专利名称：神经细胞分化方法
技术领域：
本发明涉及在体外从多能细胞，特别是ES细胞产生神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元。
背景长久以来就已经知道多能细胞如胚胎癌性(EC)细胞和胚胎干(ES)细胞可以在体外分化成神经元。原则上，用ES细胞可以产生分离所选分化阶段的细胞和表征神经元前体的可能性。ES细胞方便了体外分子和遗传发育途径的研究，并且也是用于移植到脑中以治疗神经疾病的细胞的潜在来源。
然而，这些和其他应用已经受到培养物中神经元发育的不均一性、无组织的和经常不可再现的性质的阻碍。细胞不均一性是使用ES细胞产生神经细胞中的巨大问题(综述见参考文献3，4)。通常，来自ES细胞的神经元培养物含有多种不同的神经元亚型以及非神经元细胞，包括神经胶质细胞。缺少足够多数目的具有确定和均一的表型的细胞是神经生物学中的主要困难。从ES细胞产生神经元的方法没有一种可以导致一致数目的神经元或者它们的确定群体，从而不能以足够的量得到均一的细胞群体以使用生物化学方法表征脑神经元。而且，神经元与它们的直接前体的谱系关系仍然不清楚。
关于使用ES细胞来源的神经元用于移植，希望得到能够产生已知的后代的确定的祖细胞，而不是细胞的混合物，该混合物包括可以继续分裂和形成肿瘤的某些细胞(参考文献3，4)。异源细胞也可以干扰来自宿主组织的营养信号和/或引导信号，该信号促进移植的组织整合到脑中。植入的细胞类型是功能上重要的，例如，尤其需要多巴胺能神经元来治疗诸如帕金森病的疾病，因此，此类医学应用需要对产生的前体和神经细胞亚型增强控制。需要减小细胞不均一性来减小不希望的副作用，降低肿瘤风险；和通过增加具有所希望的神经元谱系的细胞的比例来提高治疗潜力。
最近，通过使用诱导信号和转录因子大量地富集神经元亚型，尤其包括多巴胺能神经元和运动神经元，已经取得了进步。从而，转录因子，像Nurr1(参考文献5)或者与干细胞与其他类型的共同培养物(参考文献6)显著增加了多巴胺能神经元的产生，而加入外在因子，包括Shh蛋白(sonichedgehog)，增加了运动神经元的产生，运动神经元在移植后也显示出整合到宿主组织中(参考文献7)。但是尽管取得了这些进步，但是对于可以产生特定神经元表型的确定的神经元前体的体外产生仍然知之甚少。
有许多不同的方案描述神经元和神经胶质细胞的产生(参考文献14、15、25-31)。如以前用胚胎癌性细胞系P19实现的，用视黄酸处理多能细胞团块引起神经元分化(参考文献32)。随后，已经观察到用RA处理ES细胞来源的胚状体(EB)也促进神经基因表达并且抑制中胚层基因表达(参考文献33)。EB是ES细胞聚集和增殖产生的三维团聚体。通过在ES细胞不能贴壁的基质上，通常在细菌培养皿上培养ES细胞可以产生EB(见例如，参考文献41)。
如Bain等人(参考文献14)和Li等人(参考文献10)例证的，用于从ES细胞产生神经细胞的一种方法包括步骤培养ES细胞；形成EB；将EB与视黄酸(RA)接触；解离EB；和平板接种并培养所解离的EB细胞。
通常，最初的ES细胞培养在饲养细胞层支持体(灭活的成纤维细胞)上进行以使ES细胞保持在多能未分化的ES细胞集落形式中。认为成纤维细胞维持ES细胞的未分化状态。在培养基中可以包括白血病抑制因子(LIF)以抑制分化。然而，已经观察到即使在LIF的存在下，一些ES细胞也倾向于分化并且在EB形成期间，可以观察到不同谱系的细胞(参考文献3，34)。
在Bain等人和Li等人(参考文献10，14，15)描述的方法中，将培养的ES细胞用胰蛋白酶处理和/或研磨成小团块，然后将其接种在非贴壁的细胞培养物中用于EB形成。细胞在没有RA的条件下培养4天，然后在培养基中加入RA培养4天，之后将EB解离并接种在层粘连蛋白包被的皿中。接种的细胞培养在含有血清的培养基中。
使用该方法，Bain等人报导产生了由紧密附着到层粘连蛋白包被的基质的扁平细胞群体和多数位于扁平细胞顶部的神经元样细胞群体组成的培养物。观察到约38％的细胞在2天培养后具有神经元样形态。这些培养物是由多种类型的神经元，特别是γ-氨基丁酸能神经元组成的混合组分。
一些方法已经利用了神经元前体的选择标记，从而除去了在分化步骤中不是神经元前体的细胞。从ES细胞产生的神经祖细胞已经多数通过中间丝标记如巢蛋白(参考文献9)或者通过转录因子如sox基因(参考文献10)的表达来限定。Li等人使用谱系选择通过除去Sox-2阴性细胞富集它们的异质细胞群体得到表达Sox2的细胞(参考文献10)。尽管选择方法已经被证明可用于富集神经元前体，但是可疑的是所选的前体是否可以用于产生确定的神经元表型。在Li等人中可得到的数据表明，如与确定的亚谱系相反，Sox阳性细胞可以产生在中枢神经系统(CNS)中发现的多数细胞类型。从而，尽管Sox-阳性细胞的选择可以增加ES细胞来源的群体中神经元前体细胞的比例，但是似乎这种选择不可能特别富集单一亚型的神经元前体或者神经元。
已经建立了不使用RA的其他方法。例如，用于Okabe等人(参考文献27，参考文献43)的方法不使用RA，但是包括在解离前在特别培养基中贴壁基质上培养所形成的EB的中间步骤。在Abe等人(参考文献30)中也使用了中间步骤，其中将培养的EB转移到基质上，它们可以附着到所述基质。然后将它们以贴壁状态培养，之后用胰蛋白酶解离。
一些方法，如Abe等人(参考文献30)和Okabe等人(参考文献27)的方法已经包括使用碱性成纤维细胞生长因子。Abe等人随后使用有丝分裂抑制剂，其导致神经元和非神经元细胞的死亡(参考文献30)。
本发明我们发现了这样的方法，通过该方法，ES细胞向神经细胞的分化可以优化以得到在产生确定的神经细胞谱系和神经细胞群体的均一性方面令人惊奇的优点。因此，本发明提供了诱导和/或促进ES细胞发育和/或分化成神经元或者神经元前体细胞或者祖细胞，以在体外从ES细胞产生神经细胞的改进方法。
在优选实施方案中，本发明的方法允许产生基本上均一的神经细胞群体，其中神经细胞基本上都是单一的确定的神经元谱系、表型、细胞类型和/或处于同一分化阶段。
如在本文别处详细描述的，我们设计了得到均一神经元前体的步骤，所述前体被鉴定为放射状神经胶质细胞。在随后培养中，ES细胞来源的放射状神经胶质细胞进行性地分化成锥体细胞。通过本发明的方法产生的前体和神经元基本上均一，与现有技术的方法相比，显示出单一谱系神经元细胞的更高的％产率。
从而，在更优选的实施方案中，本发明的方法可以产生放射状神经胶质细胞和锥形神经元的基本上纯的群体，其是在现有技术中使用ES细胞难以产生的皮质的最重要的神经元群体。
考虑到本发明产生的神经前体/祖细胞的高水平的均一性，这些细胞适于进一步分化和/或成熟以产生确定谱系的神经元细胞。前体/祖细胞可以分化以产生如本文所示的锥形神经元，或者可以通过外在或者内在因子操作以产生其他神经元群体。
本发明提供的细胞数目和均一性方面的优点与神经发生和神经细胞分化的现有技术方法产生的细胞和从小鼠或者大鼠脑可以制备的有限数目的原代神经元形成对比。
生物化学研究以前受到通过现有技术方法可以方便地产生的有限数目的神经细胞的阻碍。本发明方便了涉及神经细胞发育，特别涉及从神经前体向神经元细胞的过渡的生物化学和遗传学机理的研究。ES细胞可以容易地进行遗传学操作和以不受限制的数目产生，并且本发明理想地适于产生用于生物化学研究的大数目的确定谱系的神经元。
此外，由于ES细胞可以容易地进行遗传学操作或者从携带相关突变的小鼠分离，所以本发明方便了野生型和突变神经元的比较和导致神经变性疾病中特定细胞类型的损失的机理的鉴定。尽管ES细胞的遗传操作是容易的，但是原代神经元的操作是极端困难的，特别是稳定操作。ES细胞的遗传操作可以提供均一的经修饰的品系，其中整个子代含有相同的突变并且可以在一或者两个月内实现，而具有稳定突变的小鼠品系的建立可以花费数年。从而，通过提供在体外从ES细胞产生前体、祖细胞和神经元细胞的方法，本发明避免了对建立转基因小鼠品系的需要，从而允许在以前不现实的水平上研究突变神经元。
本发明的方法还提供了神经元的细胞测定系统(例如，轴突延长、神经细胞死亡、神经发生和突触发生)。此类测定法是本领域需要的，但是它们的用途和性能受到限制，因为不能以足够量方便地产生神经元。本发明使得比以前以更大量和更高均一性产生神经元，从而使得可以进行神经元测定。
本发明产生的神经元和/或神经元前体/祖细胞也适于医学应用，如植入脑中以治疗神经变性疾病或者神经元损失。由于通过本发明产生的所希望的亚型的神经细胞的更大的均一性，治疗的治疗潜力得到提高并且植入后肿瘤的风险减小。
发明详述本发明涉及产生或生成神经细胞，例如，神经元和/或神经元前体/祖细胞、促进或者诱导ES细胞向神经元前体细胞或者祖细胞的分化的方法，还涉及促进或者诱导前体或者祖细胞向神经元分化或者成熟的方法。
本发明涉及诱导和/或促进胚胎干(ES)细胞向神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元的发育和/或分化，和/或产生或者生成神经细胞的体外方法，该方法包括培养ES细胞；形成胚状体(EB)；将EB与视黄酸(RA)接触；和解离EB；组合下文描述的一种或多种进一步的特征或者步骤。
在本发明方法中，解离的EB细胞是神经元前体细胞或者神经元祖细胞。从而，EB的解离可以产生神经元前体细胞或者祖细胞的培养物。
任选地，该方法还包括平板接种解离的EB细胞，从而得到神经元前体细胞或者祖细胞的平板接种的培养物。
该方法可以包括培养神经元前体细胞或者祖细胞以产生神经元。从而，在本发明的一些实施方案中，包括平板接种并培养解离的EB细胞以产生神经元。
本发明的方法还包括如下述的一种或多种特征/步骤。除非上下文中指出，任意特征或者步骤可以单独使用或者与任意其他特征或者步骤组合使用。
无饲养细胞的ES细胞培养优选地，该方法包括不存在饲养细胞(通常是灭活的成纤维细胞)的条件下培养ES细胞。方法可以包括最初用饲养细胞培养ES细胞，然后不用饲养细胞进行培养。饲养细胞可以通过ES细胞的反复传代稀释或者除去。优选在胚状体形成之前进行没有饲养细胞情况下的至少一次，更优选至少两次传代。从而，饲养细胞优选缺席用于EB形成的ES细胞培养。“传代”包括解离细胞，并将许多细胞再次平板接种。例如，传代可以包括从培养皿(通常使用胰蛋白酶)脱离/解离细胞，解离细胞的团聚体并再次平板接种许多解离的ES细胞(贴壁培养物)并培养ES细胞。
合适的培养基在本文别处描述。在ES细胞培养基中可以任选包括白血病抑制因子(LIF)。
用于EB形成的ES细胞的选择和平板接种我们已经认识到ES细胞的增殖状态影响它们的多能性，并且该方法中接种的细胞的密度对它们分化的能力和倾向有影响。我们已经发现通过选择和以受控的细胞密度接种增殖的ES细胞，可以得到具有确定的细胞谱系的更多神经元前体并且产生更少的不均一性细胞。
优选地，本发明的方法包括选择高增殖性和/或形态上均一的ES细胞用于EB形成。优选地，方法包括平板接种经测量/估计/确定/决定数目或者密度的所述ES细胞用于EB形成。优选地，该方法包括选择经测量、估计、确定或者决定数目的ES细胞用于平板接种以产生EB。
