day22)后开始出现皮下肿块，阴性(生理盐水，saline)与阳性(Dox)对照组的肿瘤体积随时间的增长而变大，而药物试验组(多肽)则不然。计算阳性对照组(Dox)与药物试验组(多肽)的肿瘤平均体积相对于阴性对照组(saline)的百分比[(test group/salinegroup) % ]，其最好效果分别达到阳性对照组52. 40 % (Day40)，药物试验组13. 89 %(Day36)。至试验结束(Day43)，计算所得的各组肿瘤的平均体积相对于阴性对照组的百分比分别为83. 05% (阳性对照组)及19. 30% (药物试验组)。因此，本发明多肽在预先给药一周的动物试验中，显示其能有效抑制异体移植肺癌肿瘤的成长。
权利要求
1.一种预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-COOH,使用于预防与治疗可能发生细胞增生失调疾病的对象。
2.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽具有两个阿法螺旋以AGP三个氨基酸为转折区形成U字形三维空间结构，而显现出对细胞增生失调疾病防治与治疗的功效。
3.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽用于细胞增生失调的高危群体的早期罹病预防。
4.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽用于罹病经治疗后的防治复发。
5.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该可能发 生细胞增生失调疾病的对象为人体。
6.根据权利要求5所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽使用于人体的给药途径包含经皮下以及静脉给药。
7.根据权利要求5所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该多肽使用于人体的给药频率为每周5次，而每次给药剂量为每公斤体重给予50毫克。
8.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该细胞增生失调疾病包含癌症。
9.根据权利要求8所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该癌症包 含肺癌。
10.根据权利要求I所述的预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，其特征在于该可能发生细胞增生失调疾病的对象为选自由肿瘤患者、生活于空气高度污染地区者、抽烟者以及吸二手烟者所组成的群组。
全文摘要
一种预防与治疗细胞增生失调疾病的多肽，该多肽的氨基酸序列为NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-COOH，使用于预防与治疗可能发生细胞增生失调疾病的对象。具有该氨基酸序列的多肽可有效抑制肺癌肿瘤的成长，且该多肽在高频率给药(每周5次)及高浓度(50mg/kg)使用下，对试验动物不会造成药物不良反应或明显的副作用。
文档编号C07K14/00GK102746386SQ201110104738
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者陈惠民 申请人:陈惠民