用于治疗系统性肥大细胞增生症的组合物的制作方法

专利名称：用于治疗系统性肥大细胞增生症的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及PKC412和AMN107的联合疗法，该疗法有效对抗SM，尤其是与致癌性c-KIT突变D816V有关的SM。本发明还涉及PKC412和TK抑制剂的联合疗法，该疗法有效对抗SM，尤其是系统性肥大细胞增生症(SM)(包括迅速蔓延性SM(ASM))和肥大细胞白血病(MCL)。在优选的实施方案中，SM、ASM和MCL与致癌性c-KIT突变相关，其中所述致癌性c-KIT突变尤其包括D816V。
附图简述

图1A-D代表TK抑制剂影响赘生性细胞中的KIT磷酸化作用。图1A、BHMC-1.1细胞(图1A)和HMC-1.2细胞(表达KIT D816V；图1B)在对照培养基(对照)、伊马替尼STI571(1μM)、PKC412(1μM)或AMN107(1μM)中温育4小时后的KIT磷酸化作用。图1C、DTon.Kit.野生型细胞(图1C)和Ton.Kit.D816V.27细胞(图1D)在对照培养基(对照)、伊马替尼(即STI571)(1μM)、PKC412(1μM)、或AMN107(1μM)中温育4小时后的KIT磷酸化作用。在暴露于药物前，将Ton.Kit.野生型细胞和Ton.Kit.D816V.27细胞在1μg/ml多西环素中培育24小时以诱导KIT表达。在Ton.Kit.野生型克隆的情况下，细胞还暴露于SCF(100ng/ml，4小时)以诱导KIT磷酸化作用(p-KIT)。在全部细胞中，使用抗KIT mAb SR-1实施免疫沉淀。使用抗磷酸-mAb(anti-phospho-mAb)4G 10开展蛋白质印迹法来检测p-KIT并且使用抗KIT mAb 1C1来检测KIT总蛋白质。
图2A-D是PKC412、AMN107和伊马替尼影响HMC-1细胞增殖的示意图。图2APKC412时间依赖性地影响HMC-1.2细胞中的3H-胸苷摄入。HMC-1.2细胞与对照培养基或PKC412(300nM)在37℃和5％CO2温育，持续如所示的多个时间段。在温育后，对3H-胸苷摄入进行分析。结果表示为对照的百分数(即在每一时间点在对照培养基中的3H-胸苷摄入)并表示为一式三份的均值±S.D.。图2B-DTK抑制剂剂量依赖性影响HMC-1细胞中的3H-胸苷摄入。HMC-1.1细胞(●-●)和HMC-1.2细胞(■-■)在对照培养基中，在不存在(0)或在多个浓度的PKC412(图2B)、AMN107(图2C)或伊马替尼(图2D)存在下，于37℃温育48小时。在温育后，测量3H-胸苷摄入。结果表示为对照的百分数(0，100％)并代表来自至少3个独立实验的均值±S.D.。
图3A-B是PKC412、AMN107和伊马替尼影响Ton.Kit细胞中的3H-胸苷摄入的示意图。图3ATon.Kit.野生型细胞在对照培养基(空心柱)中培育或通过添加多西环素(1μg/ml)和SCT进行诱导以表达活化的野生型KIT(黑色柱)。在两种条件下，细胞暴露于对照培养基(Co)或如所述的多个浓度的PKC412、AMN107或伊马替尼(STI571)48小时(37℃，5％CO2)。此后，3H-胸苷摄入如本文中所述进行评定。结果表示为对照(“Co”)的百分数并代表来自3个独立实验的均值±S.D.。图3BTon.Kit.D816V.27细胞在对照培养基(空心柱)中培育或通过添加多西环素(1μg/ml)进行诱导以表达KIT D816V(黑色柱)，并且随后暴露于对照培养基(Co)或如所述的多个浓度的PKC412、AMN107或伊马替尼(STI571)48小时(37℃，5％CO2)。此后，测定3H-胸苷摄入。结果表示为对照(暴露于对照培养基的细胞在本文中称作“Co”)的百分数并代表来自3个独立实验的均值±S.D.。
图4是PKC412下调表现D816V的原代赘生性(肥大)细胞生长的示意图。表达KIT D816V的原代赘生性骨髓细胞从患有潜隐系统性肥大细胞增生症的患者中分离。分离的细胞在对照培养基(Co)中或与如所示的多个浓度的PKC412、AMN107和伊马替尼温育。细胞生长通过测量3H-胸苷摄入进行定量。结果表示为对照(其中Co等于100％)的百分数并代表一式三份的均值±S.D.。在正常骨髓细胞中，未观察到PKC412的影响(未显示)。
图5A-F是TK抑制剂影响HMC-1细胞凋亡的示意图。将HMC-1.1细胞(图5A、C、E)和HMC-1.2细胞(图5B、D、F)在不存在(Co)或存在如所示的多个浓度的PKC412(图5A、B)、AMN107(图5C、D)、或伊马替尼(图5E、F)时，于37℃培养24小时。此后，凋亡细胞的百分数通过光学显微镜定量。结果代表3个独立实验的均值±S.D.。
图6A-D代表在HMC-1细胞中PKC412所诱导凋亡的电子显微镜检验。HMC-1.2细胞与对照培养基(图6A)、500nM的PKC412(图6B)或900nM的PKC412(图6C、D)在37℃温育24小时。随后，收获细胞并对其分析凋亡的超微结构标志。虽然在暴露于对照培养基的培养物中很少见到凋亡细胞(图6A)，培养于PKC412中的HMC-1.2细胞(图6B-D)经常表现凋亡迹象，包括细胞皱缩、膜卷曲、空泡化以及核染色质浓缩。
图7代表37℃暴露于对照培养基(对照)、PKC412(1μM)、AMN107(1μM)或伊马替尼(1μM)24小时的HMC-1.2细胞。随后，通过联合的碘化丙啶(PI)/膜联蛋白V-FITC染色法检验细胞的生存力和凋亡。
图8A-H表示在HMC-1细胞中通过Tunel测定法评定的凋亡。HMC-1.1细胞(图8A-D)和HCM-1.2细胞(图8E-H)在对照培养基(图8A、E)、1μM的PKC412(图8B，F)、1μM的AMN107(图8C、G)或1μM的伊马替尼(图8D、H)在37℃温育24小时。此后，收获细胞并进行Tunel测定法测定。如可见到的那样，PKC412在绝大多数HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中产生凋亡，而AMN107和伊马替尼仅在HNC-1.1细胞中(图8C、D)而不在表达KIT D816V的HMC-1.2细胞中(图8G、H)显示出强烈的凋亡诱导作用。
图9A-B是TK抑制剂影响HMC-1.2细胞上的细胞表面抗原表达的示意图。图9AHMC-1.2细胞在37℃暴露于对照培养基(Co，空心柱)、1μM的PKC412(黑色柱)、1μM的AMN107(阴影柱)或1μM的伊马替尼(即STI571)(灰色柱)24小时。结果显示为对照的百分数并代表3个独立实验的均值±S.D.。图9BPKC412剂量依赖性地影响CD63在HMC-1.2细胞上的表达。细胞与如所示的多个浓度的PKC412在37℃温育24小时。此后，收获细胞并对其通过流式细胞术检验CD63的表达。该图显示来自一个实验的一般结果。如可见到的那样，PKC412剂量依赖性地降低CD63表达。
图10A-J是对HMC-1细胞生长的协同的药物作用的示意图。缺乏KITD816V的HMC-1.1细胞(图10A-F)和表达KIT D816V的HMC-1.2细胞(图10G-J)用对照培养基(0)或如所示的多种药物联合(以固定比率)在37℃温育48小时，以确定合作的(cooperative)抗增殖作用。图10A，C，E，G，I在与单种药物(图10APKC412，■-■；AMN107，●-●；图10CSTI571，■-■；AMN107，●-●；图10ESTI571，■-■；PKC412，●-●；图10GPKC412，■-■；AMN107，●-●；图10IPKC412，■-■；2CdA，●-●)或药物联合(▲-▲)温育后，对细胞分析3H-胸苷的摄入。结果将3H-胸苷摄入显示成对照(培养基对照，指定为“0”或作为“100％”)的百分数并代表来自一个一般实验的三次重复的均值±S.D.(相应结果在对每种药物联合的至少两个其它实验中得到)。右边图像(图10B、D、F、H、J)显示联合指数值，其中此联合指数值使用calcusyn软件，根据Chou和Talalay39方法，对涉及的每个部分(fraction)测定。联合指数(CI)值1.0显示相加作用，高于1.0的CI表示拮抗而低于1.0的CI表示协同。
图11A-D代表达沙替尼(dasatinib)影响赘生性细胞中的KIT磷酸化作用。图11A、B代表HMC-1.1细胞(图11A)和HMC-1.2细胞(表达KITD816V)(图11B)在对照培养基或多个浓度的达沙替尼中温育4小时后KIT的酪氨酸磷酸化作用。图11C、D代表在对照培养基(0)或达沙替尼(10-3-103nM)中温育4小时后，暴露于多西环素的Ton.Kit.野生型细胞(图11C)和Ton.Kit.D816V.27细胞(图11D)中的KIT磷酸化作用。在暴露于药物前，Ton.Kit.野生型细胞和Ton.Kit.D816V.27细胞在对照培养基(对照)中培养或在多西环素中培育24小时以诱导KIT的表达。在Ton.Kit.野生型的情况下，细胞还暴露于SCF(100ng/ml、4小时)以诱导KIT磷酸化作用(p-KIT)。在全部细胞中，使用抗KIT mAb 1C1实施免疫沉淀。使用抗磷酸-tyr-mAb 4G10开展蛋白质印迹法来检测p-KIT并且使用抗KIT mAb1C1来检测KIT总蛋白质(KIT)。
图12A-F代表达沙替尼对HMC-1细胞增殖和Ba/F3细胞生长及集簇的影响。图12A代表达沙替尼时间依赖性地影响HMC-1.1细胞(■-■)和HMC-1.2细胞(●-●)的3H-胸苷摄入并且HMC-1.2细胞与10nM达沙替尼，以及HMC-1.2细胞与1μM达沙替尼在37℃和5％CO2温育，持续如所示的多个时间段。在温育后，测量3H-胸苷摄入。结果表示为对照的百分数(＝在培养于对照培养基中的细胞的3H-胸苷摄入)并代表3个独立实验的均值±S.D.。图12B代表达沙替尼剂量依赖性影响HMC-1.1细胞(■-■)和HMC-1.2细胞(●-●)的3H-胸苷摄入。细胞在对照培养基中于多个浓度的达沙替尼不存在或存在下，在37℃温育48小时。在温育后，测量3H-胸苷摄入。结果表示为对照的百分数并代表来自3个独立实验的均值±S.D.。(图12C)达沙替尼影响Ton.Kit.野生型细胞的生长。细胞在与达沙替尼温育之前或温育期间在含有IL-3的培养基中维持(●-●)，或在IL-3存在下与多西环素(1μg/ml)预温育24小时，并随后在含有多西环素及SCF(100ng/ml)而无IL-3的培养基中与多个浓度的达沙替尼于37℃温育48小时(■-■)。在温育后，收获细胞并使之接受3H-胸苷摄入实验。结果表示为对照的百分数并代表3个独立实验的均值±S.D.。(图12D)达沙替尼影响Ton.Kit.D816V细胞的生长。细胞(如所示)在对照培养基(+IL-3)和多个浓度的达沙替尼中，在多西环素(1μg/ml)不存在(●-●)或存在(■-■)下温育48小时(37℃)。此后，通过台盼蓝排斥试验测定细胞生存力。结果表示为与对照(无达沙替尼＝100％)相比的有活性细胞的百分数(由台盼蓝阳性细胞百分数计算)。并代表3个独立实验的均值±S.D.。(图12E、F)达沙替尼(图12E)和AMN107(图12F)影响Ton.Kit.D816V.27细胞中KIT-D816V所诱导的集簇形成。细胞在如所示的多个浓度的达沙替尼或AMN107不存在或存在下，在无多西环素(Co)或在多西环素(1μg/ml)中温育24小时。在温育后，集簇的数目在倒置显微镜下计数。结果表示为与培养在对照培养基(Co)及多西环素(＝100％)中的细胞相比的集簇形成百分数，并代表3个独立实验的均值±S.D.。
图13代表达沙替尼在患有与白血病相关的KIT D816V阳性SM的患者中下调原代赘生性细胞的生长。原代赘生性骨髓细胞从患有与AML相关的KIT D816V阳性ASM的患者中分离。分离的细胞在对照培养基或在如所示的多个浓度的达沙替尼(●-●)、PKC412(■-■)、AMN107(▲-▲)、或伊马替尼

中温育。细胞生长通过测量3H-胸苷摄入进行定量。结果表示为对照(培养在对照培养基中的细胞＝100％)的百分数并代表一式三份实验的均值±S.D.。在正常骨髓细胞中，未观察到所施加TK抑制剂的影响(未显示)。