该方法优选包括测量、估计、观察或者决定ES细胞的增殖状态(其可以通过确定倍增时间、细胞数目的增加或者任何其他合适的度量来测量和估计)；ES细胞的形态；和/或平板接种用于EB形成的ES细胞的数目或者密度。
从而，优选地，将细胞以测量的、估计的或者确定的密度平板接种。细胞数目的测量、估计或者确定可以通过本领域已知的任一方法来进行，例如，包括在显微镜下对给定区域中的细胞计数，或者使用常规细胞计数器，如Casy1(Scharfe System GmbH)。通过显微镜观察可以观察到细胞形态。
在下面更详细地讨论这些方面的每一方面。
高增殖性细胞的产生和选择高增殖性细胞可以是通过如本文描述的特定培养方法产生的细胞。我们已经发现通过培养ES细胞的方法可以改变ES细胞的增殖状态。
ES细胞培养或者传代优选产生高增殖性细胞。优选地，传代约每2天重复，ES细胞培养优选包含在饲养细胞上至少两次传代，接着是没有饲养细胞时至少两次传代。ES细胞应该在高增殖状态中除去饲养细胞，例如，通过将饲养细胞上的ES细胞的10cm培养皿分裂培养并在没有饲养细胞的情况下再次平板接种(例如，取1/4体积的细胞悬浮液并在最初体积的培养基中再次平板接种)将在第二天再次得到60％汇合的ES细胞培养物。不用饲养细胞进行的传代可以包括平板接种约0.5×105个细胞/cm2。
优选地，培养ES细胞包括测量、估计或者确定用于ES细胞培养而接种的细胞的数目或者密度。
高增殖性细胞可以是基本上如下(基本上无饲养细胞)培养或者传代ES细胞而产生的ES细胞以约0.3×105到4×105个细胞/cm2的密度，例如，约0.5-2×105，优选约1×105个细胞/cm2的密度平板接种ES细胞；并在平板接种后2天回收/解离ES细胞，和任选地再次平板接种。
应该在平板接种后2天通过分裂(解离)回收ES细胞。通常，该培养步骤(传代)应该进行至少2次或者3次，然后选择高增殖性细胞用于EB形成。
例如，可以将约2×106个细胞平板接种在10cm2细胞培养皿中。上面的步骤通常使得在2天后回收10×106到35×106个细胞/10cm2，例如，10-20×106个。
可以按照ES细胞的倍增时间测量增殖状态。本发明的方法可以包括测量ES细胞的倍增时间，并选择高增殖性细胞。例如，高增殖性细胞可以具有8小时或者更短、16小时或者更短、或者24小时或者更短，通常8到24小时的倍增时间。
形态特征用于EB形成的ES细胞优选是形态上均一的，其中所有或者基本上所有ES细胞都具有相同或者相似的形态特征。
优选地，本发明的方法包括选择用于EB形成的形态上均一的ES细胞，并平板接种那些细胞用于EB形成。优选地，选择用于EB形成的所有或者基本上所有(例如，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或者至少99％)ES细胞具有一种或多种，并且最优选地所有下面的形态特征(无饲养细胞的条件下培养)以扁平单层生长；邻近细胞不相互直接接触(但是仍然稠密叠积)；大核；许多核仁；细胞不在相互的上方生长或者以集落样形式生长。优选地，细胞稠密叠积，例如，细胞的密度为每10cm2培养皿约20×106个细胞(2×106个细胞/cm2)，优选密度为每10cm2培养皿约10-30×106个细胞，例如，15-25×106个细胞。该方法可以包括观察ES细胞的一种或多种优选的形态特征，和/或选择具有一种或多种这些特征的细胞。
细胞形态还可以用作增殖状态的指示剂。高增殖性细胞优选具有一种或多种，优选所有上面列出的形态特征。
优选地，所有培养的ES细胞都来自单个ES细胞，例如，该方法的早期步骤可以包括选择单个ES细胞集落并从该集落培养ES细胞。从而，可以增加培养物中ES细胞的均匀性和均一性，包括形态均一性。
平板接种密度对于EB形成，所产生的高增殖性细胞和/或形态上均一的细胞应该通常使用每15ml培养基约0.5×106到5×106个细胞，例如，15ml培养基中3×106个细胞接种用于EB形成。通常应该接种约0.3-3.5×105个细胞ml-1，优选1.6-2.5×105个细胞ml-1，最优选2×105个细胞ml-1。15ml培养基是优选的体积，尽管通常在10cm培养皿上可以使用10ml，或者10-15ml。
用于EB形成而平板接种的细胞的密度应该根据所用的ES细胞的增殖状态来调节。从而，如果ES细胞培养物更稠密，那么应该接种更多细胞，而如果培养物较不稠密，那么应该接种较少的细胞。我们已经发现使用多数快速增殖的ES细胞得到了最好的结果。
例如，可以选择具有约12-16小时的倍增时间的均一形态的ES细胞并以每cm2约0.5×105个细胞的密度平板接种。
细胞的解离一般在本发明的方法中，细胞的解离优选包括解离细胞(ES细胞或者EB)以形成单个细胞的悬浮液，其基本上缺少多于2或者3个细胞的团聚体。优选地，悬浮液完全是单个解离的细胞(即，悬浮液没有细胞团聚体)。优选地，悬浮液中的90％、95％、98％或者99％的细胞是单个解离的。优选地，悬浮液中少于5％的细胞形成4个或者更多细胞的团聚体。
使用本文别处详述的方法，胰蛋白酶(例如，0.05％)和/或研磨可以用于解离细胞。
ES细胞在平板接种用于EB形成之前应该是良好解离的。从而，优选地，本发明的方法包括解离ES细胞以形成单个细胞的悬浮液，其基本上缺少多于2个或3个细胞的团聚体。优选地，悬浮液完全是单个解离的细胞(即，悬浮液没有细胞团聚体)。优选地，悬浮液中的90％、95％、98％或者99％的细胞是单个解离的。优选地，悬浮液中少于5％的细胞形成4个或者更多细胞的团聚体。
本发明的方法可以包括确定或者估计ES细胞的解离水平。优选地，方法包括解离ES细胞并根据本发明选择解离细胞的悬浮液。显微镜观察或者常规细胞计数器可以用于确定或者估计解离程度。例如，使用Casy1细胞计数器，如果存在团聚体，那么就检测到更大直径的细胞峰。
EB细胞的直接解离EB以悬浮培养，然后解离EB细胞，产生解离的EB细胞的悬浮液。通常，EB在8天后解离，即在用于EB形成的细胞平板接种后第8天，或者在加入RA后4天。解离可以在这之前或者之后进行，但是通常在加入RA后3到5天进行。本领域技术人员能够通过实验确定最佳的解离时间。
优选地，EB在解离之前不平板接种在贴壁的基质上，而是保持在非贴壁的培养物中直到细胞解离。从而，EB应该优选在接种之前解离而不是直接平板接种。
EB的解离通常包括将EB与胰蛋白酶(通常0.05％，或者0.01-0.5％)温育。优选地，本发明的方法包括过滤解离的EB的悬浮液以除去细胞团块，例如，细胞可以通过网孔或者过滤器过滤，通常用尼龙网孔或者过滤器过滤。通常，使用40μm细胞网孔或者过滤器。在本发明的实施方案中，孔或者网孔直径优选为至少20、30或者40μm，更优选为100、80、60或者50μm或者更小。
EB细胞的保存本发明的方法可以包括保存解离的EB细胞，例如，在液氮中冷冻细胞。例如，保存可以包括离心细胞，离心后在EB培养基+10％DMSO中重悬浮细胞，并用液氮冷冻细胞。从而，在一些实施方案中，该方法包括解离EB，并保存解离的EB细胞。从而可以得到神经前体的方便的、容易的供应。
冷冻的原种当需要时可以解冻，例如，用于平板接种和培养产生神经元。保存此类前体用于以后使用的可能性以前还没有在本领域中公布。通常，将细胞解冻并且在解冻后立即重悬浮在培养基，通常10ml N2培养基中，离心(通常以1000转/分钟在室温下离心5分钟)，并重悬浮(通常在N2培养基中)。
解离的EB细胞的平板接种密度在其中接种EB细胞的方面，我们已经发现EB细胞的接种密度对于细胞存活和分化是重要的。接种太稀减小细胞存活，而接种太密不利地影响分化的速度。接种的密度也影响培养物的纯度，即，非神经元细胞对比神经元细胞的量。优选地，应该接种约0.5×105到2.5×105个解离的EB细胞/cm2，例如，约1-2×105，最优选约1到1.5×105个细胞/cm2。
本发明的方法可以包括使用本文描述的方法测量、估计或者确定接种的EB细胞的数目或者密度。
培养基的更换我们已经观察到，如果在平板接种解离的EB细胞后约2小时更换培养基，那么实现细胞存活率的明显的很大增加。该发现使得可能产生长期神经元培养物，其直到现在在本领域还是罕见的。
在该上下文中，更换培养基是指更新或者替换培养基。新培养基优选与所解离的EB细胞最初或者以前接种的培养基具有相同组成，即，使用相同类型的培养基。可以使用相似组成的培养基，但是优选地，组成与以前使用的相同。例如，培养基可以是N2培养基。
因此，本发明的方法优选包括解离EB后更换培养基并将解离的EB细胞在培养基中接种。优选地，在接种后约1到6小时更换培养基。
培养基可以在平板接种的6小时内更换，优选在接种的5、4、3或2.5小时内更换。在接种后至少约1小时、1.5小时或者2小时后更换培养基。
最优选地，在接种后约1到3小时，更优选地在约1.5到2.5小时，最优选地约2小时后更换培养基。
平板接种的解离的EB细胞的培养优选在N2培养基中接种解离的EB细胞。
2天后，优选将培养基更换成用于神经元分化的合适的培养基，如“完全培养基”(见实施例)。培养基的选择和组成可以取决于所希望的神经元谱系。例如，本文所用的完全培养基基于Brewer培养基并且设计成促进锥形神经元的发育。可以选择其他培养基或者因子来维持不同的神经元谱系，例如，Shh(Sonic hedgehog)来产生胆碱能运动神经元。
我们发现根据本发明产生的前体在植入鸡胚后能够分化成许多不同的特异神经元谱系，包括运动神经元。
在一些实施方案中，优选培养基不含有T3。本文所用的完全培养基是基于Brewer培养基，但是组分中省略T3。在FCS中发现的T3可能抑制神经元分化。
优选地，不使用神经基础培养基(Neurobasal medium)。神经基础培养基+B27添加物(都可以从GIBCO得到)通常在现有技术中用于神经元培养。然而，我们观察到神经基础培养基可以促进神经胶质细胞发育而不是神经元细胞发育。从而，使用神经基础培养基可以导致在所产生的神经元细胞中存在不希望的神经胶质细胞。相比，本文使用的完全培养基似乎抑制神经胶质细胞发育，有利于神经元发育。
优选地，平板接种的细胞(解离的EB细胞、神经元前体/祖细胞)在不存在血清的条件下培养，不在血清存在下培养。(血清可以用于在细胞解离后失活胰蛋白酶，但是应该之后例如通过离心沉淀细胞并基本上完全除去上清液来除去血清)。
优选地，生长因子(特别是EGF、FGF/bFGF和PDGF)不存在于培养基中并且不在这些和其他生长因子的存在下培养前体细胞或者祖细胞。
方法可以包括培养神经元，并且神经元也优选不在血清的存在下培养并且优选不在生长因子，特别是EGF、FGF/bFGF或PDGF的存在下培养。
此外，本发明的方法不需要并且优选不包括阳性或者阴性选择步骤，例如，Sox-2遗传选择，以富集神经细胞或者神经元，尽管如果希望，可以使用此类选择步骤。即使没有选择步骤，本发明的方法也基本上产生均一的神经细胞群体。优选地，本发明的方法不包括对非神经或者非神经元细胞类型(例如，分裂的细胞)进行阴性选择的步骤。优选地，本发明的方法不包括阳性选择以富集神经细胞或者神经元的步骤。已知的选择方法包括遗传选择，例如，对Sox-2阴性细胞进行Sox-2选择，和将细胞与阴性选择剂接触以抑制和/或杀死非神经或非神经元细胞，例如，将细胞与抗促分裂剂如AraC或者FRDU接触以抑制和/或杀死正分裂的细胞。
