直至40天产生500gr/l新鲜生物量。这些 细胞持续生长及可达到更高生物量。
[0246] 表3 :在大规模生物反应器（50L)中具有不同水平盐的不同培养基中生长的RGC 中白藜芦醇和总多酚的水平
[0247]
[0248] 注意-部分数值以范围呈现。
[0249] *括号内的数字描述加入GamborgB5中的矿物质的其它浓度
[0250] **数据是至少三个实验的平均数
[0251] ***数据是至少十个实验的平均数
[0252]林**McCown，s Woody 植物培养基（Lloyd and McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soc. 30:421, 1981
[0253] 实验3 :在从摇瓶中至大规模生物反应器中不同生长阶段生长的RGC中白藜芦醇 和总多酚水平的一致
[0254] 如实施例1阶段1-4所述将红葡萄细胞从Erlenmeyer摇瓶至大规模一次性生物 反应器中在存在补充的GamborgB5中在不同规模阶段生长。
[0255] 表4中的结果显示红葡萄细胞在Erlenmeyer中生长良好及合成高数量的白藜芦 醇和总多酚。当细胞在50U300-100L规模在一次性生物反应器中生长时，与在Erlenmeyer 培养瓶中生长相比获得更高的生长速度，通过细胞的鲜重和干重揭示，见表4中数据所示。 在所有规格的大规模生物反应器中，鲜重大于230g/l (表4)，而在Erlenmeyer中为166g/ 1。此外，在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中总多酚以及白藜芦醇的水平高于 在Erlenmeyer培养瓶中获得的水平，分别为901mg/l和200mg/l (表4)。与由其它人观测 的结果不同，这是首次证实果实植物细胞在大规模一次性生物反应器中的成功生长，具有 高水平的白藜芦醇和多酚产生。
[0256] 表4 :在摇瓶和不同规模阶段生长的RGC中白藜芦醇和总多酚水平*
[0257]
[0258] *数据是至少三个实验的平均数。
[0259] 实验4 :加入酪蛋白水解物对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞 中白藜芦醇和总多酚水平的影响
[0260] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 Gamborg B5 中生长。
[0261] 如表5所示，当在一次性大规模生物反应器中在有或无酪蛋白水解物的补充的培 养基中生长时，红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚的水平相似。
[0262] 表 5
[0263]
[0264] *数据是三个实验的平均数。
[0265] 实验5 :加入植物激素对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响
[0266] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的 Gamborg B5中生长。如表6所示，当在有或没有0. 5mg/l NAA和0. 2mg/l激动素的一次性 大规模生物反应器中生长时，红葡萄细胞中产生的白藜芦醇和总多酚水平相似（表6)。
[0267] 表 6
[0268]
[0270] *数据是三个实验的平均数。
[0271] 实验6 :蔗糖浓度对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的影响
[0272] 如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器（50L)中在具有 不同鹿糖浓度的补充的Gamborg B5培养基中生长。
[0273] 将红葡萄细胞在含有2、3、4和6%蔗糖的补充的培养基中生长。如下表6所示，当 细胞在2-4%蔗糖中生长时达到最佳细胞生长和生物量（143-260克/L)。较高的蔗糖浓度 如6%蔗糖抑制细胞生长达10倍（24克/L)。
[0274]表6A
[0275]
[0276] 实验7:生物反应器构造、设计和结构对于在大规模一次性生物反应器中生长的 红葡萄细胞中的白藜芦醇和总多酚的影响
[0277] 在由灭菌的一次性的透明塑料容器制成的20L生物反应器中评定两种培养 基-頂1培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐的GamborgB5培养基-对于由细胞产生的白 藜芦醇的量的影响，并与在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters中公开的数据进一 步对比，后者细胞在20L玻璃容器中在頂1培养基中生长。
[0278] 结果表明在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l 白藜芦醇（表7)，其与使用相同培养基（Decendit)在搅动的玻璃生物反应器中产生的水平 高大约3倍。此外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的GamborgB5中生长时，产 生显著高水平的白藜芦醇，为387mg/l(表7)。
[0279] 表7 :生物反应器类型和培养基成分对红葡萄细胞产生的白藜芦醇水平的影响
[0280]
[0281] *IM1培养基-Ref?文章 A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters
[0282] **数据是至少三个实验的平均数
[0283] 进一步地，含有补充的Gamborg B5的特定培养基成分与设计一次性生物反应器的 组合诱导细胞产生比在頂1培养基和搅动玻璃生物反应器中产生的水平高10-12倍的白藜 芦醇，及在一次性生物反应器中在頂1培养基中生长的细胞高4倍（表7)。
[0284] 这些结果显示生物反应器类型和培养基成分均为维持在20L或更大生物反应器 中产生的RGC中白藜芦醇的高水平所必需。
[0285] 实施例3:成分
[0286] 红葡萄和紫葡萄均含有有效的多酚、抗氧化剂和白藜芦醇，其有助于防止动脉狭 窄和硬化。越来越多的研究表明在红葡萄和紫葡萄中及最后在红葡萄酒中发现的白藜芦醇 影响机体的重要代谢途径及可有益于健康。然而，其确实具有非常高的糖含量，因此应适度 摄食。
[0287] 在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的成分是独特的。
[0288] 除了糖和白藜芦醇水平之外，所述红葡萄细胞的化学成分与使用标准农业实践生 长的葡萄相当。
[0289] 实验8:与在葡萄园中生长的红葡萄相比在大规模一次性生物反应器中生长的红 葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖水平较低
[0290] 如实施例1阶段3和4所述在大规模一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5 中生长的红葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖的量与通过农业方式生长的不同类型红葡萄 的这些糖的水平相比低25-50倍（表8)。
[0291] 表8;在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞与农业生产的红葡萄细胞 之间糖水平对比（鲜重）（gr/100gr)
[0292] A.