图14A-C表明达沙替尼在HMC-1细胞中诱导凋亡。(图14A、B)HMC-1.1细胞(图14A)和HMC-1.2细胞(图14B)在如所示的多个浓度的达沙替尼不存在(Co)或存在下培养24小时。此后，凋亡细胞的百分数通过光学显微镜定量。结果代表3个独立实验的均值±S.D.。星号表示p＜0.05。(图14C)电子显微镜检验HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中达沙替尼诱导的凋亡。HMC-1细胞与对照培养基或达沙替尼(1μM)在37℃温育24小时。随后，收获细胞并对其分析凋亡的超微结构标志。虽然在培育于对照培养基的培养物中很少见到凋亡细胞，但培养在达沙替尼中的大部分HMC-1细胞显示凋亡迹象，包括细胞皱缩、膜卷曲、空泡化以及核染色质浓缩。(图14D、E)通过Tunel测定法评定的在HMC-1细胞中达沙替尼诱导的凋亡。HMC-1.1细胞(图14D)和HMC-1.2细胞(图14E)在对照培养基、(如所示的)多个浓度的达沙替尼或如所示的PKC412(100nM和1μM)在37℃温育24小时。此后，收获细胞并进行Tunel测定法测定。如可见到的那样，达沙替尼在HMC-1.1和HMC-1.2细胞中产生剂量依赖性凋亡。
图15A-F代表达沙替尼影响细胞表面抗原在HMC-1细胞上的表达。(图15A)HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞(图15B)在37℃暴露于对照培养基或(如所示的)多个浓度的达沙替尼或PKC412(1μM)24小时。在温育后，使用CD特异性mAb，通过流式细胞术对细胞检验多种CD抗原的表达。图15C-D将平均荧光强度(MFI)水平表示为对照(＝100％)的百分数。结果代表3个独立实验的均值±S.D.。星号p＜0.05。(图15E，F)HMC-1.1细胞(图15E)和HMC-1.2细胞(图15F)在对照培养基、多个浓度的达沙替尼或PKC412(1μM)中，于37℃温育24小时后的CD63表达。用CD63mAbCLB-gran12(黑色线)开展流式细胞术。虚线代表同种型匹配的对照抗体。
图16A-D代表对HMC-1细胞生长的协同的药物作用。HMC-1.1细胞(图16A-B)和表达KIT D816V的HMC-1.2细胞(图16C-D)与单种药物或多种药物联合(以固定比率)在37℃温育48小时，此后测定3H-胸苷的摄入。(图16A)HMC-1.1与多个浓度的达沙替尼(■-■)或PKC412(●-●)或这两种药物的联合(▲-▲)温育。(图16B)HMC-1.1与多个浓度的达沙替尼(●-●)或伊马替尼(■-■)或这两种药物的联合(▲-▲)温育。(图16C)HMC-1.2细胞与多个浓度的达沙替尼(■-■)或PKC412(●-●)或与这两种药物的联合(▲-▲)温育。(图16D)HMC-1.2细胞与多个浓度的达沙替尼(■-■)或2CdA(●-●)或与这两种药物的联合(▲-▲)温育。结果代表来自一个一般实验的三次重复的均值±S.D.。如通过calcusyn程序所评定的那样，发现药物相互作用(图16A-D)在本质上是协同性的。
图17代表与对照培养基或如所示的多个浓度的达沙替尼在37℃温育48小时的HMC-1.2细胞。此后，测量3H-胸苷的摄入。结果表示为对照(在对照培养基中培养的细胞＝100％)的百分数并代表3个独立实验的均值±S.D.。
发明详述 本发明欲解决的问题是PKC412和AMN107的联合在治疗系统性肥大细胞增生症、尤其与致癌性c-KIT突变D816V相关的SM中的用途。
在所有系统性肥大细胞增生症(SM)患者包括迅速蔓延性SM和肥大细胞白血病(MCL)患者的大部分中，赘生性细胞表达致癌性c-KIT突变D816V。这种突变活化了KIT受体的酪氨酸激酶(TK)，因此其成为有吸引力的治疗靶。然而，大多数可获得的TK抑制剂(包括STI571(伊马替尼；Novartis Pharma AG))未能在药理学浓度上阻止KIT D816V的TK活性。我们提供了如此证据，即新的TK靶向性药物PKC412和AMN107(Novartis)阻断D816V突变性KIT的TK活性，并且阻碍具有多西环素诱导性KITD816V表达的Ba/F3细胞的生长以及表达这种c-KIT突变的人肥大细胞白血病细胞系HMC-1的生长。发现PKC412是更有效的药物，IC50值为50-200nM，并且在表达KIT-D816V或缺乏KIT-D816V的HMC-1细胞间无差异。相反，AMN107仅在KIT-D816V不存在下在HMC-1细胞中表现强烈的效果(与表达KIT D816V的HMC-1IC501-5μM相比，IC50是5-10nM)。相应结果用表达KIT野生型或KIT的D816V突变变体的Ba/F3细胞得到。
随后，检验了PKC412对从表达KIT D816V的SM患者骨髓中得到的原代赘生性MC的影响，与我们的细胞系数据一致，PKC412剂量依赖性地在该患者中抑制3H-胸苷摄入赘生性MC中(IC5050nM)，而用AMN107(0.1-3μM)和伊马替尼(1μM)则没有发现明显影响。PKC412和AMN107对HMC-1细胞的生长抑制作用与磷印迹实验(phosphoblotexperiments)中KIT的TK抑制作用相关，并且与如通过常规形态学方法及通过电子显微镜法评定的诱导凋亡相关。另外，发现PKC412下调CD2和CD63(在SM中被上调的两种细胞表面抗原)在HMC-1细胞上的表达。在共温育实验中，发现PKC412与AMN107、伊马替尼和克拉屈滨(2CdA)在携带KIT D816V的HMC-1细胞中以及在缺乏KIT D816V的HMC-1细胞中产生生长抑制方面起协同作用。总之，我们的数据显示PKC412和AMN107各自以及联合地阻碍表达KIT的D816V突变变体的赘生性肥大细胞生长。这两种药物因此可以被视作用于迅速蔓延性SM患者和MCL患者中的靶向性疗法的有前景的新药物。
因此，本发明涉及式(I)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二吖壬英-11-基]-N-甲基苯甲酰胺(此后称“PKC412”)
与式(II)的4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(此后称“AMN107”)
、或两者中任意一种或两种的可药用盐的联合用于治疗系统性肥大细胞增生症的用途。
除非另外说明，本文中所用缩写优选地在本公开的上下文中具有如下含义 ASM迅速蔓延性系统性肥大细胞增生症 bm 骨髓 克拉屈滨 2-氯脱氧腺苷 FCS胎牛血清 IFN干扰素-α IP 免疫沉淀 MCL肥大细胞白血病 PBS磷酸盐缓冲盐水 PE 藻红蛋白 rh 重组人的 RT 室温 SCF干细胞因子 SM 系统性肥大细胞增生症 SSM潜隐的系统性肥大细胞增生症 TK 酪氨酸激酶 wt 野生型 除非另外说明，本文中所用的常用术语优选地在本公开的上下文中具有如下含义 当对化合物、盐等使用复数形式时，这还意指单种的化合物、盐或其它等。
任何非对称的碳原子可以以(R)-、(S)-或(R，S)-构型，优选地以(R)-或(S)-构型存在。化合物因此可以作为异构体的混合物存在或作为纯异构体、优选地作为对映异构体纯的非对映异构体存在。
本发明还涉及式I和式II化合物可能的互变异构体。
盐特别是式I和式II化合物的可药用盐。式I和式II化合物可以依次或同时加以施用。式I和式II化合物可以在单一制剂中组合或以分开的制剂联合。
此类盐从具有碱性氮原子的式I和/或式II化合物形成，例如优选地与有机酸或无机酸形成酸加成盐，尤其是形成可药用盐。合适的无机酸为例如氢卤酸如氢氯酸、硫酸或磷酸。合适的有机酸是例如羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、正十二烷酸、羟乙酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷羧酸、金刚烷羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、邻苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1，5-萘-二磺酸、十二烷基硫酸、2-、3-或4-甲基苯磺酸、硫酸氢甲酯(methylsulfuric acid)、硫酸氢乙酯、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸或其它有机质子酸如抗坏血酸。
在带负电荷的基团如羧基或磺基存在下，还可以与碱形成盐，例如形成金属盐或铵盐，如碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐，或与氨或合适的有机胺(例如叔单胺，例如三乙胺或三(2-羟乙基)胺)或杂环碱例如N-乙基-哌啶或N，N′-二甲基哌嗪)形成铵盐。
当碱基团和酸基团存在于同一分子中时，式I和/或式II的化合物还可以形成内盐。
为分离或纯化目的，还有可能使用不可药用的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途，仅采用可药用盐或游离的化合物(根据需要处于药物制备物的形式)，并且它们因此被优选。
鉴于处于游离形式的新化合物与处于盐形式的新化合物(包括那些可以例如在纯化或鉴定新化合物中作为中间体使用的那些盐)间的密切关系，对前文和下文的游离化合物的任何指称将被理解为也合适地或有利地指对应的盐。
在引用专利申请或科学出版物的每种情况下，终产物、药物制备物和要求权利的主题物通过参考这些出版物而因此并入本申请。如果在所并入参考文献内的陈述与本公开的陈述间存在任何分歧，则本公开的陈述应当为优先。
通过编号、通用名称或商品名确定的活性成分的结构可以从现有版次的权威概要“The Merck Index”或从数据库例如Patents International(例如IMS World Publications)中获得。其对应内容因此通过参考得到引用。
现在惊讶地发现AMN107与PKC412联合具有治疗特性，这使得该联合特别用作酪氨酸激酶活性的抑制剂并且尤其用于治疗和预防致癌性KIT-D816V诱导的疾病，如系统性肥大细胞增生症。
如本文中此前及此后所用，KIT-D816V是指c-Kit基因的突变产物，其中编码KIT多肽的残基816位处天冬氨酸的核酸受到突变而编码缬氨酸。KIT-D816V还指突变的致癌性c-KIT基因的多肽产物。
本发明因此涉及AMN107与PKC412联合用于制备药物的用途，其中所述的药物用于治疗致癌性c-KIT突变D816V所诱导的系统性肥大细胞增生症或与致癌性c-KIT突变D816V或活化酪氨酸激酶的类似突变相关的其它疾病。
系统性肥大细胞增生症(SM)包括惰性SM、迅速蔓延性SM和SM相关的非肥大细胞血液学疾病和肥大细胞白血病。
术语“肥大细胞增生症”如本文中所用，涉及系统性肥大细胞增生症例如肥大细胞瘤并且还涉及犬肥大细胞赘生物。肥大细胞增生症是治疗选项有限的并且通常预后不良的髓系增生疾病。肥大细胞增生症的发病机理已经归因于受体酪氨酸激酶KIT的组成型活化。在大部分的肥大细胞增生症患者中，KIT失控的酪氨酸激酶活性是因在该蛋白质第816位密码子(D816V)内的突变所致，所述突变还赋予在体外(in vitro)和体内(in vivo)对伊马替尼或甲磺酸伊马替尼的抗性，其中甲磺酸伊马替尼作为

在美国销售或作为

在其它地方销售。
肥大细胞在本文中提到的变应性疾病中作为主要效应细胞发挥重要作用。抗原特异性IgE介导的肥大细胞脱颗粒作用导致随后释放化学介质和多种细胞因子，并导致白三烯合成。此外，肥大细胞参与多发性硬化的发病机理。
肥大细胞赘生物在人和动物中均存在。在犬中，肥大细胞赘生物称作肥大细胞瘤，并且该疾病是常见病，代表7％-21％的犬肿瘤。必须在人肥大细胞增生症与犬肥大细胞瘤形成间进行区分，前者通常是短暂的或惰性的，后者的行为方式不可预测并且往往是迅速蔓延性和转移性的。例如，人肥大细胞实体瘤往往不转移；相反，50％的犬肥大细胞瘤以恶变方式发展，如Hottendorf和Nielsen(1969)在回顾938只犬中的46份已发表肿瘤报告后所估计。
因观察在多种肥大细胞系中检测到导致KIT组成型活化的数种突变而提出KIT受体参与肥大细胞增生症的发病机理。例如在人c-KIT中，引起磷酸转移酶结构域中用Val替换Asp816及受体自体活化作用的点突变存在于长寿命的人肥大细胞白血病系(HMC-1)并存在于两种啮齿类动物肥大细胞系的相应密码子中。此外这种活化性突变已经在人肥大细胞增生症的一些病例中得到原位(in situ)鉴定。已经在KIT的胞内近胞膜区域内发现其它两种活化性突变，即人HMC-1肥大细胞系中的Val560Gly替换和在名为FMA3的啮齿类动物肥大细胞系中的七个氨基酸缺失(Thr573-His579)。