ES细胞胚胎干细胞是从哺乳动物胚泡的内细胞团分离的多能干细胞。用于本发明的胚胎干细胞可以来自任意哺乳动物，其可以是人或者非人，如豚鼠、大鼠、小鼠或者其他啮齿动物、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马或者灵长类动物，例如，猴。通常使用小鼠ES细胞。
在本发明中，ES细胞通常是多能细胞，不是全能细胞，并且不能产生生殖细胞。用于本文中实施例的ES细胞是多能的。任选地，可以使用全能ES细胞。
许多ES细胞系是本领域已知的并且可以用于本发明(例如，J1、E14)。
设计ES细胞以允许可以使用选择步骤，例如Sox2选择。
如本文别处描述的，用于本发明的ES细胞可以是靶定细胞系或者遗传操作的细胞系，该靶定细胞系或者遗传操作的细胞系含有导入的基因或者突变基因或者过表达内源基因。
可以使用包含有效连接启动子(例如，用于神经元特异的表达的启动子)的报道基因的ES细胞系。我们描述了本文的Tau-GFP细胞系的应用。Tau基因座的性质包括所插入的cDNA的高相关表达水平、高重组效率、仅在神经元中表达，并且Tau敲除者没有明显的表型。我们使用tau基因座插入将研究的cDNA。Tau可以容易地被多种cDNA置换，或者cDNA可以插入Tau基因座(从而它们的表达有效连接Tau启动子)，以快速建立在神经元中特异的高水平稳定表达(参考文献42)。
神经细胞如本文使用的，除非上下文中指出，神经细胞是神经系统的细胞，并且包括神经干细胞、神经元前体细胞或者祖细胞，和神经元(神经元细胞)。术语“神经元”和“神经元细胞”可以互换使用。
“干细胞”是指可以自身更新的任何细胞类型，如果它是多能的或者神经干细胞，那么可以产生神经系统中的所有细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。干细胞可以表达一种或多种下面的标记Oct-4；Sox1-3；时期专一的胚胎抗原(SSEA-1、-3和-4)(Tropepe等人，2001，Neuron 30，65-78)。神经干细胞可以表达一种或多种下面的标记巢蛋白；p75神经营养因子受体；Notch1、SSEA-1(Capela和Temple，2002，Neuron35，865-875)。
“神经祖细胞”是指神经干细胞的子细胞或者后代，与所述干细胞相比具有更分化的表型和/或更小的分化潜力。前体细胞是指在发育期间与神经元处于或不处于直接谱系的任意其他细胞，其在确定的环境条件下可以诱导而转分化或者再分化或者获得神经元表型。
“谱系”是指一种确定的细胞类型的子代或者从该细胞类型得到的细胞。“亚谱系”是指某种谱系的亚型。
标记的检测和细胞类型的鉴定本发明的方法优选产生细胞群体，其中至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的细胞是神经元前体/祖细胞，例如，放射状神经胶质细胞，或者神经元，例如，锥形神经元。方法优选包括鉴定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的细胞是神经元前体/祖细胞，例如，放射状神经胶质细胞，或者神经元，例如，锥形神经元。本发明的神经元细胞培养方法优选产生具有少于5％星形胶质细胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％的细胞群体。
如上述的本发明的方法优选为诸如实现这些比例。本发明提供了使用如上述的一个或多个方法步骤和特征实现、产生或者生成这些比例的细胞的方法。
本发明的方法可以包括鉴定解离的EB细胞为神经元前体，或者(下面接种的培养物)为神经元。该方法可以包括确定、观察或者证实至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的细胞并鉴定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的细胞是神经元前体/祖细胞，例如，放射状神经胶质细胞，或者神经元，例如，锥形神经元。通常，通过本文描述的神经元细胞培养方法产生的细胞中少于5％的细胞是星形胶质细胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％。
通过观察细胞形态，例如，通过显微镜检查可以确定细胞谱系和/或细胞类型。该方法可以包括至少在所产生的这些比例的细胞中观察神经元前体/祖细胞形态或者神经元细胞形态。神经元前体/祖细胞可以延长和/或具有两极纺锤体形态。通过观察神经元形态可以确定神经元谱系，例如，锥形神经元是三角形并且具有分枝的轴突延伸，而胆碱能神经元具有两极形态。
根据本发明的方法产生的细胞可以备选地或者额外地通过检测标记，通常被抗体识别的细胞表面标记来鉴定。该方法可以包括检测一种或多种标记的存在，其存在表明细胞是特定谱系或者亚谱系，或者特定细胞类型或者亚型。技术人员已知可以鉴定并且用作谱系或者细胞类型的指示的标记。
例如，本发明可以包括检测细胞上标记Pax6的存在并鉴定细胞为神经元前体，例如，放射状神经胶质细胞。可以检测的其他标记包括巢蛋白、RC2和BLBP，其存在于放射状神经胶质细胞上，和p75、GluR1、突触泡蛋白、Trk(例如，TrkA、TrkB、TrkC)和APP，其存在于某些神经元细胞上。
该方法可以包括检测高百分比的表达神经元前体标记的细胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的细胞，并鉴定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的细胞为神经元前体。
该方法可以包括检测高百分比的表达神经元前体标记的细胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的细胞，并鉴定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的细胞为神经元，优选确定谱系的神经元，例如，锥形神经元或者多巴胺能神经元。
从而，该方法可以产生神经元前体细胞或者神经元的基本上均一的群体。至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的细胞可以是相同类型/谱系或者亚型/谱系，例如，相同类型的神经元前体，例如，放射状神经胶质细胞或者相同谱系的神经元，如锥形神经元。
本文的实例提供了多种标记的表达的时间过程和随着时间的形态发展。本发明的方法可以包括在EB解离后(如实施例中指出)的某些时间检测标记和/或观察特定形态，例如，在EB解离后2天内观察神经元形态和/或在约7天后检测Trk受体的表达。例如，本文中阐明通过本发明的方法产生的约99％的细胞是放射状神经胶质细胞，如通过检测99％的解离的EB细胞的RC2+表达所指出。本文中还显示至少80％的神经元可以通过本发明的方法常规地产生，如通过在EB解离后约7天后测量vGLUT1和GFP的表达或者计数所指出。
百分比可以计算为表达核标记，例如DAPI或者Hoechst的％存活细胞或者％细胞。
EB的形成和用RA治疗一般在本发明的方法中，在培养基中形成并培养EB细胞。在EB形成和培养期间，通常每两天更换培养基。
通常，在本发明的方法中，在RA的存在下培养EB一天或者多天，通常2、3或者优选4天，或者多达5、6、7或者8天。在与RA接触前，可以最初在RA缺失下培养EB一天或多天，通常2到6天，通常2、3、或者优选4天，或者多达5天或者6天。Bain等人和Li等人使用了4-天/4+天的步骤。
技术人员可以选择合适浓度的RA。例如，浓度可以为例如至少0.25μM，至少0.5μM或者至少1μM。浓度可以为例如，10μM或者更小，7.5μM或者更小或者5μM或者更小。优选地，浓度为0.5到5μM(包括0.5和5μM)。例如，浓度可以为1μM或者5μM。
神经细胞测定本发明的其他方面提供了用神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞进行的细胞测定方法，所述细胞通常是体外产生的细胞(不是原代神经元)并且优选是本发明的方法产生的细胞。该测定方法可以包括如本文描述的本发明方法，其用于产生神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元。本发明的方法可以包括进行如本文描述的本发明的方法用于神经分化(产生神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元)，并且还包括本文描述的细胞测定方法的步骤。
从而，上面描述的神经分化方法可以用于测定法的上下文中。
此外，由于我们已经首次提供了神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的基本上均一的培养物/群体，所以本发明还提供了用神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的基本上均一的培养物/群体进行的测定方法，所述细胞可以是或者不是由本发明的神经分化方法产生，但是通常通过体外方法产生。
本发明的测定方法可以包括检测、定量、观察或者确定神经元前体细胞或者祖细胞，或者神经元的一种或多种特征(“神经元特征”)，例如，轴突生长或者轴突延长/退化、神经元形状、神经元细胞死亡、神经发生、神经元分化、电活性、突触发生和/或神经元细胞标记。
在一些实施方案中，本发明的测定方法可以包括用于产生神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的本文描述的神经分化方法，其中该方法还包括在测试条件下培养ES细胞和/或EB，并检测、定量、观察或者确定神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的一种或多种神经元特征。
在其他实施方案中，本发明的测定方法可以包括在测试条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；并检测、定量、观察或者确定细胞的一种或多种神经元特征。任选地，根据本文别处描述的神经分化方法可以产生和/或培养所述细胞。
测定方法可以任选包括比较在测试条件(“测试培养”)下的神经元特征与在第二种条件(“对照培养”)下培养的细胞的神经元特征，任选与从第二种条件下培养的细胞的组织学数据比较。方法可以包括在第二种条件下培养细胞。
从而，测定方法可以包括本文描述的神经分化方法，其用于产生神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞，所述方法包括在第一种和第二种条件下培养ES细胞或者EB细胞；并分别比较在第一种条件下培养的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的一种或多种神经元特征与在第二种条件下培养的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的一种或多种相同的神经元特征。
