al Basis of Therapeutics"，Ch. Ip. 1)〇
[0119] 在本发明的一些实施方案中，提供了用于治疗、缓和或预防代谢综合征的粉末形 式的组合物，其包含所述大规模方法中的体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养 物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆 果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄种皮中的一或多种；其中葡萄 浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含的白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg粉末。在本发明 的一些实施方案中，根据本发明所述大规模方法的实施方案生产的葡萄细胞中至少90%的 白藜芦醇是反式-葡糖苷白藜芦醇。
[0120] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中不同多酚的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。这在实施例3、表9中清晰可见，其中将在根据本发明的实施方案大规模 生产的干燥的葡萄细胞培养物中总的白藜芦醇与葡萄中白藜芦醇的量比较。根据一些实施 方案，某些多酚的量在所制备的果实细胞与其在农业葡萄果实中的量相比增加。根据一些 实施方案，白藜芦醇的量在果实细胞中增加。根据一些实施方案，果实细胞（可以是葡萄细 胞）在干燥为粉末之后其中白藜芦醇的量为1000-50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于1000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于3000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于5000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于10000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于20000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于30000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于40000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于50000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于60000mg/kg。根据本发明的一些实施方 案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于70000mg/kg。
[0121] 根据一些实施方案，所制备的果实细胞中各种成分的相对量与其在农业葡萄果实 中的相对量不同。根据一些实施方案，所述果实细胞中糖的相对量与农业葡萄果实中糖的 相对量相比降低。
[0122] 根据一些实施方案，干燥的果实细胞含有高达10% w/v甜味糖。根据本发明的一 些实施方案，干燥的果实细胞含有高达15% w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实 细胞含有10-15% w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有15-20% w/v甜味 糖。根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞含有少于10% w/v甜味 糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于5% w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述 果实细胞含有少于3 % w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于2 % w/v甜 味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于l%w/v甜味糖。根据一些实施方案，所 述果实细胞含有约1 % w/v甜味糖。如本文所用，短语"甜味糖"是指提供甜味的糖，如蔗 糖、葡萄糖和果糖。
[0123] 根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有少于20%w/v甜味糖。根据一个实施方 案，干燥的果实细胞含有少于30% w/v甜味糖。
[0124] 根据一些实施方案，将果实细胞干燥，从而浓缩在其中发现的物质，包括糖。根据 一些实施方案，所述物质浓缩5倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩10倍。根据一些实施 方案，所述物质浓缩15倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩20倍。根据一些实施方案， 所述物质浓缩25倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩30倍。
[0125] 根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞是无味的；根据其 它的实施方案，根据本发明的大规模制备的果实细胞是有味的。本发明的实施方案涉及用 于大规模体外生产果实细胞的方法。在本发明的一些实施方案中，所述方法不包括提取果 实细胞。出人意料的是，根据本文描述的大规模方法制造的所生产的果实细胞显示包含多 酚的量高。
[0126] 在本发明的一个实施方案中，提供体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组 织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0127] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0128] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；以及收获所产生的葡萄细胞。
[0129] 在本发明的一些实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物的大规模方法，所述方法包括：
[0130] 将葡萄细胞在瓶中生长；
[0131] 将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；将葡萄细胞从所述第一生物反应器接 种至另一个生物反应器，其中所述另一个生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物 反应器，及可以提供使用一或多个中间生物反应器的一些更多的步骤及其中所述第一生物 反应器和所述另一个生物反应器中的至少一个是一次性的；及
[0132] 从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；
[0133] 其中将从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。