本发明尤其涉及AMN107与PKC412联合用于制备治疗系统性肥大细胞增生症的药物的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗系统性肥大细胞增生症的方法，包括向需要此治疗的哺乳动物施用治疗有效量的AMN107与PKC412的联合，或它们的可药用盐或前体药物。
优选地，本发明提供用于治疗患有系统性肥大细胞增生症的哺乳动物(尤其人)的方法，包括向需要此治疗的哺乳动物施用抑制KIT-D816V的量的AMN107与PKC412的联合或它们的可药用盐。
在本说明书中，术语“治疗”包括预防性治疗或治疗性治疗以及治愈性治疗和疾病抑制性治疗，包括治疗具有患此病风险或怀疑已患该病的患者以及发病患者。该术语还包括用于延缓疾病进展的治疗。
如本文中所用的术语“治愈性”意指在治疗涉及系统性肥大细胞增生症的正在发生的发作中有效。
术语“预防性”意指阻止涉及系统性肥大细胞增生症的疾病发作或复发。
如本文中所用的术语“延缓进展”意指施用活性化合物至处于待治疗疾病的前期或早期的患者，在所述患者中诊断出相应疾病的前期形式，或患者处于这样的状态下，例如在医学治疗期间，或处于因某事件所致的疾病中，其中在所述事件下相应疾病有可能发展。
这种不可预见的特性范围意味AMN107与PKC412联合的用途对制造用于治疗系统性肥大细胞增生症着的药物是特别有意义的。
这种效果尤其可能在临床上对系统性肥大细胞增生症患者有意义。
为证实AMN107与PKC412联合特别适用于治疗系统性肥大细胞增生症、具有良好的治疗性收益和其它优点，可以用技术人员已知的方式开展临床试验。
待用于抑制系统性肥大细胞增生症的AMN107与PKC412联合的精确剂量取决于数个因素，包括宿主、正在治疗的疾病的特点和严重性、施用模式。AMN107与PKC412联合可以通过任何途径共同或独立地施用，所述途径包括口服、肠胃外例如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、瘤内或经直肠或经肠地施用。优选地，AMN107与PKC412的联合经口服施用，优选地以1-300mg/kg体重的日剂量，或对绝大多数体型较大的灵长类，日剂量是50-5000mg，优选500-3000mg。优选的口服日剂量是1-75mg/kg体重，或对绝大多数体型较大的灵长类，日剂量是10-2000mg，以单剂量或分成多个剂量如每日给药两次施用。
与AMN107联合施用的PKC412的精确剂量取决于数个因素，包括宿主、正在治疗的疾病的特点和严重性、施用模式。不过，PKC412经肠胃外例如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、瘤内施用，或经直肠或经肠施用(例如口服)，优选静脉内施用或优选口服施用，以日剂量0.1至10mg/kg体重、优选1至5mg/kg体重静脉内施用通常获得令人满意的结果。在人试验中，总剂量225mg/日是最有可能的最大耐受剂量(MTD)。优选的静脉内日剂量是0.1至10mg/kg体重，或对绝大多数体型较大的灵长类，日剂量是200-300mg。一般的静脉内剂量是3至5mg/kg，一周3至5次。
最优选地，PKC412经口施用，剂型是例如微乳剂、软凝胶剂或固体分散剂，剂量至多到约250mg/日，尤其225mg/日，每日施用一次、两次或三次。
通常，初始施用小剂量并且逐步增加剂量直到对治疗中的宿主确定最佳剂量。剂量的上限是副作用所强加的上限并且可以通过试验对正在治疗的宿主加以确定。
AMN107与PKC412的联合可以独立地或共同地与一种或多种可药用载体和任选地与一种或多种其它常规药用辅药组合，并以片剂、胶囊剂、小胶囊剂等形式经肠(例如口服)施用，或以无菌性可注射溶液剂或混悬剂形式经肠胃外(例如腹膜内或静脉内)施用。肠道用或肠胃外方式用的组合物可以通过常规方法进行制备。
AMN107与PKC412的联合可以单独地或与至少一种其它药学活性化合物组合地用于这些疾病中。这些活性化合物可以在同一药物制备物中组合或以组合的制备物“多组份包(kit of parts)”形式，也就是说组合的配偶体(combination partner)可以独立地给药，或通过同时或在不同时间点以组合的配偶体的截然不同的量使用不同的固定组合进行给药。多组份包的组份然后可以例如同时地或时间上交错地施用，其中所述时间上交错地施用是对多组份包的任一组份在不同的时间点和以相同或不同的时间间隔施用。可以提到用于同AMN107与PKC412的联合组合的非限制性化合物的实例是细胞毒性化疗药如阿糖胞苷、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、环磷酰胺、VP-16或伊马替尼等。此外，AMN107与PKC412的联合可以与信号传导的其它抑制剂或其它靶向癌基因的药物联合，以期望产生明显的协同作用。
本发明还涉及如本文中所述的AMN107和PKC412的联合与伊马替尼用于治疗本文中所述的疾病和病症。此类联合可以在相同时间例如以固定、联合的药物组合物或制备物形式施用，或者依次或以错开时间方式施用。目前优选施用如本文中所述的AMN107与PKC412联合的剂型和在美国其销售形式为

(在欧洲是

)的伊马替尼，其中这些剂型的剂量是预计的剂量。
用上文的联合来治疗系统性肥大细胞增生症可以是所谓的一线治疗，即治疗新诊断的以前未接受任何化学疗法或其它疗法的疾病等，或也可以是所谓的二线治疗，即根据疾病的严重性或阶段或患者全身健康状况等，治疗之前用伊马替尼或AMN107与PKC412联合加以治疗后的疾病。
AMN107与PKC412联合治疗系统性肥大细胞增生症的功效由如下实施例的结果阐述。这些实施例仅说明本发明，无论如何不限制本发明的范围。
实施例 实施例1临床研究 评估了化合物(II)对c-KIT转录物水平和取自血液和/或骨髓的恶变细胞中c-kit的突变状态的影响。SM可以因改变的激酶活性引起。与c-KitD816V相关的SM也可以因KIT基因内的活化性突变引起。对c-KITD816V转录物开展Q-RT-PCR，在基线上，循环1第15日，循环1，2，3第28日并且每3个后续循环，研究结束。对c-kit的突变分析三个独立组，每组具有如下患者群体SM终点治疗3个月后的应答率。
实施例2AMN107与PKC412的联合 在本研究中，我们证实新的TK抑制剂PKC4125和AMN10727非常有效地阻碍表达KIT D816V的赘生性人MC生长及Ba/F3细胞生长。PKC412在这方面似乎是更有效的化合物。我们还证实PKC412与AMN107在表达或缺乏KIT D816V的HMC-1细胞中产生生长抑制方面起协同作用。这些数据表明PKC412和AMN107可能是用于治疗肥大细胞增生症的新的有前景的靶向药物。
材料和方法 试剂 TK抑制剂伊马替尼(STI571)、AMN10727和PKC4125从NovartisPharma AG(Basel，瑞士)得到。AMN107和PKC412的贮存液通过在二甲亚砜(DMSO)(Merck，Darmstadt，德国)内溶解得以制备。重组人(rh)干细胞因子(SCF)从Strathmann Biotech(汉诺威，德国)购买，RPMI 1640培养基和胎牛血清(FCS)来自PAA实验室(Pasching，奥地利)，L-谷胺酰胺和Iscove′s改良的Dulbecco培养基(IMDM)来自Gibco LifeTechnologies(Gaithersburg，MD)，3H-胸苷来自Amersham(Buckinghamshire，UK)并且碘化丙啶来自Sigma(St.Louis，MO)。干扰素α(IFNα)从Roche(Basel，瑞士)得到，2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，在本文中称作“2CdA”)来自Janssen Cilag(Titusville，NJ)并且重组人白细胞介素-4(IL-4)来自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体(mAb)IVTO85(CD2)、WM15(CD13)、YB5.B8(CD117)、N6B6.2(CD164)和97A6(CD203c)从Becton Dickinson(San Jose，CA)购买并且PE缀合的mAb CLB-gran12(CD63)来自Immunotech(Marseille，法国)。
表达或缺乏C-KIT D816V的HMC-1细胞 从肥大细胞白血病患者中产生的人肥大细胞系HMC-128由J.H.Butterfield博士(Mayo Clinic，Rochester，MN)友好提供。使用HMC-1的两种亚克隆，也即携带c-KIT突变V560G而无c-KIT突变D816V的HMC-1.120，和携带两种突变即V560G和D816V的第二种亚克隆HMC-1.220。HMC-1细胞在补充有10％FCS、L-谷胺酰胺和抗生素的IMDM中于37℃和5％CO2下生长。HMC-1细胞每隔4至8周从原始贮藏物中再融化并每周传代。作为“表型稳定性”的控制，对HMC-1细胞定期检查i)异染粒的存在、ii)表面KIT的表达和iii)IL-4(100U/ml，48小时)对KIT表达的下调作用29。在每组实验之前完成这些对照实验，并且仅使用表现原始克隆29的全部特征的HMC-1细胞。
具有野生型C-KIT或C-KIT D816V的可诱导表达的BA/F3细胞 在其它处详细描述了产生以多西环素诱导野生型C-KIT(Ton.Kit.野生型)或C-KIT D816V表达的Ba/F3细胞30。简而言之，表达逆转tet-反式激活蛋白31，32的Ba/F3细胞用含有c-KIT D816V cDNA(或野生型c-KITcDNA，均由美国纽约哥伦比亚大学J.B.Longley博士友好提供)的pTRE2载体(Clontech，Palo Alto，CA)和pTK-Hyg(Clontech)通过电穿孔法共转染。在电穿孔后，稳定转染的细胞通过在潮霉素中培养进行选择，并通过有限稀释法克隆。在本研究中，亚克隆Ton.Kit.D816V.27用于全部实验中。这些Ton.Kit.D816V细胞在暴露于多西环素后表现低的生长速率30。如通过蛋白质印迹法、免疫细胞化学、PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析16评定的那样，通过暴露于多西环素(1μg/ml)，12小时内可以在Ton.Kit.D816V.27细胞中诱导KIT D816V的表达30。
原代赘生性肥大细胞的分离 原代骨髓(bm)MC从潜隐系统性肥大细胞增生症(SSM)女性患者(年龄54岁)中得到，其中潜隐系统性肥大细胞增生症是SM的明显不同的亚变型，其特征在于涉及多种造血细胞系以及在MC系髓样细胞和非MC系髓样细胞中检测到c-KIT D816V 34-36。为对照目的，分析从接受肿瘤分期的患恶性淋巴瘤的患者(不涉及骨髓)中得到的骨髓。在骨髓穿刺前，两种患者均提交告知同意书。骨髓抽吸物从后髂嵴中得到并收集在含有无防腐剂的肝素的注射器内。将细胞铺展在菲可上，以分离单核细胞(MNC)。在SSM患者中发现MNC部分含有5％的MC，并在对照样品(正常骨髓)内发现少于1％的MC。细胞生存力＞90％。通过如先前描述16所开展的RT-PCR和RFLP分析证实SSM患者在骨髓MNC存在c-KIT突变D816V。