在测试条件或者第一种条件下培养可以包括将细胞与测试化合物接触或者将细胞暴露于测试化合物或者将细胞在测试化合物的存在下培养，测试化合物可以加入或者包括在培养基中。在第二种条件下培养可以包括在所述测试化合物不存在时培养，或者不将细胞接触或暴露于测试化合物。
测试化合物可以是任一分子或者可以来自测试化合物文库。在一些实施方案中，测试化合物是双链RNA(dsRNA)分子，并且在第一种或测试条件下培养包括将ES细胞或者EB细胞暴露于双链RNA分子从而通过RNA干扰(RNAi)抑制细胞中的基因。
已经发现dsRNA在基因沉默中比仅仅有义或者反义链更有效(Fire A.等人Nature，Vol 391，(1998))。dsRNA介导的沉默是基因特异的并且通常称作RNA干扰(RNAi)(也参见Fire(1999)Trends Genet.15358-363，Sharp(2001)Genes Dev.15485-490，Hammond等人(2001)Nature Rev.Genes 21110-1119和Tuschl(2001)Chem.Biochem.2239-245)。
RNA干扰是两步过程。首先，dsRNA在细胞内被切割产生长约21-23nt的短的干扰RNA(siRNA)，其具有5’末端磷酸和3’短突出端(-2nt)。siRNA靶定对应的mRNA序列特别用于破坏(Zamore P.D.Nature StructuralBiology，8，9，746-750，(2001)。
使用化学合成的具有3’-突出端的相同结构的siRNA双链体可以有效诱导RNAi(Zamore PD等人Cell，101，25-33，(2000))。已经证明，合成的siRNA双链体特异抑制多种哺乳动物细胞系中内源和异源基因的表达(Elbashir SM.等人Nature，411，494-498，(2001))。可以使用含有20到25bp，更优选21到23bp序列的siRNA双链体。
备选地，可以在体外(用于回收和利用)或体内产生siRNA。
在其他实施方案中，测试化合物可以是核酸(DNA、cDNA或者RNA)，任选地，编码基因，例如，cDNA。从而，测试化合物可以是编码基因的载体，其中将细胞暴露于核酸或者载体导致该基因在细胞中表达。在一个实施方案中，载体可以在有义和反义方向包含根据本发明的核酸序列，从而当作为RNA表达时，有义和反义部分将结合而形成双链RNA。这可以例如是长的双链RNA(例如，长于23nt)，其可以在细胞中被加工而产生siRNA用于RNAi(见例如，Myers(2003)Nature Biotechnology 21324-328)。
在其他实施方案中，测试化合物可以是抗体。
从而，测定方法可以鉴定增加或者减少目的特征的化合物或者条件。
通常用神经元细胞进行比较，例如，接种解离的EB细胞后一周进行比较。
测试和对照培养物通常是两种单独的培养物，它们在其他方面相同的条件下培养。当条件是存在测试化合物，特别当它是核酸时，在测试条件或者第一种条件下培养可以包括将细胞(特别是ES细胞或者解离的EB细胞)暴露于测试化合物然后培养细胞。
通过导致并允许神经元特异的报道基因表达，并检测或定量该报道基因的表达，可以检测神经元特征(例如，轴突生长或者轴突延长)。报道基因可以编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)。报道基因可以靶定或者有效连接神经元特异的基因座或者启动子(如tau基因座或者启动子)用于神经元特异的表达。已经描述了神经元特异的报道基因从tau基因座的表达(Tucker等人(42))。一旦细胞分化成神经元，报道基因的表达就被接通，并且仅在神经元，而不在神经系统的前体或者其他细胞类型中表达。包括神经元细胞测定法的本发明的方法可以使用含有报道基因的细胞系(ES细胞)，其具有神经元特异的表达，所述报道基因有效连接仅在神经元中表达的启动子或者基因座(例如，如本文别处描述的Tau-GFP细胞系)。
本发明还提供了用于鉴定抑制或者减小神经元特征的增加的试剂的方法，所述神经元特征的增加由已知增加所述特征或者与所述特征的增加有关的条件产生(例如，在一些实施方案中，其中该条件是在淀粉状蛋白β肽的存在下培养)，即，鉴定减小或者抑制与这种条件有关的效应的试剂。
这种测定法可以包括在试剂存在下并且在已知增加神经元特征或者与神经元特征有关的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；在所述试剂不存在并且在已知增加神经元特征的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；
定量或者测定神经元特征的水平；并比较存在试剂时的神经元特征的水平与不存在该试剂时神经元特征的水平；其中，与不存在试剂时相比，存在试剂时神经元特征的较低水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生或者与该条件相关的神经元特征的增加。
已知增加神经元特征或者与神经元特征的增加有关的条件可以是通过本发明的测定法鉴定为增加神经元特征的条件的条件。
例如，当测试化合物是核酸(例如，dsRNA)时，在已知增加神经元特征的条件下培养可以包括将细胞暴露于核酸然后培养细胞。
用试剂培养和在所述条件下培养可以同时进行，或者用试剂培养可以在所述条件下培养之前进行，或者在所述条件下培养可以在用试剂培养之前进行。技术人员可以确定合适的顺序，并且在一些实施方案中，一种顺序可以比另一种顺序优选。例如，细胞优选暴露于核酸，然后在试剂的存在下培养。
轴突延长或者退化本发明的方法可以包括定量轴突生长、轴突延长或者轴突退化。定量可以包括确定轴突特异性蛋白质的表达水平，其中较高的表达水平表明较高水平的轴突生长和/或轴突延长和/或较低水平的轴突退化，并且其中较低的表达水平表明较低水平的轴突生长和/或轴突延长和/或较高水平的轴突退化。定量可以包括导致或允许神经元特异的报道基因表达并测量报道基因的表达水平，从而定量轴突生长、轴突延长或者轴突退化。例如，当报道基因编码荧光蛋白，如GFP时，表达水平的测量包括测量荧光。本发明的方法可以包括定量轴突生长、轴突延长或者轴突退化，通过将神经元与针对轴突标记(如微管蛋白、神经丝、突触泡蛋白)的抗体接触，并测定或者定量结合所述标记的抗体，从而检测或者定量轴突生长或者延长来进行所述定量。
神经元与抗体接触可以在裂解细胞后，用细胞提取物进行(例如，在蛋白质印迹上)。备选地，可以将完整神经元接触抗体。
测定方法可以包括将神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞分别在第一和第二种条件下接触，并比较在第一种条件下培养的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞与在第二种条件下培养的神经元前体或者祖先或者神经元的轴突生长、延长或者退化。例如，当在第一种条件下培养的细胞中轴突生长、延长或者退化高于(如通过轴突特异的蛋白质的表达水平的升高/降低指出，见上面)在第二种条件下培养的细胞中时，这表明第一种条件(相对于第二种条件)分别增加轴突生长、延长或者退化。
在优选实施方案中，在第一种条件下的培养包括在受试化合物存在下培养细胞，其中受试化合物优选为淀粉状蛋白(Aβ)肽(来自淀粉状蛋白前体蛋白，APP)。
本发明提供了鉴定抑制或者减小一种条件产生的轴突退化加剧的试剂的测定方法，已知所述条件增加轴突退化(例如，其中该条件是在淀粉状蛋白β肽的存在下培养)，即，鉴定减小或者抑制与这种条件有关的效果的试剂的测定法。该测定法可以包括在试剂和已知增加轴突退化的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；在试剂不存在和已知增加轴突退化的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；定量或者测定存在和不存在试剂时轴突退化的水平；并比较存在试剂时的轴突退化水平与不存在试剂时的轴突退化水平；其中与不存在试剂时相比，存在试剂时的轴突退化的较低水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的或者与该条件有关的轴突退化的增加。
如上指出，比较突触退化的水平可以包括比较突触特异的蛋白质的表达水平，其中与不存在试剂相比，存在试剂时的表达的较高水平(较低的降解水平)表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的轴突退化的增加。
所述条件可以是化合物的存在，该化合物可以是通过本发明的测定方法鉴定的能够增加轴突退化的化合物Aβ肽。
神经元细胞死亡本领域存在对神经元细胞死亡测定法的需要，并且此类测定法由本发明提供。
神经元细胞死亡测定法可以用于测试或者测定神经元或者神经元细胞群体对给定条件，例如，一种或多种化合物的存在的敏感性，例如，以鉴定增加或者减小神经元细胞死亡的条件(例如，化合物)。
例如，根据本发明的测定法可以包括在第一种条件下培养神经元(“测试培养”)；在第二种条件下培养神经元(“对照培养”)；定量或者测定在第一种和第二种条件下的神经元细胞死亡；和比较在第一种条件下神经元细胞死亡的水平与在第二种条件下神经元细胞死亡的水平；其中与第二种条件下相比，在第一种条件下神经元细胞死亡的较高水平表明第一种条件增加细胞死亡；和/或其中与第二种条件相比，在第一种条件下神经元细胞死亡的较低水平表明第一种条件减小神经元细胞死亡。
在神经元细胞死亡测定中，特别是用于鉴定减小神经元细胞死亡的条件的测定中，神经元优选遗传上倾向于细胞凋亡。例如，神经元可以表达p75神经营养因子受体，和/或可以表达有效连接神经元特异的启动子(例如，Tau基因座)的细胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。因此，用于本发明以产生用于神经元细胞死亡测定的神经元的ES细胞可以表达有效连接神经元特异的启动子(例如，Tau基因座)的细胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。
神经元细胞死亡测定可以用于鉴定抑制或者减小已知增加神经元细胞死亡的条件产生的神经元细胞死亡的增加的试剂，即，减小或者抑制这种条件的效果的试剂。该测定可以包括在试剂存在和已知增加神经元细胞死亡的条件下培养神经元；
在试剂不存在和已知增加神经元细胞死亡的条件下培养神经元；定量或者测定存在和不存在试剂时神经元细胞死亡的水平；并比较存在试剂时的神经元细胞死水平与不存在试剂时的神经元细胞死亡水平；其中与不存在试剂时相比，存在试剂时的神经元细胞死亡的较低水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的神经元细胞死亡的增加。
通过本领域已知的方法，例如，通过测定神经元中细胞凋亡的诱导机制，可以测定细胞死亡。可以确定的细胞死亡的指征包括凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶，特别是胱天蛋白酶-3，见，参考文献43)的诱导、用碘化丙锭染色和/或DNA片段化和/或核小体破坏(例如，通过抗体与DNA和/或组蛋白的结合可以检测，见参考文献44)。
