用于治疗神经变性的细胞疗法
【技术领域】
[0001 ] 本公开描述细胞组合物和用于治疗神经变性的方法。
【背景技术】
[0002] 神经变性是导致神经细胞死亡的病理状态。尽管神经变性的成因可能多种多样而 且并不总能确定，但是许多神经病症都具有神经变性作为共同的病理状态。例如，阿尔兹海 默症、帕金森症、亨廷顿症和肌萎缩侧索硬化症（ALS)都引起慢性神经变性，其特征在于神 经细胞在若干年期间缓慢且逐渐死亡，而急性神经变性的特征在于由缺血（例如，中风）或 创伤（例如，创伤性脑损伤）导致的，或者由例如因脊椎受伤或多发性硬化而引起的脱髓鞘 或创伤造成的轴索切断（axonal transection)导致的神经细胞死亡的突然发作。
[0003] 各种各样的由例如酗酒、药物成瘾、暴露于神经毒素和辐射所导致的神经细胞损 伤也可引发神经变性。神经变性的迹象甚至在痴呆、癫痫、各种精神病症中都可发现，而且 也是正常老化过程的一部份。
[0004] 无论根本原因是什么，越来越多证据表明，一旦引发神经变性，所有这些病症的结 局始终相同 神经细胞的最终死亡。
[0005] 中风涉及由通向大脑或大脑内的血管的阻塞（缺血性中风）或破裂（出血）导 致的急性神经变性（中枢神经系统神经细胞快速损耗并伴随功能丧失）。由于中风可以引 起永久性神经损害、全身并发症和甚至死亡，因此中风通常构成医疗急诊。在美国和欧洲， 中风是成人致残的主要原因，也是世界范围内的第二死因。在美国，每十五人中有超过一 人死于中风，而且中风在所有死因中排名第三，仅次于心脏病和癌症（美国心脏协会，心脏 疾病与中风统计资料_ 2009年更新版，美国德州达拉斯：美国心脏协会；2009 ;R〇sam〇nd 等，心脏疾病与中风统计资料-2007年更新版：来自美国心脏协会统计委员会和中风统计 小组委员会的报告，Circulation，2007 ;115 :e69-el71)。每三次中风就有一个致死结果 (.H聂tie.illl等，Risk factors of stroke incidence and mortality,A 12-year follow-up of the Oslo Study，Stroke，199324(10;1484-0)。65 岁以下的所有死亡中有约 6%和 65 岁以上的所有死亡中有10%是由于中风（Donnan等，Stroke，Lancet，2008;317(9624): 1612-23)。因此统计数据证明了对于许多中风受害者来说，严重致残是不幸但却太过频繁 发生的结果。实际上，中风是用于长期成人护理的住院患者医保理赔的第一原因。在美国 和其他主要工业国，与中风治疗和康复相关的总成本现已超过每年4500万美元，并且毫无 疑问地持续促成医保成本的总体增加。
[0006] 缺血性中风是最常见的中风形式，占所有中风的超过80%。缺血性中风由动脉堵 塞引起，而动脉堵塞通常是因为血栓形成或者不太常见地是因为栓塞。发作通常是突发性 的，并且通常接着发生局部神经功能缺损。约20%的患者在数天内死亡，特别是如果梗塞很 大的话。另外10%的患者在初次中风的数周内死亡。不幸地是，存活者通常严重致残。取 决于受影响的脑部面积，症状包括单侧面部或肢体虚弱和感觉障碍以和认知和语言障碍。 受影响的脑部面积越大，越多的功能可能受损。一些功能改善可在数天内开始出现，并且 常见在数月期间进一步恢复。然而，恢复的程度是不可预期的，并且通常是不完全的。根 据美国中风协会，中风存活者中有15%至30%的人永久致残，20%的人在发作后需要三个 月的机构护理（Harmsen 等，Long-term risk factors for stroke: twenty-eight years of follow-up of 7457 middle-aged men in G〇teb〇rg, Sweden, Stroke, 2006 ；37 (7)： 1663-7)〇
[0007]缺血性中风导致核心病变（core lesion)和周围的半暗带（penumbra)，在核心病 变内的神经细胞在数分钟内缺氧而死亡，周围的半暗带接收到一些血流因而接收到一些氧 气，但仍少于正常情况。在缺血半暗带中，细胞死亡进行得较为缓慢，一般在数小时内死亡， 并且由多变性缺氧症（variable anoxia)和缺血级联反应与所述核心病变内释放的谷氨酸 盐产生的毒性物质引起。因此目前的治疗干预主要着重于缓和中风半暗带中的有害情况。
[0008] 然而，用于急性缺血性中风的疗法仍然有限。
[0009] 由于脑损伤的发生是流向脑部的血液减少的结果，目前的疗法致力于通过溶解凝 块（血栓溶解）或者通过机械性地除去凝块（血栓切除术）来除去动脉堵塞。血流恢复越 快，脑细胞死亡越少，可以避免永久性后遗症的机会越大。
[0010] 目前，只有两种疗法在美国经FDA批准用于中风：
[0011] ?重组组织纤溶酶原活化剂（rt-PA ;Genentech)，溶解动脉凝块的药物；和
[0012] ?梅西恢复系统（Merci Retrieval System) (Concentric Medical Inc.)和 Penumbra系统（Penumbra Inc.)，机械性去除血栓的装置。