通过蛋白质印迹法分析KIT磷酸化作用 HMC-1细胞(106个/ml)和具有野生型KIT(Ton.Kit.野生型)或KITD816V(Ton.Kit.D816V.27)的Ba/F3细胞(106个/ml)与PKC412(1μM)、AMN107(1μM)、伊马替尼(1μM)或对照培养基在37℃温育4小时。在暴露于抑制性药物前，Ton.Kit.野生型细胞和Ton.Kit.D816V.27细胞与多西环素(1μg/ml)在37℃温育24小时以诱导KIT的表达。在Ton.Kit.野生型细胞的情况下，KIT磷酸化作用通过添加重组人SCF(100ng/ml)进行诱导。免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹法如前所述32开展。简而言之，细胞在4℃洗涤并重悬于由50mM Tris、150mM氯化钠(NaCl)、1％NonidetP40(NP-40)、0.25％去氧胆酸、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM(NaF)、1mM苯甲磺酰氟(PMSF)和1mM原钒酸钠(Na3VO4)组成的RIPA缓冲液(每108个细胞1ml缓冲液)中。在补充蛋白酶抑制物混合物(Roche)的RIPA缓冲液中于4℃温育30分钟后(每隔五分钟剧烈涡旋混合)，裂解物被离心以除去不溶性颗粒。对于IP，将来自1×107个细胞的裂解物与抗KIT抗体SR137(由V.Broudy博士友好提供，华盛顿大学，Seattle，WA)或与抗KIT抗体1C138(由H.-J.Bühring博士友好提供，图宾根大学，德国)以及蛋白G Sepharose珠(Amersham)在IP-缓冲液(50mM Tris-Cl、pH 7.4、150mM NaCl、100mM NaF和1％NP40)中于4℃温育过夜。随后，珠子用IP缓冲液洗涤3次。裂解物和免疫沉淀物随后在还原条件下通过7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并在4℃转移到含有25mM Tris、192mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中的硝酸纤维素膜(Protran，Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。膜在5％封闭剂(Roche)中封闭1小时并随后与抗KIT抗体1C1或与抗酪氨酸-磷酸化蛋白质的单克隆抗体4G10(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)在4℃温育过夜。抗体反应性通过绵羊抗小鼠IgG抗体和Lumingen PS-3检测试剂(均来自Amersham)以及CL-Xposure胶片(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)显示可见。
测量3H-胸苷摄入 为确定生长抑制性药物作用，HMC-1细胞和含有SCF活化的野生型KIT(Ton.Kit.野生型)或KIT D816V(Ton.Kit.D816V.27)的Ba/F3细胞与多个浓度的PKC412(100pM-10μM)、AMN107(1nM-100μM)或伊马替尼(3nM-300μM)在96孔培养板(PTT，Trasadingen，瑞士)中于37℃在5％CO2温育48小时。在时间-过程实验中，HMC-1细胞暴露于PKC412(300nM)持续多个时间段(1、12、24、36和48小时)。在选择实验中，HMC-1细胞(两种亚克隆)与多个浓度的IFNα(0.1-500,000U/ml)或2CdA(0.005-10μg/ml)温育。原代细胞(来自SSM患者的骨髓细胞和对照骨髓细胞)在抑制剂(50-500nM的PKC412；100nM-30μM的AMN107；1μM的伊马替尼)存在或不存在下培养48小时。
在温育后，将1μCi 3H-胸苷添加至各孔内并保持12小时(37℃)。随后，将细胞收获在Filtermate196收获器(Packard Bioscience)的滤膜上。滤膜经空气干燥并且在β-计数器(Top-Count NXT，Packard Bioscience)上计数结合的放射活性。
在独立的一组实验中，我们测定了药物联合对赘生性MC生长的(相加的或协同的)影响。为此目的，HMC-1细胞(两种亚克隆)暴露于固定药物浓度比率的多种药物联合(PKC412、AMN107、伊马替尼、IFNα、2CdA)。(相加的或协同的)药物相互作用通过使用可商业获得的软件(Calcusyn；Biosoft，Ferguson，MO)计算联合指数值而测定39。一式三份开展全部实验。
通过常规形态学和电子显微镜评估凋亡 TK抑制剂对HMC-1细胞中凋亡的影响通过形态学检查、流式细胞术和电子显微镜法分析。在一般实验中，HMC-1细胞与多个浓度的PKC412(500nM-1μM)、AMN107(50nM-10μM)、伊马替尼(50nM-10μM)或对照培养基在6孔培养板(PTT)的含有10％FCS的IMDM培养基中于37℃温育24小时。在Wright-Giemsa染色的细胞离心涂片制备物上定量凋亡细胞的百分数。凋亡根据常规细胞形态学标准(细胞皱缩、染色质结构的浓缩)定义40。
为证实HMC-1细胞中的凋亡，使用暴露于25ml塑料培养瓶(PTT)中的PKC412(500nM、900nM或1μM)、AMN107(1μM)、伊马替尼(1μM)或对照培养基24小时的HMC-1细胞(两种亚克隆)，如所述开展电子显微镜法41，42。在温育后，洗涤细胞并将其在缓冲于0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)中的2％多聚甲醛、2.5％戊二醛和0.025％CaCl2中室温(RT)固定60分钟。随后，细胞在0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液中洗涤3次，悬浮在2％琼脂中并进行离心。沉淀物随后用(缓冲于0.66mol/L可力丁中的)1.3％OsO4固定并在2％乙酸双氧铀和马来酸钠缓冲液(pH 4.4)中在室温“整体(en bloc)”染色2小时。随后将沉淀物漂洗，在醇梯度(alcohol series)中脱水并包埋于EPON 812中。切出超薄切片(85nM)并放置在金网上。切片在乙酸双氧铀和醋酸铅中增加反差并在JEOL 1200 EX II透射电子显微镜(JEOL，东京，日本)下观察。使用常规细胞形态学标准(见上文)确定凋亡细胞的存在。
通过TUNEL测定法和流式细胞术评估凋亡 为证实暴露于PKC412(1μM)、AMN107(1μM)或伊马替尼(1μM)24小时后HMC-1细胞的凋亡，如前所述应用Tunel(原位末端转移酶介导的dUTP荧光切口末端标记)测定法43，44。简而言之，细胞首先在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤并在1％甲醛，pH 7.4在0℃固定15分钟。随后，细胞用70％乙醇(冰冷)处理1小时，在PBS中洗涤并在(根据德国制造商Boehringer Mannheim的说明书制备的)含有CoCl2、DNA脱氧核苷酸基-外切转移酶(exotransferase)和生物素-16-2′-脱氧-尿苷-5′-三磷酸的末端转移酶反应溶液中于37℃温育10分钟。在温育后，洗涤细胞并将其与链霉抗生物素荧光素(Boehringer Mannheim)(10μg/ml)在37℃温育20分钟。随后洗涤MC-1细胞并对其以Nikon Microphot-FXA荧光显微镜(东京，日本)进行分析。
对于流式细胞术测定凋亡和细胞生存力，开展联合的膜联蛋白V/碘化丙啶染色法。为此目的，HMC-1细胞在37℃暴露于PKC412(0.5、1和2.5μM)、AMN107(0.5、1和2.5μM)、伊马替尼(0.5、1和2.5μM)或对照培养基24小时。此后，将细胞在PBS中洗涤并随后与膜联蛋白V-APC(AlexisBiochemicals，Lausen，瑞士)在含有HEPES(10mM，pH 7.4)、NaCl(140mM)和CaCl2(2.5mM)的结合缓冲液中温育。此后，添加碘化丙啶(1μg/ml)。随后洗涤细胞并对其通过流式细胞术在FACSCalibur(BectonDickinson)上进行分析。
评估HMC-1细胞上活化关联的表面抗原的表达 在对照培养基或补充TK抑制剂(1μM的PKC412；1μM的AMN107；伊马替尼，1μM)的培养基中短时间培养(持续24小时)后，通过流式细胞术确定细胞表面抗原在携带KIT D816V(HMC-1.2细胞)的HMC-1细胞上的表达。在选择实验中，施加多个浓度的PKC412(50、100、250、500和1000nM)。在与药物温育后，将HMC-1细胞洗涤并接受使用抗MC抗原的PE缀合抗体的单色流式细胞术处理，其中已知MC抗原(CD2、CD13、CD63、CD117、CD164、CD203c)在SM中的赘生性MC上过量表达(与正常MC相比)和/或在肥大细胞生成(mastopoiesis)的早期表达45-47。流式细胞术如前所述在FACSan(Becton Dickinson)上开展29。
统计分析 为确定HMC-1细胞暴露于抑制剂后在增殖速率、凋亡和表面抗原表达水平方面的差异显著性，对相关样品实施student’t检验。当p＜0.05时，认为结果是统计显著的。
结果 PKC412和AMN107对D816V突变性KIT的TK活性的影响 如通过IP和蛋白质印迹法评定的那样，PKC412(1μM)减少在HMC-1.1细胞(表现c-KIT突变V560G而无c-KIT突变D816V)中和携带KIT的V560G突变及D816V突变变体的HMC-1.2细胞中的KIT磷酸化作用(图1A和1B)。新的TK抑制剂AMN107(1μM)强烈地降低在HMC-1.1细胞中的KIT磷酸化作用，但是在1μM时对HMC-1.2细胞中的KIT磷酸化作用仅显出微弱影响。类似地，伊马替尼(1μM)降低在HMC-1.1细胞中的KIT磷酸化作用，而不抑制在HMC-1.2细胞中的KIT磷酸化作用(图1A和1B)。在下一个步骤中，我们检验TK抑制剂对暴露于多西环素后而表达野生型KIT(Ton.Kit.野生型)或KIT D816V(Ton.Kit.D816V.27)的Ba/F3细胞的影响。在Ton.Kit.野生型细胞中，KIT似乎在SCF存在下(但在SCF不存在下不)受到磷酸化，而发现KIT在Ton.Kit.D816V.27细胞中被组成型地磷酸化(图1C)。如图1C所见到，全部3种TK抑制剂(PKC412、AMN107、伊马替尼，均1μM)降低在Ton.Kit.野生型细胞中SCF所诱导的KIT磷酸化作用。相反，仅PKC412降低并且AMN107在较小程度上降低Ton.Kit.D816V-27细胞中SCF非依赖性KIT磷酸化作用。伊马替尼(1μM)对这些细胞中的KIT磷酸化作用未显示出可检测到的影响。这些数据表明PKC412是野生型KIT、KIT V560G和KIT D816V的TK活性的新的有效抑制剂，并且AMN107是野生型KIT和KIT V560G的新的有效抑制剂以及是KIT D816V(自体)磷酸化作用的较弱抑制剂。
TK抑制剂对HMC-1细胞中3H-胸苷摄入的影响 在时间过程实验中，PKC412、AMN107和伊马替尼对HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的生长的最大抑制作用在36-48小时后见到。图2A显示PKC412(300nM)时间依赖性地影响HMC-1.2细胞的生长，如图2B和2C中所示，发现PKC412和AMN107以剂量依赖性方式减少HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中的3H-胸苷摄入。令人感兴趣的是，PKC412在这两种亚克隆中效应的IC50似乎处于相同范围内(50-250nM)(图2B)。相反与HMC-1.1细胞中所观察的IC50值(3-10nM)相比，AMN107影响增殖的IC50值在HMC-1.2细胞中明显较高(1-5μM)(图2C)。如预期那样，伊马替尼仅在药理学相关浓度上在HMC-1.1细胞中有效(IC5010-30nM)，而在HMC-1.2细胞上未见伊马替尼的明显抗增殖作用(图2D)，这证实了先前的数据20-22。一个有意思的观察是当比较三种药物对表现c-KIT突变V560G(而无c-KIT突变D816V)的HMC-1.1细胞的生长抑制作用时，AMN107是最有效的化合物(以摩尔为基础)(图2B-D)。
TK抑制剂对表达野生型KIT或KIT D816V的BA/F3细胞生长的影响 如图3A内所示，发现全部3种TK抑制剂以剂量依赖性方式阻碍了暴露于多西环素的(表达KIT的)Ton.Kit.野生型细胞的SCF依赖性生长，其中PKC412的IC50值是3-30nM，AMN107的IC50值是30-300nM，伊马替尼的IC50值是3-30nM。相反在Ton.Kit.D816V细胞中，仅发现PKC412(IC50100-300nM)和发现AMN107(IC501-3μM)在较小程度上抑制3H-胸苷掺入，而用伊马替尼在所测试剂量范围内没有获得明显的作用(图3B)。发现这三种抑制剂在多西环素不存在(即KIT不存在)下均不阻碍Ton.Kit.野生型细胞或Ton.Kit.D816V.27细胞的生长(图3A和3B)。在又一个对照实验中，多西环素(1μg/ml)和TK抑制剂(伊马替尼、PKC412、AMN107)在对照(非转染)Ba/F3细胞上均不显示生长抑制作用(未显示)。