[0134]"一次性生物反应器"是指具有一次性包袋的生物反应器，其可以是代替培养容器 的一次性使用的包袋。所述一次性包袋通常是由三层或更多层塑料薄片制成。在本发明的 一些实施方案中，一层是由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE制成，以提供机械稳定 性。第二层是使用尼龙、PVA或PVC制成，其作为气体屏障。最后，接触层由PVA或PP制成 或者是另一聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE层。对于医学应用，接触产物的一次性 使用的材料必须通过European Medicines Agency或者其它地区的相似权威机构认证。
[0135] 根据本发明的一些实施方案，一次性生物反应器由一或多层的聚乙烯制成。在本 发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成。
[0136] 通常地，有两种不同方法构建一次性使用的生物反应器，区别在于用于搅动培养 基的方式。
[0137] 一些一次性使用的生物反应器使用搅拌器，像常规生物反应器一样，但是搅拌器 整合在塑料包袋中。密闭的包袋和搅拌器提前灭菌。在使用中，将包袋安装在生物反应器 中，及将搅拌器与机械性或磁性驱动器连接。
[0138] 其它一次性使用的生物反应器是通过摇摆运动搅动的。其它一次性使用的生物反 应器是空气搅拌的（airlift)生物反应器，其中通过空气的导入搅动反应培养基及使其通 气。这种类型的生物反应器不需要在一次性使用包袋内部的任何机械性搅动器。
[0139] 根据一些实施方案，制备果实细胞的大规模方法包括许多随后的步骤。根据本发 明的一些实施方案，在每个步骤中制备的果实细胞的量大于在先前步骤中制备的量。进一 步地，在每个步骤中制备的果实细胞接种或收获以用作大规模方法中下一步的起始物。在 大规模方法的最后步骤中，通常使果实细胞生长直至其达到生长曲线图的平台期。
[0140] 使用本发明的大规模方法的优势在实施例章节中是清楚的并得到证实。如在实施 例2、实验2中可见，使用补充的GamborgB5培养基的红葡萄细胞（RGC)的生物量高于与在 非补充的GamborgB5培养基中获得的生物量。进一步地，甚至在大规模生物反应器中，使 用含有不同浓度的镁、硝酸盐和磷酸盐（KN03、MgS04、MgN03、NaH2P04)的GamborgB5培养基 导致所产生的细胞中的高水平白藜芦醇。
[0141] 表4和实施例2、实验3显不在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中生长 的葡萄细胞中总多酚及白藜芦醇水平高于在Erlenmeyer瓶中生长的葡萄细胞中获得的水 平，即分别为910mg/l和203mg/l。与其它人的观测结果不同，这是首次证实在大规模一次 性1000-5000升生物反应器中果实植物细胞系的成功生长，具有较高水平白藜芦醇和多酚 产生。
[0142] 表7和实施例2、实验7显示两种培养基頂1培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐 的Gamborg B5对于由细胞产生的白藜芦醇的量的影响。在由无菌的一次性透明塑料容器 制成的20L生物反应器中评定该影响，并与在A. Decendit (1996) Biotechnology Letters 中公开的数据进一步对比，其中细胞是生长在20L玻璃容器中的頂1培养基中。结果表明 在一次性生物反应器中頂1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l白藜芦醇（表7)，其比 在使用相同培养基（Decendit)的搅动的玻璃生物反应器中产生的水平的大约高3倍。此 外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5培养基中生长时产生显著高水 平的白藜芦醇，即387mg/l。因此，这个实验显示使用一次性生物反应器和含有不同浓度镁、 硝酸盐和磷酸盐（KN0 3，MgS04，MgN03，NaH2P04)的Gamborg B5培养基的优势以及使用一次性 生物反应器和补充的Gamborg B5培养基组合的优势。
[0143] 根据一些实施方案，使果实细胞在生物反应器中生长。根据一些实施方案，设计生 物反应器以使得能够进行适当的混合及质量转移，同时使剪切力和流体动力压力强度最小 化。根据本发明的一些实施方案，至少一个生物反应器是一次性生物反应器。其可以是第一 生物反应器或者中间生物反应器或者最后的生物反应器或者其任意组合。根据本发明的一 些实施方案，一次性的生物反应器是最后的生物反应器，之后收获细胞并干燥以形成粉末。
[0144] 根据本发明一个举例的实施方案，第一步包括在瓶如Erlenmeyer或生物反应器 中制备果实细胞。根据一些实施方案，第一步包括制备直至1.0L的果实细胞培养物。根据 进一步的实施方案，第一步包括制备直至1. 5L的果实细胞培养物。根据进一步的实施方 案，第一步包括制备直至2. 0L的果实细胞培养物。
[0145] 根据一些实施方案，使用玻璃、金属或者塑料瓶进行第一步。根据一些实施方案， 该瓶是一次性的。根据进一步的实施方案，该瓶可以重新使用任何次数。根据一些实施方 案，该瓶在两次使用之间通过任何适当方式灭菌。
[0146] 根据一些实施方案，第一步包括使用任何合适的培养基以使得果实细胞生长。根 据一些实施方案，用于使果实细胞生长的培养基包括细胞生长培养基、盐、维生素、糖、激素 或者其任意组合。根据一些实施方案，细胞生长培养基是135631]113(^〖(631]113(^^6丨31.，￡叉口. Cell Res. 50:151，1968)，或者其任何变型。根据一些实施方案，Gamborg B5包含盐如镁、 磷酸盐、硝酸盐或其任何组合。根据本发明的一些实施方案，Gamborg B5培养基包含KN03、 MgS04、NaH2P0 4S者其任何组合。根据一些实施方案，培养基包含Gamborg B5维生素或者其 任何组合。根据进一步的实施方案，培养基包含糖如蔗糖、Gamborg B5或者其任何组合。
[0147] 在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的謂03的浓度为25mM-45mM。
[0148] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%304的浓度为
[0149] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3的浓度为5mM-35mM。
[0150] 在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的謂03的浓度为15mM-60mM。
[0151] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04浓度为0. 5mM-25mM。
[0152] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3浓度为lmM-50mM。
[0153] 在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的謂03浓度为30mM-40mM。
[0154] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04*度为5mM-10mM。
[0155] 在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3浓度为20mM-30mM。
[0156] 在本发明的实施方案中，将肌醇加入Gamborg B5中。
[0157] 在本发明的实施方案中，将H3B03加入Gamborg B5中。
[0158] 在本发明的实施方案中，将MnS04加入Gamborg B5中。
[0159] 在本发明的实施方案中，将NaH2P04加入GamborgB5中。
[0160] 在本发明的实施方案中，将生物素加入Gamborg B5中。
[0161] 在本发明的实施方案中，将D-泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0162] 在本发明的实施方案中，将大约0.5mM肌醇加入Gamborg B5中。