神经发生和神经元分化本发明的方法可以包括神经发生或者神经元分化的测定法，其中检测和/或定量神经元的产生或者生成或者ES细胞和/或神经元前体和/或祖细胞的分化。该方法可以包括检测和/或定量一种或多种神经元特异的标记。本发明的方法可以包括监视一种或多种特定神经元亚型或者谱系的神经发生的水平，或者通常神经元的水平，这取决于所选的标记。通过检测和/或定量谱系特异的标记，可以测定确定谱系的神经元的产生。方法可以包括将细胞与针对细胞标记的抗体接触并测定结合，其中标记的存在(因此抗体结合)表明细胞是特定细胞类型、亚型、谱系或者亚谱系的细胞。方法可以包括测定或者定量抗体结合水平，并因此测定或定量细胞的分化水平、分化阶段，和/或特定类型、亚型、谱系或者亚谱系或特定分化阶段的细胞百分数。关于标记的检测和细胞类型的鉴定的更多细节包含在本文中，并且适宜的标记是本领域技术人员已知的。
本发明的神经元分化测定方法适于测定标记，所述标记可以用于鉴定特定分化阶段的ES细胞和/或神经细胞，或者鉴定细胞的类型或亚型，从而指出该细胞或者细胞类型或者亚型的分化状态。例如，测定方法可以包括诱导或者允许ES细胞分化以产生神经元前体细胞或者祖细胞，和/或培养神经元前体细胞或者祖细胞以产生神经元(优选使用如本文别处描述的神经分化方法)；比较在一种分化阶段下细胞中蛋白质的表达水平与第二种分化阶段下细胞中蛋白质的表达水平；和鉴定在第一种和第二种分化阶段下细胞中表达水平不同的蛋白质。表达水平的不同表明该蛋白质可以用作标记来指出细胞的分化状态、类型或者亚型和/或区分在第一种和第二种分化状态下的细胞。使用本领域技术人员可以确定的任意合适的方法可以比较表达水平。优选地，比较在细胞表面蛋白质的表达，例如，将细胞或者细胞提取物与抗体的表面表达文库接触并测定结合。例如，该方法可以包括比较神经元前体/祖细胞(例如，放射状神经胶质细胞)与ES细胞中蛋白质的表达。
表达水平的差异可以例如为至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍，或者以上。可以检测第一种分化阶段下细胞中的表达并且根本不检测第二种分化阶段下细胞中的表达。
电活性可以观察、检测、测定或者定量神经元中电活性，例如指示特定通道(例如，离子通道)的打开的电活性的水平。
测定方法可以用于鉴定能够调节神经元的电活性的化合物。方法可以包括在第一种条件下培养神经元，在第二种条件下培养神经元，并比较分别在第一种条件下培养的神经元的电活性与第二种条件下培养的神经元的电活性。电活性的差异表明该条件调节电活性。
突触发生测定方法可以包括检测或定量神经元细胞中的突触发生。检测或定量可以包括测量细胞的电生理活性和/或检测或测量表明突触发生的一种或多种标记(例如，突触泡蛋白)的表达。
遗传上不同的神经元的比较本发明提供了比较参照(通常野生型)神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元与突变的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元的方法，所述神经元具有不同的表型。该方法可以包括上述用于产生神经细胞的方法。
因此，本发明提供了方法，其包括提供神经元细胞或神经元前体细胞或者祖细胞的第一种和第二种培养物，其中第一种培养物中的细胞与第二种培养物中的细胞具有不同表型；和比较第一种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元与第二种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元。
可以比较目的基因中具有和不具有突变的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞。突变可以是例如所有或者部分基因的缺失，所有或者部分基因启动子和/或增强子的缺失，或者在编码区、启动子或者增强子中一个或多个核苷酸的替代。通常，突变导致改变的(减小或者增加)基因表达水平，或者突变蛋白质(例如，在其氨基酸序列中截短的或者含有一个或多个缺失或替代)的表达。备选地，第一种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞可以含有导入的基因(例如，插入的基因或者插入的cDNA)或者过表达内源基因，而第二种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞则否。
ES细胞可以被遗传操作并且可以在ES细胞中诱导突变，或者可以从携带突变的动物，例如，具有目的突变的小鼠ES细胞分离ES细胞。本发明的方法可以使用具有和不具有目的突变的ES细胞，以产生具有和不具有目的突变的神经细胞，例如，分别地神经元或者神经元祖细胞/前体细胞。从而，本发明可以产生突变的和野生型神经细胞，例如，神经元或者神经元祖细胞/前体细胞。可以例如进行从不同ES细胞类型(一种具有目的突变，另一种不具有)产生的神经细胞之间的比较以鉴定负责或者促进神经变性疾病中神经细胞类型损失的机理，和鉴定疾病表型中相关的靶标。
在一些实施方案中，该方法可以包括分别从ES细胞的第一种和第二种培养物产生神经元前体/祖细胞或者神经元，其中第一种和第二种培养物中的ES细胞具有不同表型。任选地，通过如本文别处描述的方法可以从ES细胞产生神经元前体/祖细胞或者神经元。第一种培养物中的ES细胞可以含有目的基因中的突变，而第二种培养物中的ES细胞不含有该突变(例如，野生型细胞)。备选地，第一种培养物中的ES细胞可以含有导入的基因或者过表达内源基因，而第二种培养物中的ES细胞则否。
作为使用遗传上不同的ES细胞的备选方案，可以在遗传上操作解离的EB细胞。方法可以包括用核酸构建体转染解离的EB细胞、或者神经元前体细胞或者祖细胞的第一种培养物，从而与第二种培养物中的细胞相比，改变第一种培养物中细胞的表型。例如，核酸构建体可以编码内源基因，或者编码含有突变的目的基因。本发明的此类方法通常包括允许从核酸构建体表达(通常瞬时表达，持续约2、3或者4天)。该方法可以包括培养细胞以产生神经元细胞。第一种培养物中的细胞将与第二种培养物中的神经元前体、祖细胞或者神经元细胞比较，其中第二种培养物中的细胞不含有所述核酸构建体、导入的基因和/或突变。
比较神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元可以包括比较(通常测定或定量)一种或多种特征，如轴突生长或者轴突延长、神经元形状、神经元细胞死亡、神经发生、神经元分化、电活性、突触发生和/或神经元细胞标记。在其他实施方案中，比较可以包括比较目的基因，例如，导入的或突变的或过表达的基因的读数，或者该基因的效果。读数的性质取决于该基因，但是可以由技术人员为给定基因确定。从而，可以阐明、阻断和/或操作神经元信号传递机制。
比较神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞可以包括比较在测试条件下该细胞的一种或多种特征，并且比较遗传上不同的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的方法可以用于本文别处描述的测定方法的上下文中。从而，在优选实施方案中，细胞的第一种和第二种培养物每种培养在测试条件下，并比较细胞的神经元特征。其他方法和变通方案如上面关于细胞测定所描述。例如，在测试条件下培养可以包括在Aβ肽存在下培养。
抗体如本文所用，“抗体”覆盖具有结合结构域的任意特异性结合物质，所述结合结构域具有所需的特异性。从而，该术语覆盖抗体片段、抗体的衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的天然或合成的任意多肽。因此包括嵌合分子，其包含融合另一多肽的免疫球蛋白结合结构域或者等同物。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述。
已经表明完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的V1和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature341，544-546(1989)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，其是包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该接头使得两个结构域结合而形成抗原结合部位(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，其是通过基因融合构建的多价或者多特异性片段(WO94/13804；PHolliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 6444-6448，1993)。
双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包含第一个结构域和第二个结构域，第一个结构域包含免疫球蛋白轻链的结合区，第二个结构域包含免疫球蛋白重链的结合区，两个结构域相连(例如，通过肽接头)但是不能彼此结合形成抗原结合部位抗原结合部位通过多聚体内一个多肽内的第一个结构域与该多聚体内另一多肽的第二个结构域结合形成(WO94/13804)。
可以以多种方式修饰抗体，例如，它们可以经标记，例如，用荧光标记物标记，使得可以通过测量荧光水平定量抗体的结合。
考虑到本公开，本发明的多种其他方面和实施方案将是本领域技术人员显而易见的。
本说明书中提到的所有文献都完整引入本文作为参考。
现在将仅通过实施例并参考
图1阐明本发明的实施方案的一些方面，图1显示了在接种解离的EB细胞后在所选的时间点的％Pax6阳性细胞。Pax-6最初由多数细胞表达但是快速消失。结果代表用2种不同ES细胞系进行的4个独立实验的平均值。它们表达为％±SD，100％为DAPI阳性细胞核的数目。
实施例ES细胞的培养导致从ES细胞产生神经元的该方法包括下面的步骤，概述如下1.培养在饲养层上的细胞以集落生长，然而饲养层耗竭后，它们作为扁平单层生长。
2.非贴壁细菌培养皿上的ES细胞形成悬浮生长的细胞团聚体(EB)。
3.EB形成4天后，加入RA再培养4天。
4.共8天后EB解离并将其接种在PDL/层粘连蛋白包被的培养皿上N2培养基中。
5.N2培养基在2小时后更换，12-24小时后再次更换。在该阶段，多数前体细胞具有纺锤形形态。在30-48小时后加入神经元分化培养基。
使用表达来自tau基因座的GFP(参考文献13)的ES细胞对该方法显色。GFP从内源启动子的表达允许在紫外线下观察神经元和它们的过程，并且我们用它最大化荧光细胞的产生。