PKC412和AMN107阻碍表达KIT D816V的原代赘生性(肥大)细胞生长 为了再证实PKC412和AMN107在系统性肥大细胞增生症中的抗增殖作用，我们在潜隐性SM(SM的一种特殊亚变体)患者中检验原代赘生性骨髓(bm)源性的MC的应答，其中在潜隐性SM中的绝大多数髓系细胞(MC以及非MC系细胞)表达KIT D816V。事实上，虽然MC的纯度仅是4％，然而样品中的大多数髓系细胞表达KIT D816V。在这些赘生性骨髓细胞中，发现PKC412和AMN107以剂量依赖性方式抑制3H-胸苷的自发摄入，而用伊马替尼(1μM)则未见到明显的影响(图4)。在对照样品(正常bm，无血液学疾病)中，PKC412显示对3H-胸苷摄入没有影响(未显示)。
PKC412和AMN107诱导HMC-1细胞中的凋亡 为探索PKC412和AMN107对表达或缺乏KIT D816V的赘生性人MC的生长抑制作用基础的机制，分析了在暴露于药物后HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中凋亡的形态学标志和生物化学标志。在这些实验中，发现PKC412在HMC-1的两种亚克隆中以剂量依赖性方式诱导凋亡(图5A和5B)。也发现AMN107在HMC-1的两种亚克隆中以剂量依赖性方式诱导凋亡，然而该化合物在HMC-1.1细胞的效应(图5C)远比在HMC-1.2细胞中观察到的效应(图5D)明显得多。类似地，发现伊马替尼在HMC-1.1细胞中产生凋亡(图5E)，但不对HMC-1.2细胞显示出影响(图5F)。药物对HMC-1细胞的凋亡诱导作用可以通过电子显微镜证实。再次发现全部三种药物(均1μM)在HMC-1.1细胞中诱导凋亡，而在HMC-1.2细胞中，仅发现PKC412产生并发现AMN107在较小程度上产生凋亡。图6显示PKC412(1μM，24小时)对HMC-1.2细胞的凋亡诱导作用。如可见到的那样，与培养在对照培养基中的细胞相比(图6A)，暴露于PKC412的许多HMC-1细胞(图6B-D)表现典型的凋亡超微结构标志。最后，我们能够通过联合的膜联蛋白V/碘化丙啶染色法和流式细胞术(图7)以及在Tunel测定法(图8)中证实PKC412和AMN107在HMC-1细胞中的凋亡诱导作用。在这两种测定法中，发现在HMC-1.2中PKC412(1μM)诱导凋亡并且发现AMN107(1μM)在较小程度上诱导凋亡，而伊马替尼未显示影响(图7和8E-H)。相反，在HMC-1.1细胞中，发现全部3种化合物均诱导如通过Tunel测定法所评定的凋亡(图8A-D)。
这些数据提供如此证据，即PKC412和AMN107对HMC-1细胞的生长抑制作用与诱导凋亡相关。
PKC412下调活化关联性及SM相关的细胞表面抗原在HMC-1细胞上的表达 在SM中通常(过量)表达于赘生性MC上的数种细胞表面抗原可能在赘生性细胞的生长、活化或分布中发挥重要作用45，46。这些分子中的某些分子可以由KIT的D816V突变变体直接上调30。我们因此想知道PKC412、AMN107或伊马替尼是否影响细胞表面抗原在HMC-1.2细胞上的表达。发现未刺激的HMC-1.2细胞表达LFA-2(CD2)、氨基肽酶-N(CD13)、CD63、KIT(CD117)、CD164和E-NPP3(CD203c)，这证实先前的数据45-47。HMC-1.2细胞与PKC412的温育导致CD2、CD63和CD164的表达显著减少(p＜0.05)(图9A)。相反，未见PKC412对CD13或CD203c表达有明显影响(图9A)。暴露于PKC412后(以及暴露于AMN107或伊马替尼后)，发现KIT在HMC-1.2细胞上的表达轻微下降，但该影响是不显著的(p＞0.05)(图9A)。发现PKC412对CD2和CD63表达的影响是剂量依赖性的。图9B显示多个浓度的PKC412对HMC-1.2细胞上CD63表达的影响。与PKC412相反，未见AMN107或伊马替尼对HMC-1.2细胞上CD抗原表达的明显影响(图9A)。
PKC412与其它靶向药物和常规药物在HMC-1细胞中产生生长抑制作用方面合作 如通过3H-胸苷掺入所评定，发现PKC412与AMN107在HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中产生生长抑制方面合作(图10；表1)。在HMC-1.1细胞的情况下，发现药物相互作用明显是协同性的，而在HMC-1.2细胞中，相互作用是相加的而非协同的(图10；表1)。另外，发现PKC412和2CdA(一种成功用于治疗迅速蔓延性肥大细胞增生症的药物)以协同方式抑制HMC-1.1细胞生长，并且用PKC412和伊马替尼观察到同样的协同作用(表1)。然而，仍未见PKC412和2CdA对HMC-1.2细胞生长的明确协同作用。另外，AMN107和伊马替尼仅在HMC-1.1细胞(图10)中，而不在携带KITD816V的HMC-1.2细胞(表1)中产生协同的抑制作用。当PKC412与干扰素-α(IFNα)或AMN107与IFNα联合时，未见对HMC-1细胞生长的协同作用或相加作用(表1)。药物相互作用的汇总示于表1。
表1 在HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞上的药物相互作用
如表1中所示，多种药物联合对HMC-1.1细胞(右上，白色方块)和HMC-1.2细胞(左下，灰色方块)的生长的影响由3H-胸苷掺入测定法测定。每种药物联合在至少3个独立实验中测试。药物以固定的比率施加并且得到的作用(和药物相互作用的类型)由calcusyn软件确定。记分+，协同的生长抑制作用；+/-，相加作用；-，小于相加(拮抗性)作用。n.t.，未测试。
讨论 体细胞c-KIT突变D816V是导致组成型活化KIT受体的TK结构域的基因缺陷，其中KIT受体决定性地参与(赘生性)MC的生长并因此参与SM的发病机理13-17。因此，最近努力集中在鉴定并开发可以抑制KITD816V突变变体的TK活性并因此可抑制SM患者中赘生性MC生长的药理学化合物上9-12。我们在本文中描述的TK抑制剂PKC412抑制并且AMN107在较小程度上抑制KIT-D816V的TK活性和携带这种特定c-KIT突变的赘生性人MC的生长。另外，我们证实这两种药物在赘生性MC中产生生长抑制方面相互合作，以及与其它靶向的常规药物合作。
PKC412是PKC和数种TK(包括KDR、PDGFRA、FLT3和KIT)的星形孢菌素相关的新抑制剂5。在本研究中，我们证实PKC412阻碍表达KIT的D816V突变变体的赘生性人MC和Ba/F3细胞的生长。就Ba/F3细胞而言，我们的数据与Growney等48的结果一致。令人感兴趣的是，发现对Ba/F3细胞的有效剂量范围与携带KIT D816V的HMC-1.2细胞中所观察到的有效剂量范围相同。另一个令人感兴趣的观察是PKC412对HMC-1的两种亚克隆(表达或缺乏KIT D816V)的影响的IC50似乎在相同的范围内。最后，我们能够证实PKC412对表达KIT D816V的原代赘生性人(肥大)细胞的生长抑制作用。由于c-KIT突变D816V在所有SM患者的绝大部分患者中是可检测到的，与疾病的亚类型无关13-17，故这些数据意义重大。实际上，PKC412似乎是首个TK抑制剂，据报道它以对于表达野生型KIT的MC的相同方式阻碍携带KIT D816V的人MC的生长。在此方面值得注意的是，PKC412对KIT D816V阳性细胞的抑制作用明显超过AMN107和伊马替尼的抗增殖活性。基于这些观察，PKC412似乎是在(迅速蔓延性)SM患者或MCL患者中待考虑用于临床试验的新的有吸引力的靶向药物。
近来的数据表明AMN107是BCR/ABL TK活性的最有效的抑制剂27。还描述了AMN107抑制野生型KIT的TK活性27。在本研究中，我们发现AMN107对携带c-KIT突变V560G的HMC-1细胞产生有效影响，但对携带KIT V560G和KIT D816V这两者的HMC-1细胞仅表现微弱影响。类似地，AMN107对表达KIT的D816V突变变体的Ba/F3细胞的生长仅显示微弱影响。这些数据表明c-KIT突变D816V而不是c-KIT突变V560G赋予针对AMN107的相对抗性，尽管与伊马替尼相比，AMN107对KITD816V阳性HMC-1细胞仍保留抑制性作用。AMN107对V560G-阳性细胞的明显抗增殖作用也表明，该化合物可以成为有吸引力的主导候选药物，用于其中在c-KIT第560位密码子处的突变最近已被报道的胃肠基底细胞肿瘤(GIST)49。
众多以促致癌性分子(pro-oncogenic)的TK活性为靶的药学抑制剂最近已在临床血液学中得到开发5，12，19，27。这些TK抑制剂对(表达合适靶的)赘生性细胞的生长抑制作用通常与TK活性的丧失有关并与随之而来的凋亡有关。在本研究中，我们能够显示PKC412对赘生性人MC(HMC-1)的生长抑制作用与(突变的)KIT的TK抑制作用并与凋亡有关。事实上，我们能够显示PKC412在HMC-1.1细胞(表达KIT V560G，但不表达KITD816V)中以及在HMC-1.2细胞(表达KIT V560G和KIT D816V)中诱导凋亡。PKC412的凋亡诱导作用通过光学显微镜法和电子显微镜法以及通过流式细胞术并在Tunel测定法中是可验证的。如所预期，AMN107和伊马替尼对HMC-1.1细胞显示明显的凋亡诱导作用，而对HMC-1.2细胞则不表现明显作用。
众多细胞表面抗原通常(过量)表达在赘生性人MC上。类似地，与正常MC相反，SM患者中的赘生性MC表达CD2和CD2545，46。另外与正常MC相比，在SM患者的赘生性MC上表达的CD63和CD203c的水平较高。在数个情况如CD63中，KIT的D816V突变变体可以直接导致增强的表面表达30。我们因此想知道PKC412对HMC-1细胞中D816V突变性KIT的靶向是否与“SM相关的”表面CD抗原表达减少有关。我们实验的结果显示PKC412下调CD2、CD63和CD164在表达KIT D816V的HMC-1.2细胞中的表达。还观察到PKC412(和AMN107)轻微(但不显著)地影响KIT表达。令人感兴趣的观察是AMN107未能抑制CD2和CD63在HMC-1.2细胞上的表达。其可能原因是与PKC412的影响相比，化合物AMN107对KIT D816V的TK活性的影响较弱。
众多近来数据表明以TK抑制剂作为单一药物而治疗髓样肿瘤可能不足以在延长的时间期间控制该疾病。这对用于(晚期)CML中的伊马替尼已经进行过报道50，51，并且还可能适用于ASM患者或MCL患者52。在ASM患者或MCL患者中，这种情形尤其成为问题，因为突变D816V赋予KIT主要(相对)的抗伊马替尼抗性，以及在较小程度上的相对的抗AMN107抗性。为克服抗性，可以构思众多不同的药学策略。一个可能策略是应用药物联合。我们因此想了解PKC412和AMN107是否将对HMC-1.1和HMC-1.2细胞表现协同的抗增殖作用。我们的数据的确显示PKC412与伊马替尼和AMN107在HMC-1的两种克隆中产生生长抑制方面合作。此外，PKC412和2CdA(一种已描述在(迅速蔓延性)SM患者中阻碍赘生性MC在体内生长的药物)对HMC-1.1-和HMC-1.2细胞的生长显示合作的抑制作用。然而，令人感兴趣的是发现药物相互作用仅在HMC-1.1细胞而非HMC-1.2细胞上是协同的。这可以解释为与共同应用的药物对HMC-1.1细胞的极明显作用相比，同样的所述共同应用的药物对KIT的TK活性并因此对携带D816V的HMC-1.2细胞的生长产生相对弱的作用(AMN107)或无作用(伊马替尼)。当IFNα与AMN107或PKC412联合时，未见合作的药物作用。仍然未知由PKC412和其它(靶向性)药物组成的药物联合在ASM或MCL患者中是否有临床价值。
因此迄今，仅提出在SM患者中具有已记录的对体内赘生性MC的抗增殖作用的数种药物，并且这些药物均不在ASM或MCL患者中产生长期持久的彻底缓解。就此而言，如此观点具有特殊意义，即PKC412是携带KIT D816V突变变体的赘生性人MC生长的最有效的新抑制剂。
总之，我们显示PKC412和AMN107是在SM中靶向野生型KIT和KIT的突变变体的有前景的新药物。尽管这两种药物的每一种可以表现截然不同的药学特性并独特地影响KIT的突变变体，然而最有效和有前景的方法可能是将两种药物彼此联合或与临床上已建立的药物2CdA联合，以在将来治疗ASM或MCL患者。
