脑切片制备
[0176] 脑切片制备旨在鉴定脑损伤区域。在MCA阻塞后7天或28天，使大鼠安乐死，使 用盐水，然后是4%的聚甲醛，通过跨心脏灌注来灌注大鼠。然后将脑固定在4%的聚甲醛 中，接着浸渍在25 %蔗糖中。将每个前脑切成30 y m厚的冠状组织切片，其具有对应于每只 动物从前囱5. 2mm至前囱-8. 8mm的前后坐标。
[0177] 测量梗塞体积
[0178] 处理每个大脑至少4个冠状组织切片，以用于苏木精与曙红（H&E)或尼氏染色法。 使用其中从对侧半球面积中减去同侧半球的未受损面积的间接的病变区域来显示脑梗塞。
[0179] 病变体积表现为病变与对侧半球相比较的体积百分比。病变体积的组织学测定使 用苏木精与曙红（H&E)或尼氏染色法，以及经由NIH Image J软件数字捕捉并处理代表性 图像，并进行量化图像分析来进行。根据以下公式测定病变体积：
[0180] 切片厚度X所有脑切片中梗塞面积之和。
[0181]为最小化梗塞面积中由缺血后水肿所产生的人为因素（artifact)，通过从对侧半 球的未受损总面积中减去同侧半球中的非梗塞面积来间接测量同侧半球中的梗塞面积。
[0182] 测量缺血性外围梗塞区中的细胞存活
[0183] 使用随机选择的对应于皮质外围梗塞区的高倍视野来计数该缺血区域中存活的 细胞（见Yasuhara等，Stem Cells and Dev，2009)。为估算缺血皮质区域内的宿主神经 细胞活力，使用结晶紫溶液（Sigma，St. Louis，M0)进行尼氏染色，并用相机（Carl Zeiss， Axi〇ph〇t2)捕获3个切片中的皮质区域和对应的对侧未受损皮质中的随机选择的视野， 并通过计数随机选择的高倍视野（28, 800 ym2)中的细胞来测定细胞数量。计算受损皮质 中保存的神经元相对于未受损侧的百分比，并将其用于统计学分析。对脑切片进行盲编码 (blind-coded)，并使用Abercrombie公式校正所计数的染色细胞总数。
[0184] 使用MCA0中风动物模型筛选候选骨髓细胞群
[0185] 使3只（用于IV施用）或6只（用于ICA施用）雄性大鼠/组经受1小时暂时 性MCA0,然后对其注射含有盐水或根据上述方案分离的7. 5x 106个源自骨髓的细胞（称为 NCS-01细胞群）的lml注射介质。施用细胞后，随访动物直至7天。
[0186] 图1C和1D示出了当施用于患有暂时性MCA0的大鼠中时，IV或ICA施用的NCS-01 骨髓细胞群提供了实质性的神经学或病理学益处。而且，NCS-01通过治疗缺血诱导的神经 变性，从而减少梗塞体积并改善神经功能缺损来预防宿主细胞死亡。
[0187] 重复初步体外筛选和二次体内筛选程序直到方法可靠且可再现地产生能够治疗 神经变性的最佳源自骨髓的细胞亚群（称为NCS-01细胞群）。
[0188] 在体外0⑶模型中再次测试优化的NCS-01细胞群来确认在与人神经元和星形胶 质细胞共培养物中的抗神经变性活性（参见图1E)，并在大鼠MCA0模型中再次体内测试 (参见图1F)。图1F描述的实验也示出NCS-01细胞群治疗神经变性的能力是剂量依赖性 的。
[0189] 实施例2 :用于产生能治疗神经变性的NCS-01细胞群的标准化生产程序
[0190] 从未使用任何抗有丝分裂剂或抗代谢剂如5-氟尿嘧啶（5-FU)预治疗的哺乳动物 收获未处理的全骨髓。由于不通过密度分离法或ACK裂解来处理骨髓，起始全骨髓细胞群 可包括造血细胞和非造血细胞以及成核骨髓细胞和非成核骨髓细胞二者。