解冻后，首先将ES细胞培养在饲养细胞上进行2-3次传代，然后渐进地耗竭饲养细胞。然后用确定数目(3×106)的细胞形成团聚体(胚状体，EB)，其在非贴壁的细胞培养皿(10cm培养皿，15ml培养基)中培养8天。4天后加入视黄酸(RA，5μM)并经过最后4天。一个重要步骤是选择具有均一、扁平形态和高增殖速率的饲养细胞耗尽的ES细胞(见材料和方法)。
8天后，用新鲜制备的胰蛋白酶悬浮液解离EB细胞并将其接种在由聚-D-赖氨酸(PDL)和层粘连蛋白组成的基质上。发现接种密度(1.5×105个细胞/cm2)是关键的，因为较低密度的细胞倾向于快速死亡。将解离的细胞接种在无血清培养基中，接种后2小时更换培养基以除去残渣和死亡的细胞。一天(约24小时)后再次更换培养基。48小时后，用富含补充物(参考文献12)的无血清培养基更换培养基。除了表达来自两个tau等位基因的GFP的ES细胞外，我们还使用了超过7种其他的ES细胞系，结果与该研究中报导的结果无差别。这些细胞系包括野生型J1和E14ES细胞，以及GFP在一个或两个tau等位基因中的J1。我们还从混合的BL6/SV129背景的胚泡分离了四种不同的ES细胞系并将它们进行我们的分化方案，得到相似结果。
神经元前体ES细胞分化成放射状神经胶质细胞的均一群体。
从EB解离的细胞采取了明显延长的、纺锤形形态，其暗示放射状神经胶质细胞的形状(见参考文献16)。相差图像图解了在2小时分化后的二极纺锤形态。
通过用针对中间丝蛋白巢蛋白的抗体(参考文献9)染色，将这些细胞鉴定为神经前体细胞。接种后2小时，发现与通过细胞核染色定量的接种细胞的总数目比较时，多数细胞对于巢蛋白为阳性(表I)。
我们然后使用RC2，其是所有放射状神经胶质细胞表达的一种标记物，并且发现几乎所有细胞都是阳性的(表I)。用针对脑脂类结合蛋白(BLBP)对抗体染色进一步证实了从EB新鲜解离的细胞的身份(表I)，发育中的CNS中放射状神经胶质细胞也表达BLBP。同源域转录因子Pax-6由所有皮质神经胶质细胞表达(参考文献19)并且发现EB中的基本上所有细胞都在它们解离前表达，这意味着在该阶段，它们已经是前体细胞。
接种后2小时的定量揭示多数细胞都是Pax-6阳性的(图1)，并且其表达在后面的几天中快速下降到在7天后基本上不存在(图1)。
表1
接种后2小时％神经元前体。接种解离的EB后2小时，通过免疫细胞化学分析巢蛋白、RC2、BLBP、Pax-6。确定相对于通过细胞核标记DAPI染色的细胞总数，阳性细胞的百分数(±SD)。
神经元分化在EB解离后2天内开始出现具有神经元形态的细胞。所有正分化的细胞都表达GFP，表明它们是神经元。通过用染色实验证实了该结论，该实验中使用的抗体识别微管蛋白的神经元特异形式。
4天后，约85％的细胞都是GFP-和微管蛋白阳性的。通过相差和荧光，我们被神经元细胞体的非常均一的外观所震惊。随着培养的进行，它们越来越采用从啮齿动物海马分离的细胞观察到的锥形性状(参考文献20)。当用针对突触泡蛋白的抗体染色时，看到许多簇内衬在GFP-阳性过程中，表明在我们的培养物中可以产生突触接触。
为了测试这些神经元是否使用谷氨酸作为神经递质，我们用针对泡状谷氨酸转运蛋白vGlut1的抗体将细胞染色，vGlut1是大脑皮质和海马中多数锥形神经元表达的一种膜蛋白(参考文献21)。培养7天后，将93±4.7％的细胞用vGlut1抗体染色。用vGlut1抗体得到的发现与将神经元鉴定为锥形细胞相一致。在EB解离后第一周结束时，少于0.1％的细胞对Is1-1、酪氨酸羟化酶和胆碱乙酰基转移酶阳性染色。少于5％的细胞在3周后为GABA阳性。
为了鉴定在从放射状神经胶质细胞到神经元过渡期间表达的蛋白质，我们使用在不同时间间隔制备的体外分化的神经元进行了蛋白质印迹分析。
尽管在放射状神经胶质细胞的裂解物中检测不到，但是AMPA受体亚基GluR1像突触泡蛋白一样，在培养几天后可以清楚地检测到。随着神经元开始分化，GluR1和突触泡蛋白蛋白质水平增加。
由于锥形神经元在大脑皮质和海马中都表达高水平的Trk受体(参考文献22)，我们还使用针对这些神经营养因子受体的细胞内结构域的抗血清分析了它们的表达。尽管在第5天时，几乎检测不到Trk受体，但是在接下来的几天内，它们的水平显著增加。约7天后在体外观察到Trk受体的大量表达，之后它显著增加。相反地，发现在神经元成熟期间，神经营养因子受体p75的水平下降，跟它们在体内的情况很像(参考文献23)。
最后，我们测试了淀粉样蛋白前体(APP)的表达。已经表明，该膜蛋白被放射状神经胶质细胞表达(参考文献24)，以及被包括神经元的许多细胞在发育后期表达。我们的结果表明，不像所测试的其他膜蛋白，在放射状神经胶质细胞的裂解物中清楚地检测到APP。表达水平随后增加，可能是由于神经元成熟的结果，神经元成熟包括神经元过程的显著生长。植入的前体的体内分化本发明的神经元前体细胞的发育潜力是通过将它们植入鸡胚中来测试的，在鸡胚中，所述细胞可以分化成不同的特异神经元谱系，包括运动神经元。
电生理学电生理学实验表明神经元形成突触，显示出AP并且在电生理学特征中非常均一。神经元主要是谷氨酸能的(通过用NBOX阻断突触电流，vGAT染色证明)，具有一定的γ-氨基丁酸能输入(用荷包牡丹碱阻断，否则培养物将不存活)。电生理学清楚地表明在所用的条件下不存在其他神经元细胞类型。
为了表征我们的ES细胞来源的神经元的电生理学特征，对培养10到最多22天的细胞进行全细胞膜片钳记录。所有研究的细胞(n＝22)都显示出自发的或者去极化诱导的动作电位并且在所有情况中，这些都可以通过应用河豚毒素阻断。而且，所研究的细胞的电生理学特征表明它们关于它们的功能性质方面相当均一，所述功能性质类似于以前对锥形神经元所描述的功能性质。可以观察到自发突触电流(SSC)，其可以通过加入NBQX/AP-5和荷包牡丹碱或者仅加入NBQX/AP-5来完全阻断。这些结果表明ES细胞来源的神经元形成功能突触，其利用谷氨酸作为神经递质。由于这些实验还揭示在长期培养物中存在功能GABA神经元，所有我们定量了在3周后GABA神经元的数目。使用针对小泡转运蛋白vGAT的抗体，我们发现3周后，约5％的细胞对于该标记是阳性的。与和谷氨酸和GABA系统不相关的神经递质缺少染色一致的是，我们没有检测到可以规因于谷氨酸或者GABA的任何突触活性。
讨论使用小鼠ES细胞，我们发现了导致产生定义为放射状神经胶质细胞的神经元前体的几乎纯的群体的条件。这些细胞然后继续产生具有锥形细胞特征的神经元的均一群体。
当高度增殖时，选择未定型的干细胞用于形成EB，我们发现用RA处理将整个细胞群体转化成确定类型的神经元前体。未定型ES细胞的选择是重要的，因为已经观察到即使存在LIF时，一些ES细胞也倾向于分化并且在EB形成期间，可以通常观察到不同谱系的细胞(综述见参考文献3，34)。
为了在进行性除去饲养细胞后选择高增殖性ES细胞，在用确定数目的细胞开始EB形成之前，我们通过细胞计数、细胞的相差外观以及它们达到的汇合程度来监视分裂速率。
还使用ES细胞或者P19胚胎癌性细胞报导了在非解离的EB中存在放射状神经胶质细胞(参考文献35)。当将EB接种在聚赖氨酸基质上时，可以观察到延长的细胞放射状迁移，远离EB并且不断转化成星形胶质细胞(参考文献35)。我们通过解离EB得到的细胞的鉴定是基于用RC2-、BLBP-和Pax-6抗体染色时它们的形态和它们的定量。以前已经表明皮质中的放射状神经胶质细胞表达该组标记(参考文献11，16)。重要的是，不是所有放射状神经胶质细胞都表达Pax-6。具体地，那些定位于神经节隆起的放射状神经胶质细胞不表达Pax-6并且不是神经发生性的(参考文献11)。有趣的是，最近已经表明向EB加入RA导致诱导Wnt信号传递拮抗剂sFRP2(参考文献36)。然后可以想象正发育的前脑中存在的分子的Wnt信号传递的抑制导致细胞采取放射状神经胶质细胞表型。sFRP1的空间和时间上的表达与该观点是相容的(参考文献37)。
在我们的体外条件下，RA的加入是关键的(参考文献38)。然而RA处理后4天，几乎所有细胞都在EB中表达Pax-6，不存在RA时不能观察到Pax-6阳性细胞，并且未处理的EB解离后不能得到神经元。尽管似乎RA不可能在正发育的皮质中Pax-6的诱导中起生理学作用，但是对于正发育的CNS的其他部分，有充分的理由可以是这种情况。实际上，尽管在包括大脑皮质的CNS中，Pax-6具有受限制的表达模式，但是在大部分腹部神经管的发育期间也表达Pax-6，并且最近的结果提示体节来源的RA在神经管的腹部图式发育中起生理作用(参考文献39，40)。关于RA处理的EB，Renoncourt等人(参考文献28)和Wichterle等人(参考文献7)也观察到EB中的一些细胞在RA处理后是Pax-6阳性的。然而，也观察到Pax-7阳性细胞具有相似的丰度(参考文献7)，提示RA处理的EB的细胞组成中的不均一性。
在用层粘连蛋白包被的聚阳离子基质上，放射状神经胶质细胞快速失去它们的纺锤形形态。当使用我们的EGP-ES细胞系时，我们注意到荧光细胞数目快速增加并且神经元在它们的形状和它们的细胞体的大小方面都看起来非常相似。到解离后第四天，几乎所有细胞都已经具有神经元特征。随着时间的推移，几乎所有神经元都采取了锥形形状并且也发现对于谷氨酸囊泡转运蛋白是阳性的。所有细胞不管它们的身份都在所有时间染色。相比，当培养1周后用针对Is1-1、酪氨酸羟化酶或者胆碱乙酰转移酶染色时，小于0.1％的细胞是明显阳性的。三周后，小于5％的细胞是vGAT阳性的。GABA和Is1-1染色的缺乏排除了许多中间神经元和长投射神经元，尤其包括运动神经元，它们的许多也来自体内的Pax-6阳性细胞。
可能需要诱导信号如sonic hedgehog的存在以沿着该特定分化途径驱动Pax-6-阳性放射状神经胶质细胞(参考文献7)。我们的神经元的谷氨酸能表型与它们作为皮质锥形神经元的身份相一致，如它们的形状所表明。最重要地，该表明与这些神经元都来自放射状神经胶质细胞这一观察相符合。实际上，Malatesta等人(参考文献11)最近证明皮质放射状神经胶质细胞的后代是锥形神经元，其定居于所有皮质层，以及海马。从而，我们的培养条件可以描述为“允许的”，允许放射状神经胶质细胞内在的分化程序在体外展开。与这符合的是，我们使用的培养基最初开发是用于维持从胚胎啮齿动物海马分离的锥形神经元的存活和分化(参考文献12)。该培养基的一种性质也是防止或者抑制诸如星形胶质细胞的增殖。将预期这些细胞存在于我们的培养物中，因为它们也属于放射状神经胶质细胞的后代。
使用GFAP抗体，我们观察到我们的培养物中一些分枝的星形胶质细胞的发育。然而，它们的数目非常少(3周后总细胞数目的1-2％)。
我们的神经元培养物的相对均匀性促使我们检查已知在特定发育时间点表达的膜蛋白质的表达。与体内结果相符(参考文献23)，我们发现p75表达与我们的培养物中神经元的外观高度相关并且随后被下调。相比，尽管Trk受体表达在早期时间点不能检测到，但是它在几天后显著增加，提示神经元同步发育。Trk受体表达的高水平是体内锥形神经元特征性的(参考文献22)。RT PCR实验表明尽管TrkB和TrkC促成使用pan-Trk抗体得到的信号，但是在体外前几天后几乎检测不到TrkA表达。相比，使用p75和Trk受体，EB解离后2小时就可以清楚地检测到APP并且它的水平在神经元分化期间增加。这与免疫化学实验的结果相符，表明APP特异标记正发育的啮齿动物皮质中的放射状神经胶质细胞(参考文献24)。