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实施例2达沙替尼与PKC412的联合 在患系统性肥大细胞增生症(SM)(包括迅速蔓延性SM和肥大细胞白血病(MCL))的全部患者的大部分患者中，赘生性细胞显示KIT的D816V突变的变体。KIT-D816V表现组成型酪氨酸激酶(TK)活性并在恶变细胞生长中起作用。因此已经进行数次尝试以鉴定KIT-D816V靶向性药物。我们发现对具有多西环素诱导型KIT表达的Ba/F3细胞，TK抑制剂达沙替尼(BMS-354825)阻碍野生型(WT)KIT的TK活性和KIT-D816V的TK活性。另外，显示达沙替尼在Ba/F3细胞中抑制KIT D816V诱导的集簇形成和生存力并抑制HMC-1.1细胞(KIT-D816V-阴性的)和HMC-1.2细胞(KIT-D816V-阳性)的生长。达沙替尼的作用是剂量依赖性的，在携带KIT-D816V的那些细胞中具有比缺乏KIT-D816V的细胞中高100-1,000倍的IC50值。发现达沙替尼在HMC-1细胞中的抑制作用与凋亡及与CD2和CD63的表达减少相关。另外，发现达沙替尼与PKC412、AMN107、伊马替尼和2CdA在产生生长抑制方面合作。在HMC-1.1细胞中，发现所用全部药物的相互作用是协同的。相反，在HMC-1.2中，仅“达沙替尼+PKC412”和“达沙替尼+2CdA”的联合产生协同作用。这些药物联合因此可能代表令人感兴趣的用于治疗迅速蔓延性SM或MCL的药学方法。
简介 受体酪氨酸激酶如血小板衍生性生长因子受体(PDGFR)或干细胞因子受体(SCFR，KIT)常在患有造血性肿瘤的患者中失调并显示组成型酪氨酸激酶(TK)活性1-5。这些分子因此代表了药物疗法的有吸引力的靶。事实上，在过去几年期间数种新出现的治疗概念已经基于靶向赘生性髓系细胞中的关键性TK的新药物1-5。
系统性肥大细胞增生症(SM)是髓样肿瘤，其特征是赘生性肥大细胞(MC)在一个或多个器官中异常生长和聚集。SM的惰性形式以及迅速蔓延性形式已经得到描述6-9。在迅速蔓延性SM(ASM)患者和患有SM的白血病形式(即肥大细胞白血病(MCL))的患者中，对常规药物的应答不良并且预后不良6-12。因此，进行了多种尝试以便在赘生性MC中鉴定新的治疗靶并开发相应的治疗概念9-12。
在大部分患有SM的患者(包括ASM或MCL患者)中，可检测到KIT突变D816V13-17。该突变与KIT的配体非依赖性磷酸化作用以及细胞的自主性生长有关17，18。基于该观点，已经将KIT的D816V突变变体视为主要的治疗靶9-12，19。因此，已经进行过众多尝试以鉴定阻碍KIT-D816V的磷酸化作用及赘生性MC生长的TK抑制剂9-12，19-24。近来已经描述伊马替尼(STI571)(BCR/ABL的一种有效抑制剂)阻碍表达野生型(wt)KIT或KIT的罕见F522C突变变体的赘生性MC的生长20-23。另外，发现这种药物阻止赘生性细胞在如此患者中生长，其中该患者患有具备FIP1L1/PDGFRA融合基因的慢性嗜酸性粒细胞性白血病，具备或没有共存的SM24-26。然而，伊马替尼未能抑制携带KIT D816V的赘生性MC生长20-22。最近，我们和其他人已经证实PKC41227阻碍KIT-D816V的TK活性，并因而下调赘生性MC的生长28-30。还描述了新的TK抑制剂AMN10731在相对高的药物浓度时阻碍表达KIT-D816V的赘生性细胞的生长30，32。然而，这些化合物的绝大部分可能不在ASM或MCL患者中产生长久持续的彻底缓解，至少作为单一药物应用时情况如此。另外，如上提及，这些药物中的数种仅在表达野生型KIT的MC中起作用，但是不抑制携带KIT-D816V的MC的生长。因此，重要的是进一步搜寻靶向KIT的新的TK抑制剂并检查合作的药物作用(cooperative drug effects)。就药物联合而言，近来我们证实PKC412和AMN107在HMC-1细胞中产生合作性生长抑制作用30。然而，尽管该药物联合在缺乏KIT-D816V的HMC-1细胞中产生协同的抑制作用，但未在表达KIT-D816V的HMC-1.2细胞中观察到协同作用30。其它药物联合也未在表达KIT-D816V的肥大细胞中表现协同的抑制作用30。
达沙替尼(BMS-354825是src激酶的新抑制剂和数种TK(包括KIT)的抑制剂33，34。还已经描述了达沙替尼抑制KIT-D816V的磷酸化作用和赘生性MC的生长34，35。在本研究中，我们显示达沙替尼在赘生性细胞中阻断KIT-D816V依赖性疾病相关功能中的数种功能，包括存活及集簇形成以及表达CD2和CD63。另外，我们的数据表明达沙替尼与PKC412以及与2CdA在HMC-1.2细胞中产生生长抑制方面起协同作用。据我们最新所知，这是已描述的在携带KIT-D816V的MC上起协同作用的首个TK抑制剂的联合。我们的数据还表明单独或与其它药物联合的达沙替尼可能是一种用于治疗ASM或MCL患者的有前景的药物。
材料和方法 试剂 达沙替尼(BMS-354825)33由Bristol-Myers Squibb(New Brunswick，NJ)提供，并且伊马替尼(STI571)、AMN10731和PKC41227由Novartis PharmaAG(Basel，瑞士)提供。达沙替尼、AMN107和PKC412的贮存液通过在二甲亚砜(DMSO)(Merck，Darmstadt，德国)中溶解得以制备。重组人(rh)干细胞因子(SCF)从Strathmann Biotech(汉诺威，德国)购买，RPMI 1640培养基和胎牛血清(FCS)来自PAA实验室(Pasching，奥地利)，L-谷胺酰胺和Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)来自Gibco LifeTechnologies(Gaithersburg，MD)，3H-胸苷来自Amersham(Buckinghamshire，UK)，2-氯-脱氧腺苷(克拉屈滨＝2CdA)来自Sigma(St.Louis，MO)并且重组人白细胞介素-4(IL-4)来自iPeprotech(Rocky Hill、NJ)。PE标记的单克隆抗体(mAb)RPA-2.10(CD2)、WM15(CD13)、YB5.B8(CD117)和N6B6.2(CD164)以及MOPC-21(mIgG1)和G155-178(mIgG2a)从Becton Dickinson(San Jose，CA)购买，并且PE缀合的mAb CLB-gran12(CD63)来自Immunotech(Marseille，法国)。PE标记的mAb VIM5(CD87)由Otto Majdic博士(免疫学研究所，维也纳医科大学，奥地利)友好提供。
表达或缺乏KIT D816V的HMC-1细胞 从MCL患者中产生的人肥大细胞系HMC-136由J.H.Butterfield博士(Mayo Clinic，Rochester，MN)友好提供。使用HMC-1的两种亚克隆，也就是携带KIT突变V560G而无KIT D816V 20的HMC-1.1，和携带两种KIT突变即V560G和D816V 20的第二亚克隆HMC-1.2。HMC-1细胞在补充10％FCS、L-谷胺酰胺、α-硫代甘油(Sigma)和抗生素的IMDM中在37℃和5％CO2下生长。细胞每隔4-8周从原始贮藏物中再融化并每周传代。对HMC-1细胞定期检查i)异染粒的存在、ii)KIT的表达和iii)IL-4(100U/ml，48小时)对KIT表达的下调作用37。
诱导型表达野生型KIT或KIT D816V的Ba/F3细胞 先前已经描述用多西环素诱导性表达野生型c-KIT(Ton.Kit.野生型)或c-KIT D816V的Ba/F3细胞30，38的产生。简而言之，表达逆转tet-反式激活蛋白39，40的Ba/F3细胞用含有KIT D816V cDNA(或野生型KIT cDNA，均由美国纽约哥伦比亚大学J.B.Longley博士友好提供)的pTRE2载体(Clontech，Palo Alto，CA)和pTK-Hyg(Clontech)通过电穿孔法共转染。稳定转染的细胞通过在潮霉素中培养加以选择，并通过有限稀释法克隆。在本研究中，亚克隆Ton.Kit.D816V.2738用于全部实验中。KIT D816V的表达可以通过暴露于多西环素(1μg/ml)(12小时内)而在这些细胞中诱导38。
原代赘生性细胞的分离 原代骨髓(bm)细胞从患有KIT D816V阳性的ASM和相关的AML的一位患者和具有正常骨髓的一位患者中得到，骨髓抽吸物收集在含有无防腐剂的肝素的注射器中。将细胞铺在菲可上以分离单核细胞(MNC)。在这两种情况下，细胞生存力＞90％。在ASM-AML患者中，发现分离的MNC含有＞90％母细胞。在骨髓穿刺或捐献血液前，两种患者均提交告知同意书。本研究经当地机构审查委员会批准并根据赫尔辛基宣言实施。
通过蛋白质印迹法分析KIT磷酸化作用 HMC-1细胞(106个/ml)和含有野生型KIT(Ton.Kit.野生型)或KITD816V(Ton.Kit.D816V.27)的Ba/F3细胞(106个/ml)与达沙替尼(1pM、1nM、10nM、100nM、1μM)、PKC412(1μM)、AMN107(1μM)、伊马替尼(1μM)或对照培养基在37℃温育4小时。在暴露于抑制性药物前，Ton.Kit.野生型细胞和Ton.Kit.D816V.27细胞与多西环素(1μg/ml)在37℃温育24小时以诱导KIT表达。在Ton.Kit.野生型细胞的情况下，KIT磷酸化作用通过添加重组人SCF(100ng/ml)来诱导。免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹法如前所述30，40开展。简而言之，细胞在4℃洗涤并重悬于含50mMTris、150mM氯化钠(NaCl)、1％Nonidet P40(NP-40)、0.25％去氧胆酸、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM NaF、1mM苯甲磺酰氟和1mM Na3VO4的RIPA缓冲液(每1ml缓冲液108个细胞)中。在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液中于4℃温育30分钟后，离心裂解物。对于IP，将来自107个细胞的裂解物与抗KIT抗体1C143(由H.-J.Bühring博士友好提供，图宾根大学，德国)以及蛋白G Sepharose珠(Amersham)在IP-缓冲液(50mM Tris-Cl、pH 7.4、150mM NaCl、100mM NaF和1％NP40)中于4℃温育过夜。随后，珠子在IP缓冲液中洗涤3次。裂解物和免疫沉淀物随后在还原条件下通过7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并在4℃转移至含有25mM Tris、192mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中的硝酸纤维素膜(Protran，Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。膜在5％封闭剂(Roche)中封闭1小时并随后与抗KIT抗体1C1或与抗磷酸化蛋白质的单克隆抗体4G10(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)在4℃温育过夜。抗体反应性通过绵羊抗小鼠IgG抗体和Lumingen PS-3检测试剂(均来自Amersham)以及CL-Xposure胶片(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)而显示可见。
评估药物对TON.KIT.D816V.27细胞生长及功能的影响 Ton.Kit.D816V.27细胞与多西环素(1μg/ml)和多个浓度的达沙替尼或AMN107在37℃共温育24-48小时。细胞生存力通过台盼蓝排斥法测定。集簇形成通过倒置显微镜分析。先前研究已经证实KIT-D816V在Ton.Kit.D816V.27中的表达与明显的集簇形成相关，并且PKC412而非伊马替尼下调Ton.Kit.D816V.27细胞中的集簇形成38。在本研究中，分析达沙替尼(1pM-1μM)和AMN107对Ton.Kit.D816V.27细胞的集簇形成的影响。为对照目的，还检验了PKC412和伊马替尼的影响。集簇形成通过光学显微镜法测定(计数为每个高倍视野下的集簇＝HPF)并表述为对照(＝仅有多西环素而无药物＝100％)的百分数。一式三份开展全部实验。