[0163] 在本发明的实施方案中，将大约0. 05mM H3B03加入Gamborg B5中。
[0164] 在本发明的实施方案中，将大约0. 04mM MnS04加入Gamborg B5中。
[0165] 在本发明的实施方案中，将大约ImM NaH2P04加入Gamborg B5中。
[0166] 在本发明的实施方案中，将大约0. 004mM生物素加入Gamborg B5中。
[0167] 在本发明的实施方案中，将大约0.2mM D-泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0168]在本发明的实施方案中，将大约 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4、5、6、7、8、9、10禮肌醇加入6&11113〇找85中。
[0169]在本发明的实施方案中，将大约 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.1 mM H3B03加入 Gamborg B5 中。
[0170] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.1 mM MnS04加入 Gamborg B5 中。
[0171] 在本发明的实施方案中，将 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、3、4、 5、6、7、8、9、10mM NaH2P04加入 Gamborg B5 中〇
[0172] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 001、0. 002、0. 003、0. 004、0. 005、0. 006、0. 007、 0? 008、0? 009、0? 0 ImM 生物素加入 Gamborg B5 中。
[0173] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4mM D_泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0174] 在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的蔗糖浓度为2-4%。在另一实施方 案中，浓度为大约3%。
[0175] 根据进一步的实施方案，酪蛋白可以包含在细胞生长培养基中。根据进一步的实 施方案，生长激素可以包含在细胞生长培养基中。根据进一步的实施方案，生长培养基包含 激素。根据一些实施方案，果实细胞不用添加激素而生长。
[0176] 根据一些实施方案可以在所述方法的一或多个阶段使用的植物培养基的 例子包括但不限于：Anderson(Anderson，In Vitro 14:334,1978 ;Anderson，Act. Hort.，112:13, 1980)，Chee and Pool(Sci.Hort.32:85, 1987)，CLC/Ipomoea (CP) (Chee et al.,J. Am. Soc. Hort.Sci. 117:663, 1992), Chu(N. sub. 6) (Chu et al. ,ScientiaSinic. 18:659, 1975 ；Chu,Proc. Symp.Plant Tiss.Cult. ,Peking 43, 1978), DCR(Gupta and Durzan,Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKff/Juglans (Driver and Kuniyuki,HortScience 19:507， 1984 ;McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan，eds.，Cel1 and Tissue Culture in Forestry, MartinusNijhoff,D ordrecht，1987)，De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs，Plant Sci. Lett. 17:55, 1979), Eriksson (ER) (Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy (DBM2) (Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132, 1974),Heller 's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14: 1，1953)，Hoag land's (Ho agland and Arnon，Circular 347,Calif.Agr.Exp.Stat. , Berkeley, 1950),Kao and Michayluk (Kao and Michayluk,Planta 126:105, 1975), Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant. 18:100, 1965), Litvay's(LM) (Litvay et al.,Plant Cell Rep. 4:325, 1985)，Nitsch and Nitsch (Nitsch and Nitsch，Science 163:85，1969)，Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult.Fruit Mar. , Gembloux 93, 1977)，Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bo t.50:199, 1972)，White's(White，The Cultivation of Animal and Plant Cells，Ronald Press，NY，1963)等。
[0177] 根据一些其它举例的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间持续混合。 根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间间歇混合。根据一些实施方 案，第一个步骤期间的温度为20 °C -30 根据一些实施方案，在第一个步骤期间的温度为 22°C_28°C。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天。根据一些实施方 案，果实细胞在第一个步骤生长多于7天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长 多于5天但少于2周。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天以上但少 于12天。
[0178] 根据一些举例的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括一个进口，在第 一个步骤果实细胞通过其进入，培养基和任何其它物质置于生物反应器中。根据进一步的 实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括排出任何希望的物质的出口。根据一些实 施方案，出口包括玻璃出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气 体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦瓶中的气 压（atmosphere)达到预定压力，贝lj气体从瓶中释出。根据一些实施方案，预定的压力直至 8PSI〇
[0179] 根据一些举例的实施方案，结束果实细胞生长的第一步之后，将果实细胞接种于 小规模生物反应器中，在此也称作第一生物反应器。对于大规模方法的第二