[0293]
[0296] 样品1-农业餐桌红葡萄（以色列）_用于食用的红葡萄
[0297] 样品2-酿酒红葡萄1 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0298] 样品3-酿酒红葡萄2 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0299] 样品4-酿酒红葡萄1 (南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0300] 实验9:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄的总多酚和白藜芦醇成分的 水平
[0301] 除了白藜芦醇之外，所述红葡萄细胞中总多酚的水平与田间生长的红葡萄中的量 相似，前者比后者中白藜芦醇的水平高40-800倍（表9和10)。如实施例1阶段3和4 描述的大规模一次性生物反应器中生长的5个批次的红葡萄细胞中的白藜芦醇的范围是 726-916mg/kg鲜重，相比之下农业生产的红葡萄中为0-42. 5mg/kg (表9)。在干燥之后红 葡萄细胞干粉中白藜芦醇水平为6000-31000mg/kg粉末（表10)。
[0302] 方法：使用HPLC结合在280、520和306nm的UV/VIS检测分析红葡萄细胞中多酚 和白藜芦醇的水平。
[0303] 表9 :红葡萄细胞和农业生产红葡萄中酚含量成分（mg/kg鲜重）
[0304]
[0305]
[0306] ND-未检测到；NT-未测试
[0307] 样品1-农业餐桌红葡萄（以色列）_用于食用的红葡萄
[0308] 样品2-酿酒红葡萄1(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0309] 样品3-酿酒红葡萄2(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0310] 样品4-酿酒红葡萄1+酿酒红葡萄2 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡 萄
[0311] 样品5-酿酒红葡萄1(南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄
[0312] 表10:红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚化合物含量
[0313]
[0314](结果为gr/kg干粉）
[0315] 实施例4:培养的葡萄细胞在体内角叉菜胶诱导的足水肿大鼠模型中的作用
[0316] 本项研究的目的在于评估根据本发明的大规模生产方法产生的RGC(红葡萄细 胞）在大鼠急性炎症模型中的体内抗炎活性，以证实根据本发明产生的细胞的效力。最广 泛用于研究急性炎症的实验模型之一基于足底内施用角叉菜胶。
[0317] 该研究通过两种方法评定RGC的效力：
[0318] 1?足体积测量
[0319] 2.自由活动的大鼠中炎性疼痛
[0320] 材料和方法：
[0321] 根据实施例1制备的红葡萄细胞（RGC)
[0322] 在注射角叉菜胶之前2小时，将RGC作为在无菌饮用水中的悬浮液以400mg/kg体 重（2ml/40mg)的剂量口服。
[0323] RGC组合物：给每只大鼠注射的多酚和白藜芦醇的量分别为14和4. 8mg(3. 5mg多 酸每100mg RGC，以及1. 2mg白藜芦醇每100mg RGC)。
[0324] 角叉菜胶诱导的大鼠足水肿：将大鼠分为3组，每组8只大鼠。所有组的大鼠均在 左后足足底注射1%角叉菜胶（0. lmg/足）或无菌盐水（0. 9% NaCl)。
[0325] 进行如下检测：
[0326] 足体积测量
[0327] ?在注射角叉菜胶之前0及在注射后1、2、4小时用测径器按小时测量注射角叉菜 胶的足体积。
[0328] ?以两个轴测量足直径并计算足体积。在这个模型中的足水肿是炎症严重度的指 征。
[0329] ?对于每个时间点，通过减去基线足体积或者与基线足体积的百分比计算足体积 的变化。
[0330] 在自由行动的大鼠中测量炎性疼痛的热板方法
[0331] 使用热板方法确定自由行动的大鼠中的炎性疼痛。在诱导水肿并用运载体、吲哚 美辛或RGC制备物处理后，将大鼠置于维持55±0. 5°C温度的热板上。轻拂或舔舐后足或者 从热板上跳起的延时与其基线对比，作为反应时间。反应时间标示为在注射后1、2和4小 时。在无反应的情况中，使用30秒截止值以防止组织损害。
[0332] 组分配：