测量3H-胸苷摄入 为测定生长抑制性药物作用，HMC-1细胞与多个浓度的达沙替尼(100fM-10μM)、PKC412(100pM-10μM)、AMN107(1nM-100μM)或伊马替尼(3nM-300μM)在96孔培养板(TPP，Trasadingen，瑞士)中于37℃温育48小时。在时间-过程实验中，HMC-1细胞暴露于达沙替尼(HMC-1.110nM；HMC-1.21μM)12、24、36或48小时。在选择实验中，HMC-1细胞与多个浓度的2CdA(0.005-10μg/ml)温育。原代细胞(来自ASM-AML患者的骨髓细胞；对照骨髓细胞)在对照培养基、达沙替尼(100pM-10μM)、PKC412(100pM-10μM)、AMN107(100pM-10μM)或伊马替尼(100pM-10μM)中培养48小时。温育后，添加1μCi 3H-胸苷(37℃，12小时)。随后，细胞收获在Filtermate196收获器(Packard Bioscience)中的滤膜(Packard Bioscience，Meriden，CT)上。滤膜经空气干燥并且在β-计数器(Top-Count NXT，Packard Bioscience)中计数结合的放射活性。为测定对细胞生长的潜在相加或协同的药物作用，将HMC-1细胞(两种亚克隆)暴露于以固定的药物浓度比率进行的多种药物组合(达沙替尼、PKC412、AMN107、伊马替尼、2CdA)。(相加的、协同的)药物相互作用通过使用可商业获得的软件(Calcusyn；Biosoft，Ferguson，MO)44计算联合指数值而测定。CI值1表示相加作用，而低于1的CI值表示药物作用的协同性。一式三份开展全部实验。
通过常规形态学和电子显微镜评估凋亡 TK抑制剂对凋亡的影响通过形态学检查、流式细胞术和电子显微镜法分析。在一般实验中，HMC-1细胞与多个浓度的达沙替尼(1pM-1μM)或对照培养基在6孔培养板(TPP)的含有10％FCS的IMDM培养基中于37℃温育24小时。凋亡细胞的百分数在Wright-Giemsa染色的细胞离心涂片制备物上进行定量。凋亡根据常规细胞形态学标准进行定义45。为证实HMC-1细胞中的凋亡，如所述46，47使用暴露于达沙替尼(1pM、1nM、10nM、100nM、1μM)、PKC412(1μM)或对照培养基24小时的HMC-1细胞(两种亚克隆)开展电子显微镜法。在温育后，洗涤细胞并将其在缓冲于0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)中的2％多聚甲醛、2.5％戊二醛和0.025％CaCl2中固定1小时。随后将细胞洗涤，悬浮于2％琼脂并离心。沉淀物随后用(缓冲于0.66mol/L可力丁中的)1.3％OsO4后固定并在2％乙酸双氧铀和马来酸钠缓冲液(pH 4.4)中“整体(en bloc)”染色2小时。随后将沉淀物漂洗，在醇梯度中脱水并包埋于EPON 812中。切出超薄切片并放置在金网上。切片在乙酸双氧铀和醋酸铅中增加反差并在JEOL 1200EX II透射电子显微镜(JEOL，东京，日本)下观察。
通过TUNEL测定法评估凋亡 为证实暴露于达沙替尼(1pM、1nM、10nM、100nM、1μM)或PKC412(100nM、1μM)后HMC-1细胞中的凋亡，使用“细胞死亡荧光素原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein)”(RocheDiagnostics，Mannheim，德国)，根据制造商说明书开展Tunel(原位末端转移酶介导的dUTP荧光切口末端标记)测定法。简而言之，将细胞置于细胞离心涂片器(cytospin)上，在PBS(pH 7.4)中的4％多聚甲醛中室温固定60分钟，洗涤并随后在0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠中透化处理。此后，洗涤细胞并将其在含有CoCl2、末端脱氧核苷酸基转移酶和荧光素标记的dUTP的末端转移酶反应溶液中在37℃温育60分钟。随后洗涤细胞并以Nikon Eclipse E 800荧光显微镜(东京，日本)进行分析。
评估HMC-1细胞上的活化关联的表面抗原的表达 在对照培养基或补充有TK抑制剂(1pM-5μM的达沙替尼；1μM的PKC412)的培养基中在37℃培养24小时后，通过流式细胞术确定细胞表面抗原在HMC-1细胞上的表达。在与药物温育后，洗涤细胞并使之接受使用抗数种MC分化抗原的PE缀合抗体的单色流式细胞术处理，其中所述的MC分化抗原包括已知在赘生性MC上异常(选择性)表达的决定因子48-51。所分析的标记是CD2、CD13、CD63、CD87、CD117和CD164。流式细胞术如前所述30，37，51在FACSan(Becton Dickinson)上开展。
统计分析 为确定HMC-1细胞暴露于抑制剂后在增殖速率、凋亡和表面抗原表达水平方面的差异显著性，对相关样品实施students t检验。当p＜0.05时，认为结果是统计学上显著的。
结果 达沙替尼对KIT-D816V的TK活性的影响 如通过IP和蛋白质印迹法所评定的那样，达沙替尼(1nM-1μM)减少了HMC-1.1细胞(表达KIT-V560G而无KIT D816V)中KIT的磷酸化作用(图11A)。在携带两种突变(KIT-V560G和KIT-D816V)的HMC-1.2细胞中，达沙替尼在1μM时减少KIT的磷酸化作用，但在更低浓度上不阻碍KIT的磷酸化作用(图11B)。我们随后检验达沙替尼对暴露于多西环素后的表达野生型KIT(Ton.Kit.野生型)或KIT D816V(Ton.Kit.D816V.27)的Ba/F3细胞的影响。在Ton.Kit.野生型细胞中，KIT显得在SCF存在下被磷酸化，而发现KIT在Ton.Kit.D816V.27细胞中被组成型地磷酸化。如图11C所见到的，达沙替尼(10nM-1μM)减少Ton.Kit.野生型细胞中SCF诱导的KIT磷酸化作用。相反在(暴露于多西环素后表达KIT-D816V的)Ton.Kit.D816V.27细胞中，达沙替尼在0.1和1μM时减少KIT的磷酸化作用，但在更低浓度上未减少KIT-磷酸化作用(图11D)。
TK抑制剂对HMC-1细胞中的3H-胸苷摄入的影响 在时间过程实验中，达沙替尼对HMC-1.1细胞生长和HMC-1.2细胞生长的最大抑制作用在36-48小时后见到。图12A显示达沙替尼(对于HMC-1.1细胞，10nM；对于HMC-1.2细胞，1μM)时间依赖性地影响这些细胞的生长。如图12B中所示，发现达沙替尼以剂量依赖性方式阻碍HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中的3H-胸苷摄入。令人感兴趣的是与对HMC-1.1细胞得到的IC50(1nM)相比，达沙替尼对HMC-1.2细胞影响的IC50(200-500nM)明显更高(图12B；图17)。然而以摩尔为基础，与(平行测试的)伊马替尼相比，发现达沙替尼更有效地抑制HMC-1.2细胞的生长。表2显示IC50值的汇总，其中IC50值为对应用于HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的TK抑制剂的影响而获得的。对于伊马替尼、AMN107和PKC412的影响，这些数据证实了以前的结果30。
表2靶向药物(IC50)对3H-胸苷摄入HMC-1细胞的影响 TK抑制剂对表达野生型KIT或KIT D816V(TON.KIT.D816V.27)的BA/F3细胞生长的影响 发现达沙替尼以剂量依赖性方式阻碍了暴露于多西环素的(表达KIT的)Ton.Kit.野生型细胞的SCF依赖性生长(IC501nM-10nM)(图12C)。在Ton.Kit.D816V.27细胞中，还发现达沙替尼抑制生长和细胞生存力(图12D)。达沙替尼在多西环素不存在，即在KIT不存在下，不阻碍Ton.Kit.野生型细胞的生长(图12C)。类似地，达沙替尼在KIT D816V(-多西环素)不存在下，未在Ton.Kit.D816V.27细胞中产生明显的生长抑制作用(图12D)。另外，在其它对照实验中，多西环素(1μg/ml)对未转染的Ba/F3细胞不显示生长抑制作用(未显示)。
达沙替尼和AMN107对TON.KIT.D816V.27细胞中KIT-D816V依赖性集簇形成的影响 我们先前已经证明KIT-D186V不仅诱导肥大细胞分化，并且诱导Ba/F3细胞中的集簇形成，这尤其有意义，因为肥大细胞的集簇形成是SM中重要的发现成果和主要疾病指标38。还已经描述了PKC412下调Ton.Kit.D816V.27细胞中多西环素/KIT-D816V诱导的集簇形成38。在本研究中，我们发现达沙替尼(100nM-1μM)并且AMN107(200nM-1μM)在较小程度上以剂量依赖性方式阻碍Ba/F3细胞中的KIT-D816V依赖性集簇形成(图12E和12F)。
达沙替尼阻碍在患有与AML相关的KIT D816V阳性SM的患者中的原代赘生性细胞生长 为了证实达沙替尼在SM中的抗增殖性药物效应，我们检验了患有与AML相关的KIT D816V阳性ASM的患者中的原代赘生性细胞。在该患者中，发现达沙替尼(IC500.3-1.0nM)以及PKC412(IC5010-30nM)以剂量依赖性方式抑制白血病细胞的自发生长(摄入3H-胸苷)。AMN107也显示生长抑制作用(100-300nM)，而伊马替尼(IC50＞1.0μM)未阻碍该患者中赘生性细胞的生长(图13)。在对照样品即在正常骨髓细胞中，达沙替尼或所测试的其它抑制剂均未显示对3H-胸苷摄入的影响(未显示)。
达沙替尼诱导HMC-1细胞中的凋亡 为探索作为达沙替尼的生长抑制作用基础的机制，我们分析在暴露于药物后的HMC-1细胞中凋亡的形态学标志和生物化学标志。如由光学显微镜评定，发现达沙替尼在HMC-1的两种亚克隆中诱导凋亡(即增加凋亡细胞数目)(图14A和14B)。将PKC412用作对照并也发现它在HMC-1的两种亚克隆中诱导凋亡，但发现伊马替尼在HMC-1.1细胞中导致凋亡，而对HMC-1.2细胞不显示影响(未显示)。达沙替尼对HMC-1细胞的凋亡诱导作用由电子显微镜证实。事实上，1μM的达沙替尼对HMC-1.1和HMC-1.2细胞均诱导凋亡(图14C)。最后，我们能够在Tunel测定法中验证达沙替尼对HMC-1细胞的凋亡诱导作用(图14D和14E)。在该测定法中，发现达沙替尼在1和1,000nM之间诱导HMC-1.1细胞的凋亡并且在100和1,000nM之间诱导HMC-1.2细胞的凋亡。将PKC412(1μM)平行作为对照并且它也在两种细胞系中诱导凋亡(图14D和14E)。相反，伊马替尼(1μM)仅对HMC-1.1细胞诱导凋亡，而对HMC-1.2细胞不显示影响(未显示)，这证实了先前的数据30。
达沙替尼下调在HMC-1细胞上活化关联的细胞表面抗原的表达 数种细胞表面抗原如CD2或CD63通常(过量)表达在SM中的赘生性MC上48-50。令人感兴趣的是，这些分子中的某些分子可以以KIT D816V依赖性方式在赘生性MC中表达38或/和在人肥大细胞发育的早期阶段表达51。我们因此研究达沙替尼是否将影响这些表面抗原在HMC-1细胞上的表达。发现未受刺激的HMC-1.1细胞表达CD13、CD63、CD87、CD117和CD164，并且HMC-1.2细胞表达CD2、CD13、CD63、CD87、CD117和CD164，这证实了先前的数据30，38，50。HMC-1.1细胞与达沙替尼的温育引起CD13、CD63、CD87和CD117的表达显著减少(p＜0.05)(图15C)。在HMC-1.2细胞中，达沙替尼显著地减少CD2、CD63和CD87的表达(p＜0.05)、但没有导致CD13、CD117或CD164的表达显著减少(图15D)。在流式细胞术实验中达沙替尼的下调作用在图15E(HMC-1.1)和图15D(HMC-1.2)中以CD63作为举例。
达沙替尼与其它TK抑制剂以及与2CdA在HMC-1细胞中产生生长抑制作用方面合作。
如通过3H-胸苷掺入所评定，发现达沙替尼与PKC412、AMN107、伊马替尼和2CdA在HMC-1细胞中引起生长抑制方面合作(表3，图16)，在HMC-1.1细胞的情况下，发现所测试全部药物的相互作用在本质上是协同的(图16A和16B)。相反在HMC-1.2细胞中，仅“达沙替尼与PKC412”以及“达沙替尼与2CdA”的联合产生明显的协同(图16C和16D)，而其它药物联合对细胞生长显示相加的生长抑制作用，而非协同的生长抑制作用(表3)。如表3中所示，对HMC-1.2细胞(上方，灰色)生长和HMC-1.1细胞(下方，暗灰色)生长的合作性药物作用由测量3H-胸苷的摄入而测定。合作性药物作用通过calcusyn软件计算。
表3 评估对HMC-1细胞生长的协同的药物作用
药物相互作用+，协同作用；±，相加作用；-，拮抗作用。