[0191] 稀释上述未处理的骨髓，并以低密度（105~10 6个细胞/cm2)接种在组织/细胞 培养塑料表面上，并在含血清的培养基（补充有211116111丨3|&^(111￥；[1：1'0〖611)和10%胎牛血 清$85，办(：10116或6180))的<1-]\^]\1(不含酚红）或者补充有21111611^3]\&?(11^1廿(^611) 和10%胎牛血清（FBS，HyClone或GIBC0)的a-MEM(Mediatech))的存在下培养。然后将 细胞培养物在37°C、5% C02、80% RH(相对湿度）下培养72小时。
[0192] 使用D-PBS冲洗细胞以从细胞培养塑料上除去未附着的细胞和RBC，接着使用完 全培养基替换经补充的a-MEM，该完全培养基用于所有后续喂养。然后将细胞培养物（第 〇次传代或P〇)在37°C、5% C02、80% RH下培养。
[0193] 对于第1次传代，使用D-PBS冲洗细胞，使用细胞分离剂使塑料附着细胞脱离。通 过在300g(~lOOOrpm)离心8-10分钟来收获分离的细胞。使用经补充的a -MEM来再悬 浮沉淀细胞，并以约750个细胞/cm2的密度将其接种在组织/细胞培养塑料表面上。
[0194] 在额外传代之前，将细胞培养至接近汇合。
[0195] 收获细胞，并再次如上所述以约750个细胞/cm2的密度将其接种在组织/细胞培 养塑料表面上以进行第2次传代。
[0196] 对于第3次传代，如上所述使用细胞分离剂和离心来收获细胞。然后再悬浮沉淀 细胞并将其集中。将细胞再悬浮在冷藏保存培养基中，并将lml细胞悬浮液分装在冷冻管 中（Nunc)。使用控制速度的冷冻机冷冻小瓶，一旦冷冻程序完成，将小瓶移至干冰上以在气 相液氮冷冻器中永久保存。
[0197] 含有第3次传代（p3)的细胞的小瓶构成MCB。
[0198] 解冻一个MCB小瓶，以约750个细胞/cm2的密度将在补充有10%FBS与GlutaMAX? 的a -MEM中的复原细胞（第4次传代或p4)接种在组织/细胞培养塑料上。然后将细胞 在 37°C、5% C02、80% RH 下培养。
[0199] 对于第4次传代，在额外传代之前，将细胞培养至接近汇合。如上所述收获细胞并 将其接种在新的组织/细胞培养塑料表面上。
[0200] 对于第5次传代，依照上述针对MCB的方法收获并冷冻细胞。分装在小瓶中并在 第5次传代（p5)时冷藏保存的细胞构成WCB。
[0201] 需要时，解冻一个WCB小瓶，以约750个细胞/cm2的密度将补充有10% FBS与 61此&麻乂1￥的€[-|^11中的复原细胞接种在组织/细胞培养塑料上。然后将细胞在37°(：、 5% C02、80% RH 下培养。
[0202] 对于第6次传代，在额外传代之前，将细胞培养至接近汇合。如上所述，收获细胞 并将其接种在新的组织/细胞培养塑料表面上。
[0203] 在传代中途改变培养基（WCB到第6次传代和第6次传代和第7次传代）。
[0204] 对于第7次传代，依照上述针对MCB的方法收获并冷冻细胞。实施例3 :使用 NCS-01细胞治疗由永久性对比暂时性大脑中动脉阻塞（MCA0)引起的神经变性
[0205] 比较经NCS-01处理的永久性MCA0大鼠与经NCS-01处理的暂时性（60分钟）MCA0 大鼠的梗塞体积和神经功能。