[0333] 运载体对照组（1M):对照大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受无菌饮用水（运载 体）。
[0334] 阳性对照组（"2M"）：阳性对照组的大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受2mg/kg 体重的n引噪美辛。
[0335] 测试组（"3M"）：在注射角叉菜胶之前2小时给大鼠口服施用在无菌饮用水中的 悬浮液 400mg/kg 体重剂量的 RGC(2ml/40mg RGC)。
[0336] 结果
[0337] 足水肿：
[0338] 图1显示用RGC制备物、作为对照的吲哚美辛和水处理的大鼠的足水肿（体积％ ) 的结果。使用重复测量的双向AN0VA及随后的Bonferroni事后检定进行统计学分析。对 照组（1M)与阳性对照组（2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 001)。对照 组与RGC制备物（3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 001)。
[0339] 如图1所示，当用RGC制备物处理大鼠时，在1或2小时后足水肿降低至少为阳性 对照的水平。此外，在4小时后，用RGC制备物处理的大鼠表明足水肿降低甚至比对照组还 低。
[0340] 炎性疼痛
[0341] 图2显示在用RGC制备物、用作对照的吲哚美辛和水处理后每组的痛觉过敏作用。 使用重复测量的双向AN0VA及随后事后检定进行统计学分析。对照组1M与阳性对照组2M 的对比在2和4小时显示统计学显著差异（p〈0. 05-0. 01)。对照组与RGC(3M)对比在4小 时显示统计学显著差异（P〈〇.01)。
[0342] 如在图2中可见，在注射角叉菜胶2和4小时后，运载体处理的对照组（1M)(接受 无菌饮用水）显示对热刺激的反馈时间S (时间）显著增加。这通过这组中大鼠的足底热 刺激反应性降低表明。
[0343] 如在图3中可见，在注射角叉菜胶后2和4小时，与运载体对照组相比阳性对照组 (吲哚美辛处理的大鼠，2M)显示对热刺激的反应延时S显著降低。
[0344] RGC处理的大鼠（3M)显示在注射角叉菜胶4小时后对热刺激的反应延时S降低， 与运载体处理的对照组相比有统计学显著性。
[0345] 综上所述，这个实施例的结果表明与角叉菜胶诱导的大鼠后足炎症相关的足水肿 和行为痛觉过敏通过口服根据实施例1所述方法制备的RGC而显著减弱，表示甚至在大规 模方法中制备的RGC制备物的抗炎作用。这与Gentilli等（2001)描述的使用相同的角叉 菜胶诱导的痛觉过敏模型的研究不同。该研究显示，在角叉菜胶注射到足里之前给大鼠施 用的高浓度的白藜芦醇（50mg/kg体重，与本研究中所使用的等价于6mg/kg体重不同）没 有降低足水肿。
[0346] 实施例5:
[0347] 动物测试
[0348]从 Har 1 an Lab or a t or i e s Lt d.，Jeru sa 1 em，I sr ae 1 获得 40 只 Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠，体重250 ± 25克。所述大鼠养殖于位于动物房中的普 通笼子内，22°C，14小时光照/10小时黑暗的周期。所述大鼠维持标准的大鼠饮食，并 给予自来水随意饮用，进行为期5天的适应环境期。适应环境期之后，所述大鼠换为 由21 %蛋白质、5 %脂肪、60 %碳水化合物、0. 49 %钠和0. 49 %钾组成的富含果糖的饮食 (Teklad-Harlan, Madison, USA)，并分为四组（每组 10 只大鼠）。
[0349] 所有SD大鼠饲喂高果糖饮食五周。对于部分大鼠（30只大鼠），在饲喂高果糖饮 食三周后，向大鼠饮食直接添加不同剂量（200、400和800mg/Kg/天）的RGC。
[0350] 在基线和饮食三周和五周后测量体重、收缩血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素 水平，第一和第二次测量是在给30只大鼠补充RGC之前，而第三次测量是五周后，即在补充 RGC时期的两周后。在研究开始及饮食三周和五周后，20只大鼠（对照组的10只大鼠和补 充400mg RGC的10只大鼠）养殖于代谢笼，以分析尿钠排泄。
[0351] 血压测量
[0352] 通过间接尾袖套法测量收缩血压（BP)，使用电子血压计和气动脉搏传感器 (58500BP Recorder, UGO BASILE, Varese, Italy)。当所述大鼠固定在普通温度的大鼠夹时 进行所述测量。5次连续读数的平均值用于确定收缩BP。