讨论 在SM患者中，MC的因子非依赖性自主生长和聚集是所有疾病形式的常见特征性特点。体细胞KIT突变D816V是认为导致KIT组成型活化和细胞自主生长的SM相关的缺陷13-17。因此，近来进行尝试以鉴定这样的药理学化合物，其抑制KIT-D816V的TK活性并因此抑制赘生性细胞的生长/聚集9-12。我们描述了新的TK抑制剂(达沙替尼)阻断赘生性细胞中KIT-D816V的TK活性并阻断KIT D816V依赖性的疾病相关的数种功能。另外，我们显示了达沙替尼与PKC412以及其它靶向的常规药物在赘生性MC中产生生长抑制方面起协同作用。
达沙替尼(又称作BMS-354825)是一种新的TK抑制剂，它对数种TK(包括BCR/ABL和KIT)产生明显的影响，并且还表现抗数种src激酶的巨大活性33-35。基于它的“TK靶向”活性，近来已经考虑达沙替尼作为可以在多种髓样肿瘤中抑制赘生性细胞生长的抗瘤剂33-35。在本研究中，我们发现达沙替尼阻碍SM相关的癌蛋白KIT-D816V的TK活性并体外抑制携带这种KIT突变的人MC的生长，这证实先前出版物的结果34，35。另外，我们发现达沙替尼阻碍Ba/F3细胞中的KIT-D816V依赖性集簇形成以及HMC-1.2细胞中CD2和CD63的表达。因此，达沙替尼阻断了赘生性MC中疾病(SM)相关的及KIT-D816V依赖性的数种功能。就生长抑制而言，令人感兴趣的观察是达沙替尼对野生型KIT或KIT G560V的影响远比用KIT D816V所见到的影响更明显。近来用AMN107和伊马替尼得到类似的观察30。然而，尽管KIT突变D816V赋予几乎完全的伊马替尼抗性，其它两种TK抑制剂即AMN107和达沙替尼仍保留相当大的抗KITD816V活性，在摩尔基础上与AMN107相比，对达沙替尼得到的IC50值更低，这可以由不同的药物-靶相互作用加以解释或由如此事实解释，即达沙替尼不仅阻碍KIT的TK活性，还阻碍数种其它潜在靶如src激酶的活性。令人感兴趣的观察是达沙替尼对HMC-1.2细胞的生长抑制作用以药理学浓度出现，这证实先前出版物的结果34，35。
在大多数情况下，TK抑制剂作为生长抑制剂通过阻断TK依赖性的细胞生长并后续凋亡而发挥作用30，35。类似地，在达沙替尼的情况下，我们能够显示HMC-1细胞的生长抑制作用与TK活性的丧失相关并且伴有凋亡迹象。达沙替尼的凋亡诱导作用通过光学显微镜和电子显微镜以及在Tunel测定法中是可证实的。如所预期，达沙替尼在HMC-1.1细胞上比在HMC-1.2中显示出更强的凋亡诱导作用，这与近期已发表的结果一致35。
SM中的重要特征和主要WHO标准是在内脏器官中的MC集簇形成41，42。我们近来已证实KIT D816V不仅诱导肥大细胞分化，还诱导Ba/F3细胞中的集簇形成38。因此，MC集簇形成可能是SM发病机理中初始且最重要的步骤。在本研究中，我们能够显示达沙替尼和AMN107阻碍了Ba/F3细胞中的KIT D816V-诱导性集簇形成。此观察为这些药物的特定作用和有效性提供进一步的证据。
数种细胞表面膜抗原通常在赘生性MC上(过量)表达48-50。类似地，与正常MC相反，在SM中的赘生性MC表达CD2和CD2548-50。此外与正常MC相比，数种细胞表面分子如CD63在赘生性MC上过量表达49。在某些情况下(如CD63)，CD分子的表达可能是KIT-D816V依赖的38。因此，我们想知道达沙替尼对KIT D816V的靶向是否与这些CD抗原表达的减少相关。我们的研究结果表明达沙替尼下调(表达KIT D816V的)HMC-1.2细胞中CD2、CD63和CD87的表达，而未发现对CD13、CD117＝KIT或CD164表达的明显抑制作用。相反在HMC-1.1细胞中，还发现达沙替尼下调CD13和KIT的表达。对这种不相符性的一种解释是HMC-1的两种亚克隆对达沙替尼的敏感性(IC50)不同。另一种可能是在HMC-1.2细胞中的CD13和KIT通常对药物诱导的调节不易感。这种假设受到如此观察的支持，即在与PKC412温育后，CD13和KIT也以相同的水平得到表达，虽然这种化合物的IC50值在HMC-1的两种亚克隆中是相同的。
众多近来数据表明以TK抑制剂作为单一药物治疗髓样肿瘤可能不足以在延长时间段上控制该疾病。这已经对伊马替尼和晚期CML51，52进行过报道并且还可能适用于ASM或MCL患者29。因此在许多此类患者中，发现了药物抗性。为了克服抗性，可以考虑众多不同的药学策略。一个合理的方法是应用药物联合。
在先前研究中，我们发现PKC412、AMN107和2CdA在HMC-1细胞中表现强烈的合作性药物作用30。尽管在缺乏KIT D816V的HMC-1.1细胞中用大多数药物联合观察到协同作用，但在携带KIT D816V的HMC-1.2细胞中未见到协同的药物相互作用(而仅有相加的药物相互作用)。因此我们很想了解作为单一药物对携带KIT D816V的肥大细胞表现强烈作用的达沙替尼在与KIT D816V的其它有效抑制剂联合时是否对这些细胞产生协同作用。我们的结果确实证实达沙替尼与PKC412以及达沙替尼与2CdA(一种用于治疗ASM和MCL的药物54)以协同方式抑制HMC-1.2细胞的生长。就我们目前所知，这是对带KIT D816V的赘生性MC生长产生协同作用的首个TK抑制剂联合。
总之，我们证实达沙替尼和PKC412是用于治疗ASM和MCL的最有前景的靶向药物。基于我们的数据，考虑应用这些药物的联合或这些药物与2CdA之间的联合以在ASM或MCL患者中改善治疗似乎是合理的。
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权利要求
1.治疗或预防系统性肥大细胞增生症的方法，包括施用式(I)的化合物
与式(II)的化合物
或它们的可药用盐的联合，其中该联合治疗或预防肥大细胞相关的增生性疾病，如系统性肥大细胞增生症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病是系统性肥大细胞增生症。
3.权利要求2所述的方法，其中系统性肥大细胞增生症具有伊马替尼抗性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中系统性肥大细胞增生症与致癌性KIT-D816V突变相关。
4.式(I)的化合物
与式(II)的化合物
或它们的可药用盐的联合的用途，用于制备治疗系统性肥大细胞增生症的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的用途，用于治疗与致癌性KIT-D816V突变相关的系统性肥大细胞增生症。
6.治疗患有系统性肥大细胞增生症的哺乳动物的方法，包括对需要此种治疗的哺乳动物施用抑制KIT活性的量的式(I)的化合物
和式(II)的化合物
或它们的可药用盐的联合。
7.用于治疗KIT-D816V相关的系统性肥大细胞增生症的药物制备物，所述药物制备物包含式(I)的化合物
和式(II)的化合物
或它们的可药用盐的联合。
8.用于治疗患有系统性肥大细胞增生症的哺乳动物包括人的方法，包括对需要此种治疗的哺乳动物施用式(I)的化合物
和式(II)的化合物
或它们的可药用盐的联合。
9.治疗或预防系统性肥大细胞增生症的方法，包括施用式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合。
10.治疗或预防系统性肥大细胞增生症的方法，包括施用式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合，其中所述联合治疗或预防肥大细胞相关的增生性疾病。
11.根据权利要求10所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病选自系统性肥大细胞增生症、迅速蔓延的系统性肥大细胞增生症和肥大细胞白血病。
12.根据权利要求10所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病具有伊马替尼抗性。
13.根据权利要求10所述的方法，用于治疗与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病。
15.权利要求10所述的方法，其中TK抑制剂选自达沙替尼和2CdA。
16.式(I)的化合物
与胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合的用途，用于制备治疗肥大细胞相关的增生性疾病的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中肥大细胞相关的增生性疾病选自系统性肥大细胞增生症、迅速蔓延的系统性肥大细胞增生症和肥大细胞白血病。
18.根据权利要求16所述的用途，其中肥大细胞相关的增生性疾病具有伊马替尼抗性。
19.根据权利要求16所述的用途，用于治疗与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病。
20.权利要求16所述的用途，其中TK抑制剂选自达沙替尼和2CdA。
21.用于治疗患有肥大细胞相关的增生性疾病的哺乳动物的方法，包括对需要此种治疗的哺乳动物施用抑制KIT活性的量的式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病选自系统性肥大细胞增生症、迅速蔓延的系统性肥大细胞增生症和肥大细胞白血病。
23.根据权利要求21所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病具有伊马替尼抗性。
24.根据权利要求21所述的方法，用于治疗与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病。
25.权利要求21所述的方法，其中TK抑制剂选自达沙替尼和2CdA。
26.用于治疗野生型或突变KIT有关的肥大细胞相关的增生性疾病的药物制备物，所述药物制备物包含式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病选自系统性肥大细胞增生症、迅速蔓延的系统性肥大细胞增生症和肥大细胞白血病。
28.根据权利要求26所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病具有伊马替尼抗性。
29.根据权利要求26所述的方法，用于治疗与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病。
30.权利要求所述26的方法，其中TK抑制剂选自达沙替尼和2CdA。
31.用于治疗患有与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病的哺乳动物包括人的方法，包括对需要此种治疗的哺乳动物施用式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合。
32.用于治疗患有系统性肥大细胞增生症的哺乳动物包括人的方法，包括施用式(I)的化合物
和胸苷激酶(TK)抑制剂、或它们的可药用盐的联合。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病选自系统性肥大细胞增生症、迅速蔓延的系统性肥大细胞增生症和肥大细胞白血病。
34.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中肥大细胞相关的增生性疾病具有伊马替尼抗性。
35.根据权利要求31或权利要求32所述的用途，用于治疗与野生型KIT或与致癌性KIT G560V或KIT-D816V突变有关的肥大细胞相关的增生性疾病。
36.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中TK抑制剂选自达沙替尼和2CdA。
全文摘要
本发明涉及酪氨酸磷酸抑制剂AMN107与PKC412的联合的用途，用于制备治疗肥大细胞相关的增生性疾病的药物。本发明还涉及有效抗肥大细胞相关的增生性疾病的酪氨酸磷酸抑制剂与TK抑制剂的联合疗法，其中所述肥大细胞相关的增生性疾病尤其包括系统性肥大细胞增生症(SM)，所述系统性肥大细胞增生症包括迅速蔓延性SM(ASM)和肥大细胞白血病(MCL)。
文档编号A61K31/506GK101267837SQ200680034147
公开日2008年9月17日 申请日期2006年7月19日 优先权日2005年7月20日
发明者彼得·瓦伦特 申请人:彼得·瓦伦特