材料和方法材料从Gibco得到ES细胞培养基成分，LIF来自Chemicon，PDL和N2和完整培养基的母液来自Sigma。BSA粉剂级分(powder fraction)V来自Gibco。从Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤分离层粘连蛋白(Roche)。RA从Sigma得到并且当使用不同批时，没有观察到结果的差异。
抗体用于免疫组织化学的一级抗体是小鼠单克隆抗体抗巢蛋白(大鼠401，IgG1；1∶10；Developmental Studies Hybridoma Bank，DSHB)、小鼠单克隆抗体RC2(IgM；1∶4；DSHB)、兔多克隆抗体抗-BLBP(1∶2000；由N.Heintz(Rockefeller University，New York)友情提供给M.Goetz)、小鼠多克隆抗体抗-Pax6(IgG1；1∶100；DSHB)、小鼠单克隆抗体抗-β微管蛋白III(IgG2b；1∶100；Sigma)和兔多克隆抗体抗-vGlut1(1∶5000；SYSY)。亚类特异的Cy2-或Cy3-偶联的抗血清用作二级抗体。对于蛋白质印迹，我们使用小鼠单克隆抗体抗-突触泡蛋白(IgG1；1∶1000；Sigma)、兔多克隆抗体抗-GluR1(1∶1000；Upstate)、兔多克隆抗体抗Trk(C-14，sc-11；1∶1000；SantaCruz)、兔多克隆抗体抗-APP(1∶3000；由P.Paganetti(Novartis，Basel)友情提供)和兔多克隆抗体抗-p75(1∶2000；Promega)。
培养基ES培养基(500ml)DMEM 410mlFCS 75ml(55℃下热失活30分钟)LIF 5ml谷氨酰胺 5ml非必需氨基酸 5mlβ-MeOH 5μl
EB培养基(500ml)DMEM 440mlFCS 50ml谷氨酰胺 5ml非必需氢基酸 5mlβ-MeOH 5μlN2培养基DMEM 125ml谷氨酰胺 1.25mlF-12(Gibco#21765029) 125ml胰岛素1.25ml25μg/ml转铁蛋白 6.25ml50μg/ml黄体酮0.25ml6ng/ml腐胺 0.25ml16μg/ml亚硒酸钠 25μl 30nMBSA 1.25ml50μg/mlP/S 2.5ml 1％P/S代表抗生素，例如，青霉素/链霉素。它可以任选地被排除在本文的培养基之外并且被等体积的DMEM替换。
N2培养基的贮存液BSA Gibco #A-9418 Powder Fraction V100g等分试样10mg/ml贮存在-20℃终浓度50μg/ml
胰岛素Sigma I-6634 100mg水中的贮存液5mg/ml(滴加浓盐酸酸化到pH2以溶解胰岛素)贮存在-80℃转铁蛋白Sigma#T-1147脱铁运铁蛋白人100mg水中贮存液2mg/ml贮存在-80℃黄体酮Sigma#P-8783 5gEtOH中贮存液2mM，贮存在-80℃工作溶液20μM，贮存液在水中的稀释液，贮存在-80℃腐胺Sigma#P-5780水中的贮存液100μM，贮存在-80℃亚硒酸钠Sigma#S-5261 25g水中的贮存液300μM，贮存在4℃完全培养基水溶液L-丙氨酸(Sigma#A-7627)[贮存液2mg/ml]2μg/ml生物素(Sigma#B-4501)[贮存液0.1mg/ml]0.1μg/mlL-肉碱(Sigma#C-0283)[2mg/ml]2μg/ml乙醇胺(Sigma#E-9508)[1mg/ml)1μg/mlD+-半乳糖(Sigma#G-0625)[15mg/ml]15μg/mlL-脯氨酸(Sigma#P-0380)[7.76mg/ml] 7.76μg/ml腐胺(Sigma P-7505)[16.1mg/ml] 16.1μg/ml丙酮酸钠(Sigma#P-5280)[25mg/ml] 25μg/ml
亚硒酸钠(Sigma#S-1382)
0.016μg/ml维生素B12(Sigma#V-2876)
0.34μg/ml硫酸锌(Sigma#Z-4750)
0.194μg/ml过氧化氢酶(Sigma#C-40)[16mg/ml]16μg/ml谷胱甘肽(Sigma#G-6013)[1mg/ml] 1μg/mlSOD(Sigma#S-2515)[2.5mg/ml]2.5μg/ml乙醇溶液亚油酸(Sigma#L-1376)[100mg/ml] 1μg/ml亚麻酸(Sigma#L-2376)[100mg/ml] 1μg/ml黄体酮(Sigma#P-8783)
6.3ng/ml全反式视黄醇(Sigma#R-7632)[10mg/ml]100ng/ml乙酸视黄酯(Sigma#R-7882)[10mg/ml] 100ng/ml生育酚(Sigma#T-3251)[100mg/ml] 1μg/ml维生素E(tocopherolacetate)(Sigma#T-3001)[100mg/ml]1μg/ml溶解BSA 1g转铁蛋白2mg胰岛素 1.6mg谷氨酰胺2mMP/S(任选的) 1％在400ml DMEM中并加入上面的溶液。
ES细胞培养物最初，将ES细胞解冻后在由丝裂霉素失活的小鼠胚胎成纤维细胞组成的饲养细胞上培养至少两次传代。对于接下来的传代，在没有饲养细胞时培养ES细胞并且可以在没有饲养细胞下至少两次传代后立即开始分化或者从无饲养细胞的ES细胞的冷冻原种开始分化。用于分化的原种在开始该过程前传代至少两次。在饲养细胞上培养ES细胞后，没有饲养细胞的第一次传代是重要的。成功的分化取决于用于第一次传代的ES细胞的密度。ES细胞在第一次分裂培养后1天应该占据平板的至少1/3。ES培养基是基于含有15％FCS(特别为ES细胞培养物测试，然后是神经元分化)、LIF(1000U/ml)、非必需氨基酸和β-巯基乙醇的DMEM。细胞培养板总是用0.2％明胶溶液包被至少10分钟。发现培养的温度是重要的因素，因为在37℃以上时神经元分化不是成功的。将ES细胞在7％CO2/空气下保持在最高温度37℃下。所有培养基都在37℃预热。
ES细胞每2天分裂培养一次，在10cm细胞培养板(Corning)上的接种密度为1.5×106到4×106个细胞。2天后，可以回收10-25×106个细胞，并且高增殖速率是实验成功的必要条件。细胞必须处于快速生长相中并且形成扁平单层。
通过2×PBS洗涤并将细胞与胰蛋白酶溶液(1×胰蛋白酶溶液Gibco-0.02％EDTA中0.05％)薄膜在37℃7％CO2中培养，进行细胞的分裂，可以用手摇动培养板并且细胞将脱落并且通过上下抽吸(失活胰蛋白酶)重悬浮在新鲜ES培养基中。然后以1000转/分钟在室温下离心5分钟。通过上下抽吸几次将沉淀再次重悬浮在新鲜ES培养基中。细胞将解离成单个细胞培养物，尽管可以存在2-3个细胞的团聚体；但是将不存在更大的团块。将所希望量的细胞再次接种在明胶包被的平板上。
为了使ES细胞脱离饲养细胞。它们可以在解冻后在饲养细胞上培养约2次，然后将进行没有饲养细胞的情况下至少两次传代，从而将稀释除去成纤维细胞。从而ES细胞从集落样形状改变成扁平形态。
解冻ES细胞涉及快速解冻约3×106个ES细胞的原种瓶，将细胞重悬浮在10ml ES培养基中并以1000转/分钟在室温下离心5分钟。将细胞沉淀物再次重悬浮在ES培养基中并将细胞的量接种在6cm细胞培养皿中。通过将胰蛋白酶消化并离心后分裂时的细胞重悬浮在ES培养基+10％DMSO中进行ES细胞的冷冻。
神经元分化方案对于EB形成，将3×106个ES细胞接种在非贴壁的细菌培养皿(Greiner)中15ml EB培养基(没有LIF并且仅有10％FCS的ES培养基)中并培养8天。
通过从细菌培养皿(50ml Falcon管中)除去总细胞培养物并让EB静置(约3-5分钟)，每2天更换培养基。然后小心吸除上清液，并用15ml EB培养基再次回收EB。EB应该通过移液小心地重悬浮在培养基中，使用具有足够宽开口的移液器以避免损伤或者解离EB(例如，10ml塑料移液器)。
4天后，将5μM RA(Sigma)直接加到培养皿并通过轻轻摇动培养皿分散。RA不应该在光线下放置太长时间，因为它是光线敏感的。然后解离EB并将细胞接种在PDL/层粘连蛋白包被的平板上，如下。
将细胞培养皿用硼酸盐缓冲液(150mM pH8.4)中的10μg/ml PDL溶液包被并在培养箱中放置过夜(37℃，7％CO2)。还使用100μg/ml的多鸟氨酸得到相似的结果。用PBS(对于多鸟氨酸使用水)洗涤平板3次，向PBS溶液中直接加入层粘连蛋白(约0.5μg/cm2)并将平板返回到培养箱中至少2小时。
EB形成8天后，将EB用PBS洗涤2次并通过将它们在37℃水浴中在0.04％EDTA/PBS中的0.05％胰蛋白酶溶液(用胰蛋白酶粉剂新鲜制备，TPCK处理的，Sigma)温育3分钟。温育时间期间，Falcon管应该用手小心摇动几次并且可以容易地看到EB的崩解。然后EB的解离变得温和，但是完全重悬浮在含有用于胰蛋白酶失活的血清的10ml EB培养基中。可以通过约5次上下吹吸进行解离。最好的研磨是通过具有小体积(约1.5ml)的平滑边缘的/in flame巴斯德移液器进行两次，然后用5ml塑料移液器进行。然后通过以1000转/分钟在室温下离心研制(trituration)。然后完全除去上清液，将沉淀物重悬浮在N2培养基中，并通过40μm Nylon细胞渗滤器(Falcon)过滤细胞悬浮液。
从包被的平板除去层粘连蛋白，并立即加入细胞悬浮液，不让平板干燥。将解离的细胞以1.5×105个细胞/cm2的密度接种。2小时后更换N2培养基，1天后再次更换。2天后，通过Brewer和Cotman(参考文献12)描述的富集的无血清培养基更换培养基，所述培养基中的变动是省略谷氨酸、HEPES、皮质酮、硫辛酸和T3。
神经元分化继续并且神经元培养物可以保持数周。
免疫化学通过将玻璃盖玻片在水中洗涤并在65％硝酸中温育1到2天来准备玻璃盖玻片。随后，将它们漂浮在水中几小时，用乙醇冲洗、风干并在紫外线下消毒。将细胞用4％低聚甲醛(PFA)固定10分钟，用PBS洗涤并在封闭缓冲液(0.03％角叉藻聚糖，10％NGS，0.3％Triton X-100)中封闭1小时。在AquaPoly/Mount(Polysciences)中封固。
蛋白质印迹如上述接种解离的EB并在所指示的时间点收集蛋白质印迹的样品。收获前将平板用冰预冷的PBS洗涤两次。在补加蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的用于6cm平板的750μl裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mMNaCl，10％甘油，1％Triton X-100)中制备全细胞提取物。以4200转/分钟在Eppendorf离心机中离心30分钟后，除去上清液并通过DC蛋白质测定法(BioRad)测定蛋白质含量。样品在Laemmli缓冲液中煮沸并将5μg样品装入聚丙烯酰胺凝胶。用5％奶溶液封闭印迹，用一级抗体温育过夜温育并用二级抗体温育2小时。用ECL Plus(Amersham)进行检测。