[0206] 暂时性MCA0模拟使用恢复流向中风半暗带的血流的现有标准临床程序治疗由中 风引起的动脉阻塞。这些程序包括施用溶栓剂以及涉及机械性除去血块的程序如血管成形 术和/或血管支架。
[0207] 使3只或6只大鼠的组经受永久性或暂时性MCA0(使用再灌注）。然后在缺血后 24小时ICA施用lml盐水或lml的7. 5x 106个NCS-01细胞，并监测大鼠直至28天。然后 使用改良Bederson神经测试法评估神经功能。暂时性阻塞模型模拟其中经tPA治疗或经 受凝块除去的中风患者的情形。
[0208] 图2结果示出在两种MCA0范例中使用NCS-01细胞群处理的显著组织学益处（梗 塞体积；A图）和临床益处（改良Bederson评量；B图）。暂时性阻塞模型中的益处比永 久性阻塞模型中的益处高出2倍至3倍。神经响应的时间时程（B图）示出在梗塞后高达 28天的稳定改善，在这个时段期间，未再灌注（永久性阻塞）且未经处理的对照平均改善 11 %，而再灌注（暂时性阻塞）且经NCS-01处理的动物平均改善67%。
[0209] 预料不到的是，NCS-01在暂时性阻塞模型中更有效地治疗症状，这启示当加入 NCS-01与除去凝块（无论是施用溶栓剂后，还是使用机械装置除去凝块后）结合时可获得 最大效果。
[0210] 实施例4 :NCS-01细胞与其他源自骨髓的细胞之间的比较
[0211] 1)根据Li等分离骨髓细胞群
[0212] 如 Li 等的出版物（Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism(2000)20:131 1-1319)所述正确制备骨髓细胞群（下文称Li骨髓细胞群）。
[0213] 从在收获前2天接受腹腔内注射抗代谢药物5-氟尿嘧啶（5-FU，150mg/kg)的成 年小鼠获得初级培养的骨髓细胞（Randall和Weissman，1997)。使用连接到含有磷酸盐缓 冲盐水（PBS，0. 5mL)的lmL针筒的21号针从胫骨和股骨无菌收获新鲜的完整骨髓。机械性 分离骨髓直到形成牛奶状均质单细胞悬浮液。使用0. 84% NH4C1从骨髓中除去红细胞，并 使用血细胞计数器测定成核骨髓细胞数量。将2xl06个成核细胞在补充有胎牛血清（10% ) 的伊思考夫改良杜尔贝可培养基中接种在组织培养烧瓶中。孵育3天后，细胞紧密附着在 塑料上，使细胞再悬浮于新烧瓶中的新鲜伊思考夫改良杜尔贝可培养基中，并使细胞生长 以用于进行另外三次传代。
[0214] 2)在体外0GD分析中比较Li细胞群与NCS-01细胞群
[0215] 从同一 MCB和骨髓的不同WCB制造两批NCS-01，并将其与Li细胞群在图3概述的 体外0GD模型中一起测试。
[0216] 如图4所示，两批NCS-01细胞都在IL-6和bFGF二者的分泌中产生相同的增加。 因此，使用上述优化的生产程序产生的NCS-01细胞群在体外0⑶分析中一致地治疗神经变 性。
[0217] 相比之下，如Li (2002)出版物中所述正确分离的Li细胞群在0⑶分析中产生比 NCS-01细胞群少4-5倍的bFGF和IL-6。
[0218] 2)在体内MCA0分析中比较Li细胞群与NCS-01细胞群
[0219] 使用MCA0大鼠模型体内测试NCS-01细胞群和Li细胞群体内治疗神经变性的能 力。图5A和5B中示出细胞对宿主细胞活力、梗塞体积和神经功能缺损的影响。与上述研 究一致，NCS-01细胞群通过治疗缺血诱导的神经变性，从而减少梗塞体积并改善神经功能 缺损（参见图5B)来预防宿主细胞死亡（参见图5A)。