[0353] 实验室测量
[0354] 在指示的时间点（第一和第二次测量是在给30只大鼠补充RGC之前，而第三次测 量是起始点五周后，即在补充RGC时期的两周后）饥饿五小时后，在用异氟烷轻微麻醉下， 通过眼窝后静脉窦穿刺从所有大鼠采集血液样品。
[0355] 在存在EDTA的情况下收集用于血浆的血液，以防止凝血，并将血液保持于冰上。 离心后，分离血衆并在-80°C冷冻直至进一步分析。用酶比色反应自动分析仪（Olympus AU 2700, Hamburg, Germany)测定甘油三酯水平。用 I-125RIA试剂盒（INSIK-5, Diasorin, USA) 评估血浆胰岛素。用脂联素RIA试剂盒（Cat. #MADP-60HK来自Linco Research Inc. ,St. Charles, MO)测量总血衆脂联素浓度。用自动分析仪（Olympus An 2700 ;01ympus Diagnostics, Hamburg, Germany)测量尿钠排泄速率。
[0356] 结果
[0357] RGC对血压、血浆甘油三酯、胰岛素、脂联素和钠排泄的作用
[0358] 用高果糖饮食饲喂的大鼠补充或不补充RGC体重增加是相似的（表11)。高果糖 饮食诱导了显著的血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素水平（图5,表4)。在高果糖饮食 五周后，收缩 BP 升高 19.1±l.lmm Hg(p〈0.001)，从 137mm Hg 到 156mm Hg。补充 RGC 减 少了由高果糖饮食诱导的BP升高，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一组中从161 ±4. 5到 151 ± 3. 6mmHg，在接受400mg/Kg/天的RGC的第二组中从162 ± 5到152 ± 3mmHg以及在接受 8001^/此/天的1?(：的第三组中从162±2.8到150±1.8_取(口〈0.05)。补充1?(：减少了血 浆中的甘油三酯的水平，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一组中从234± 14到171± 12mg/ dL，在接受 400mg/Kg/ 天的 RGC 的第二组中从 235± 12 到 167±24mg/dL，在接受 800mg/Kg/ 天的RGC的第三组中从219±31到142±21mg/dL。RGC减少了由高果糖饮食诱导的血浆胰 岛素水平，在以200、400和800mg/Kg/天剂量的RGC处理的大鼠组中，从对照组（富含果糖 饮食）的 ±43. 5mg/dL 分别到 33. 9±2. 6、34. 4±3. 8 和 31. 6±2. 9mg/dL。
[0359] 如以下数据显示，RGC对脂联素水平没有一致的作用，对照组中脂联素水平 5. 8±0. 3,与之相比，在以200、400和800mg/Kg/天剂量的RGC处理的大鼠组中，分别为 6. 0+0? 4, 4. 5±0. 2 和 5. 4±0. 5。
[0360] 在补充或不补充RGC的大鼠中，基线尿钠排泄是相同的（分别为0. 5±0. 1和 0. 7±0. 2mmol/天，p = 0.43)。在高果糖饮食三周后，尿钠排泄显著升高，并在补充RGC后 保持不变（三周后，补充或不补充RGC的大鼠中分别为3. 5±0. 2和2. 3±0. 3mmol/天，都 是 p〈0. 05 ;而五周后，分别为 3. 1±0. 2and 1.8±0. 3mmol/天，组间 p = 0. 4)。
[0361] 表11 :所研究的组中的体重、甘油三酯、胰岛素和脂联素水平
[0362]
[0363]
[0364] *p〈0. 05vs.基线，#p〈0. 05vs.富含果糖饮食
[0365] 实施例6 :RGC-RES的化学性质（与其它来源的RES相比）及RGC-RES的人体生物 利用度性质
[0366] 材料和方法
[0367] 红葡萄细胞（RGC)根据实施例1所述制备。RGC的白藜芦醇（RES)含量通过HPLC 在306nm针对合成的RES标定曲线确定。
[0368] RGC-RES 的 LC/MS 分析
[0369] 将RGC粉末溶解于80%甲醇中。使用Accela LC系统结合装备电喷射离子源的 Linear Trap Quadrupole (LTQ) Orbitrap Discovery hybrid FT 质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.)对样品进行液态层析质谱分析（LC-MS)。质谱仪以负离子化模式运行， 质谱在m/z 150-