[0013] 上述所有治疗方法都具有主要限制。
[0014] 为求有效，使用溶栓剂的疗法必须在症状发作的3到4. 5小时内进行，这表示仅有 约3%的患有急性缺血性中风的患者接受有效的rt-PA治疗。此外，溶栓疗法具有实质上增 加的脑出血风险，这进一步限制了其在一些个体中的使用。
[0015] 基于上述理由，本领域中对于缓和和/或预防神经变性，特别是由缺血引起的神 经变性的安全且有效的疗法存在尚未得到满足而又迫切的需求。
[0016] 发明简沐
[0017] 因此，在一个实施方式中，本发明提供一种通过以下方法制备的异质性骨髓（BM) 细胞亚群，该方法包括：
[0018] a)从未处理的骨髓获得骨髓细胞群；
[0019] b)将骨髓细胞群以低密度接种在塑料表面上；
[0020] c)洗涤接种的细胞群以除去未附着的细胞；
[0021] d)在含血清的培养基中将附着的细胞群培养至接近汇合；
[0022] e)将培养的细胞群连续传代不超过约七次连续传代，其中，在每次传代时，以低密 度接种培养的细胞；和
[0023] f)获得异质性骨髓细胞亚群，其中有效量的异质性骨髓细胞亚群有效治疗神经变 性。
[0024] 在一个方面，有效量的异质性骨髓细胞亚群有效治疗由缺血引起的神经变性。
[0025] 在一个方面，异质性骨髓细胞亚群在含血清的培养基中培养。
[0026] 在一个方面，骨髓细胞群以约102_106个细胞/cm 2的密度接种。
[0027]在一个方面，在传代时，培养的细胞以约750个细胞/cm2或更小的密度接种。
[0028] 未处理的骨髓可以从没有使用任何调控细胞分裂的试剂预治疗的受试者获得，所 述试剂例如是用于化疗的抗肿瘤药物，包括抗代谢药物，如5-氟尿嘧啶。
[0029] 在一个方面，异质性骨髓细胞亚群不能通过密度分离法如Fi coll?或Perco 11?梯 度或者通过ACK (铵-氯化物-钾）裂解液来分离。
[0030] 在本发明的进一步的方面，异质性骨髓细胞亚群进一步在由缺血引起的神经变性 的实验模型中测试，其中仅选择显示治疗神经变性的能力的那些细胞群。该由缺血引起的 神经变性的实验模型可以是氧/葡萄糖剥夺（0GD)细胞培养模型或中风动物模型。在一个 方面，该实验模型可以是氧/葡萄糖剥夺（0GD)细胞培养模型和随后的中风动物模型。
[0031] 在另一个方面，在注射至血流中后，异质性亚群中的细胞迀移至神经变性位置。
[0032] 在一个方面，由缺血引起的神经变性是缺血性中风。
[0033] 在另一个实施方式中，本发明还提供一种治疗由缺血引起的神经变性的方法，包 括将上述异质性骨髓细胞亚群注射至患有神经变性的哺乳动物的血流中，其中异质性骨髓 细胞亚群的注射减少由神经变性造成的神经功能缺损。
[0034] 当神经变性由缺血性中风引起时，该方法可还包括用于增加通过阻塞血管的血流 的附加治疗，其中注射异质性骨髓细胞亚群与附加治疗的组合导致比单独的附加治疗或者 注射异质性骨髓细胞亚群但不使用附加治疗后的神经功能缺损的更大减少。
[0035] 在一个方面，用于增加通过阻塞血管的血流的附加治疗与注射异质性骨髓细胞亚 群同时进行。
[0036] 在另一个方面，在注射异质性骨髓细胞亚群前，进行用于增加通过阻塞血管的血 流的附加治疗。
[0037] 当神经变性由缺血性中风引起时，血管可以被血块阻塞。血块可以由动脉粥样硬 化斑块的破裂产生。
[0038] 当神经变性由缺血性中风引起时，用于增加通过阻塞血管的血流的附加治疗可包 括施用溶栓剂。溶栓剂可以是链激酶、尿激酶和重组组织纤溶酶原活化剂中的至少一个。而 且，该重组组织纤溶酶原活化剂可以是阿替普酶、瑞替普酶、去氨普酶或替奈普酶。
[0039] 在另一个方面，当神经变性由缺血性中风引起时，用于增加通过阻塞血管的血流 的附加治疗可包括从阻塞血管机械性除去血块。
[0040] 在进一步的方面中，可以使用过滤器捕捉血块。
[0041] 在另一个方面，当神经变性由缺血性中风引起时，用于增加通过阻塞血管的血流 的附加治疗可包括进行血管成形术和/或血管支架手术。
[0042] 异质性骨髓细胞亚群可以通过静脉、动脉（例如注射至颈动脉中）或脑内注射。
[0043] 在另一个实施方式中，本发明还提供一种治疗由缺血引起的神经变性的方法，包 括将异质性骨髓细胞亚群注射至患有由缺血引起的神经变性的哺乳动物的血流中，其中异 质性骨髓细胞亚群的注射减少由缺血引起的梗塞的体积。
[0044] 当神经变性由缺血性中风引起时，该方法可还包括用于增加通过阻塞血管的血流 的附加治疗，其中注射异质性骨髓细胞亚群与附加治疗的组合导致比单独的附加治疗或者 注射异质性骨髓细胞亚群但不使用附加治疗后的梗塞体积的更大减少。
[0045] 在一个方面，当神经变性由缺血性中风引起时，所述用于增加通过阻塞血管的血 流的附加治疗包括施用溶栓剂。溶栓剂可以是链激酶、尿激酶和重组组织纤溶酶原活化剂 中的至少一个。而且，重组组织纤溶酶原活化剂可以是阿替普酶、瑞替普酶、去氨普酶或替 奈普酶。
[0046] 在另一个方面，当神经变性由缺血性中风引起时，用于增加通过阻塞血管的血流 的附加治疗可包括进行血管成形术和/或支架手术。
[0047] 在另一个方面，当神经变性由缺血性中风引起时，用于增加通过阻塞血管的