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权利要求
1.诱导胚胎干(ES)细胞分化成神经元前体细胞或者祖细胞的方法，其包括培养ES细胞；形成胚状体(EB)；将EB与视黄酸(RA)接触；和解离EB以产生神经元前体细胞的培养物，其中形成EB包括选择高增殖性ES细胞并将那些细胞以所测量的密度接种以形成EB。
2.根据权利要求1的方法，其中将所述细胞以约0.5×105到5×105个细胞/ml的密度接种。
3.根据权利要求2方法，其中形成EB包括将ES细胞以约2.5×105到3.5×105个细胞/ml的密度接种。
4.根据权利要求1、权利要求2或者权利要求3的方法，其中EB保持在非贴壁的培养物中直到EB细胞解离。
5.根据前面权利要求任一项的方法，其中该方法包括观察ES细胞的形态并选择形态上均一的ES细胞用于EB形成。
6.根据权利要求5的方法，其中该方法包括选择具有一种或多种下面的形态特征的ES细胞以扁平单层生长；邻近细胞不相互直接接触；大细胞核；许多核仁；细胞不在相互的上方生长也不以集落样形式生长。
7.根据前面权利要求任一项的方法，其中该方法包括确定ES细胞的增殖状态并选择高增殖性细胞用于EB形成。
8.根据前面权利要求任一项的方法，其中培养ES细胞包括在不存在饲养细胞的条件下传代ES细胞。
9.根据前面权利要求任一项的方法，其中培养ES细胞包括通过将ES细胞以约0.5-2×105个细胞/cm2的密度接种并在接种后2天解离ES细胞进行传代。
10.根据权利要求9的方法，其中在不存在饲养细胞时将传代重复至少两次。
11.根据前面权利要求任一项的方法，其中该方法包括解离ES细胞以形成单个细胞悬浮液，其中悬浮液中少于约5％的细胞形成4个或更多细胞的团聚体，并接种细胞以形成EB。
12.根据前面权利要求任一项的方法，其中解离EB包括用胰蛋白酶解离EB细胞以形成解离的EB细胞的悬浮液，然后过滤悬浮液以除去细胞团块。
13.根据权利要求12的方法，其中通过约40μm的网孔过滤解离的EB细胞。
14.根据前面权利要求任一项的方法，其包括通过冷冻细胞来贮存解离的EB细胞。
15.根据前面权利要求任一项的方法，其还包括接种和培养解离的EB细胞以产生神经元，和任选地培养神经元。
16.根据权利要求15的方法，其中将解离的EB细胞以约0.5×105到2.5×105个细胞/cm2的密度接种。
17.根据权利要求16的方法，其中将解离的EB细胞以约1×105到1.5×105个细胞/cm2的密度接种。
18.根据权利要求15到17任一项的方法，其包括在接种解离的EB细胞后约1到6小时，更换解离的EB细胞的培养基。
19.根据权利要求18的方法，其包括在接种后约1到3小时更换培养基。
20.根据权利要求15到19任一项的方法，其中不在血清的存在下培养解离的EB细胞或神经元。
21.根据权利要求15到20任一项的方法，其中不在生长因子存在下培养神经元前体细胞、祖细胞或者神经元细胞。
22.根据权利要求15到21任一项的方法，其中不在神经基础培养基中培养神经元前体细胞、祖细胞或者神经元细胞。
23.根据前面权利要求任一项的方法，其中该方法不包括负选择步骤。
24.根据前面权利要求任一项的方法，其中ES细胞是非人ES细胞。
25.根据前面权利要求任一项的方法，其包括将至少80％的解离的EB细胞鉴定为神经元前体细胞或者祖细胞。
26.根据前面权利要求任一项的方法，其包括将至少99％的解离的EB细胞鉴定为神经元前体细胞或者祖细胞。
27.根据权利要求15到22任一项的方法，其包括将至少80％的细胞鉴定为神经元。
28.根据权利要求27的方法，其包括将至少90％的细胞鉴定为神经元。
29.测定方法，其包括确定神经元前体细胞或祖细胞或者神经元细胞的一种或多种特征。
30.根据权利要求29的测定方法，其中所述一种或多种特征是轴突生长或轴突延长/退化、神经元形状、神经元细胞死亡、神经发生、神经元分化、电活性、突触发生和/或神经元细胞标记的一种或多种。
31.根据权利要求29或者权利要求30的测定方法，其中通过根据权利要求1到28任一项的方法产生所述细胞。
32.根据权利要求31的测定方法，其包括诱导ES细胞分化成根据权利要求1到28任一项的神经元前体细胞或祖细胞或者神经元细胞；并确定在测试条件下所述神经元前体细胞或祖细胞或者神经元细胞的一种或多种特征。
33.根据权利要求29到32任一项的测定方法，其包括在第一种条件下培养神经元前体细胞或祖细胞或者神经元细胞；在第二种条件下培养神经元前体细胞或祖细胞或者神经元细胞；确定或定量所述细胞的一种或多种神经元特征；和比较分别在第一种条件下培养的细胞的一种或多种神经元特征与在第二种条件下培养的细胞中相同的一种或多种神经元特征。
34.根据权利要求33的测定方法，其中神经元特征是轴突延长并且其中该方法包括定量轴突特异的蛋白质的表达水平；和比较轴突特异的蛋白质的表达水平；其中在第一种条件下较高的表达水平表明第一种条件增加轴突延长。
35.根据权利要求33的测定方法，其中神经元特征是轴突退化并且其中该方法包括定量轴突特异的蛋白质的表达水平；和比较轴突特异的蛋白质的表达水平；其中在第一种条件下较低的表达水平表明第一种条件增加轴突退化。
36.鉴定抑制或者减小已知增加轴突退化的化合物产生的轴突退化的增加的试剂的方法，其包括在试剂存在并且在已知增加轴突退化的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；在所述试剂不存在并且在已知增加轴突退化的条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞；定量或者测定存在和不存在所述试剂时轴突退化的水平；并比较存在试剂时轴突退化的水平与不存在试剂时轴突退化的水平；其中，与不存在试剂时相比，存在试剂时轴突退化的较低水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的或者与该条件相关的轴突退化的增加。
37.根据权利要求36的方法，其中通过定量轴突特异的蛋白质的表达水平来定量轴突退化的水平，其中与不存在试剂时相比，存在所述试剂时轴突特异的蛋白质的较高的表达水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的或者与该条件相关的轴突退化的增加。
38.根据权利要求33的测定方法，其中神经元特征是神经元细胞死亡，并且其中该方法包括在第一种条件下培养神经元；在第二种条件下培养神经元；定量或者测定在第一种和第二种条件下培养的细胞的神经元细胞死亡；和比较在第一种条件下神经元细胞死亡的水平与在第二种条件下神经元细胞死亡的水平；其中与第二种条件下相比，在第一种条件下神经元细胞死亡的较高水平表明该化合物增加细胞死亡；和/或其中与第二种条件下相比，在第一种条件下神经元细胞死亡的较低水平表明该条件减小神经元细胞死亡。
39.根据权利要求38的测定方法，其中神经元表达p75神经营养蛋白和/或细胞凋亡蛋白。
40.鉴定抑制或者减小神经元细胞死亡的增加的试剂的方法，所述神经元细胞死亡的增加由已知增加神经元细胞死亡的条件产生，该方法包括在试剂存在和已知增加神经元细胞死亡的条件下培养神经元；在试剂不存在和已知增加神经元细胞死亡的条件下培养神经元；定量或者测定存在和不存在所述试剂时神经元细胞死亡的水平；并比较存在所述试剂时的神经元细胞死亡水平与不存在所述试剂时的神经元细胞死亡水平；其中与不存在试剂时相比，存在试剂时神经元细胞死亡的较低水平表明该试剂抑制或者减小所述条件产生的神经元细胞死亡的增加。
41.根据权利要求33到35、38和39任一项的测定方法，其中在第一种条件下培养包括在测试化合物存在下培养细胞或者将细胞暴露于测试化合物，并且其中在第二种条件下培养包括在所述测试化合物不存在时培养细胞，或者不将细胞暴露于测试化合物。
42.根据权利要求29到31任一项的测定方法，其用于鉴定指示细胞的分化状态的标记，所述方法包括诱导ES细胞分化以产生神经元前体细胞或者祖细胞，和/或培养神经元前体细胞或者祖细胞以产生神经元；比较在一种分化阶段下细胞中蛋白质的表达水平与第二种分化阶段下细胞中蛋白质的表达水平；和鉴定在第一种和第二种分化阶段下细胞中表达水平不同的蛋白质；其中表达水平的差异表明该蛋白质可以用作标记来指出细胞的分化状态。
43.根据权利要求29到32之一的测定方法，其中神经元特征是突触发生并且其中该方法包括测量细胞的电生理学活性和/或检测或测量指示突触发生的一种或多种标记的表达。
44.方法，其包括提供神经元细胞或神经元前体细胞或者祖细胞的第一种和第二种培养物，其中第一种培养物中的细胞与第二种培养物中的细胞具有不同表型；并比较第一种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元与第二种培养物中的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元。
45.根据权利要求44的方法，其中第一种培养物中的细胞含有目的基因中的突变，并且第二种培养物中的细胞不含有所述突变。
46.根据权利要求44的方法，其中第一种培养物中的细胞含有导入的基因，并且第二种培养物中的细胞不含有所述导入的基因。
47.根据权利要求44的方法，其中第一种培养物中的细胞过表达一种内源基因，并且第二种培养物中的细胞不过表达所述内源基因。
48.根据权利要求44到47任一项的方法，其包括诱导ES细胞分化成根据权利要求1到28任一项的方法的神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞。
49.根据权利要求48的方法，其中在第一种培养物中，ES细胞含有目的基因中的突变，在第二种培养物中，所述细胞不含有所述突变。
50.根据权利要求48的方法，其包括用核酸构建体转染解离的EB的第一种培养物，从而与第二种培养物中的细胞相比，改变第一种培养物中细胞的表型。
51.根据权利要求44到50任一项的方法，其包括在测试条件下培养神经元前体细胞或者祖细胞或者神经元细胞的第一种和第二种培养物；检测、定量、观察或者确定细胞的一种或多种神经元特征；并比较第一种培养物中细胞的神经元特征与第二种培养物中细胞的神经元特征。
52.根据权利要求51的方法，其中在第一种条件下培养包括在Aβ肽存在下培养细胞，并且在第二种条件下培养细胞包括在Aβ肽不存在时培养细胞。
53.根据权利要求52的方法，其中神经元特征是轴突降解。
54.基本上如本文描述的方法。
全文摘要
提供了用于诱导胚胎干细胞分化成神经元前体的方法以及神经元前体或者祖细胞的测定法，和用于鉴定抑制或者减小轴突退化的增加的试剂的方法。
文档编号C12N5/00GK1997733SQ200580021045
公开日2007年7月11日 申请日期2005年5月4日 优先权日2004年5月5日
发明者Y-A·巴德, M·彼贝尔, J·里奇特, K·L·特克 申请人:诺瓦提斯研究基金会弗里德里克·米谢尔生物医学研究所