专利名称：基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过pcDNA基因载体体外转导神经营养因子基 因，促使眼内移植的骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化，同时 特异性分泌神经营养因子和大量相关生长因子，营养、支持周围视网 膜神经细胞的方法。
技术背景在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分 裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足， 保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞(stemcell)。 一旦 生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。即 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)就是其中之一。在体内、夕卜不同' 条件下，MSCs可以定向地被诱导分化为中胚层来源的细胞如成骨细 胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肌腱细胞，还可跨胚层向内 胚层和神经外胚层的神经元及神经胶质细胞分化。有研究表明MSCs 能分泌某些神经营养因子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)禾口神经生长因子(neurotrophin, nerve growth factor, NGF)，此外MSCs分化的神经元样和星形胶质样细胞可 能也分泌生长因子。星形胶质细胞也产生许多生长因子，包括神经营 养素家族所有成员如NGF、 BDNF、睫状神经营养因子(CiliaryNeurotrophic Factor, CNTF)和成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)等，这些细胞因子能够促进中枢 神经元细胞的增殖和分化。NGF是神经元存活、生长、分化所必需的一类分泌性蛋白质，其中 最具代表性的是BDNF。BDNF能促进若干种离体培养的神经元存活和突 起生长；在体内能阻止某些神经元的程序性死亡。视觉系统中视网膜 节细胞层(GCL)的无长突细胞和节细胞都能表达BDNF的mRNA，并具有 BDNF受体，但BDNF的合成主要是在大脑皮质和海马区。研究发现视神 经横断后，眼内注入BDNF能挽救大量的节细胞免于凋亡。 当代基因工程提供了各种载体，可将核酸片段导入细胞中表达。其中 脂质体基因载体是较为广泛和安全的一种。该载体可将外源基因整合 到靶细胞中，使目的基因在靶细胞中稳定表达。已经有实验证明。因此，利用pcDNA将BDNF基因导入MSCs，这种重组了BDNF基因的 MSCs植入眼底后，由于BDNF的作用，较未经基因修饰的MSCs可提高眼 内存活能力及向视网膜神经细胞分化的比例，同时大量旁分泌的BDNF 因子和相关生长因子，可以营养、支持周围的视网膜神经细胞，特别 是一些病变组织及周围细胞。因此本方法可以为将来干细胞治疗青光 眼、视网膜色素变性、视神经挫伤及老年黄斑变性、糖尿病引起的视 网膜病变等视网膜眼底疾病提供来源充足、可取自自体的种子细胞， 以及使种子细胞能更好地发挥补充受损视网膜神经细胞，维持、保护 残存视网膜神经细胞作用的新方法。另外，转导某些缺陷基因或治疗 基因，在提外对MSCs进行功能激活和调控，将其作为基因治疗的载体;利用MSCs在体内的靶向性，还可将载有目的基因的MSCs用于治疗遗传 性神经病和神经系统其他疾病，同时为与之相关的药物开发和筛选提 供了一种新的模型。 发明内容本发明的目的是提供一种基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复 视网膜损伤的方法。通过自制的重组人类BDNF基因的脂质体，将BDNF 基因导入MSCs，经筛选获得重组了BDNF基因的MSCs (BDNF-MSCs)， 将BDNF-MSCs植入眼底，在自分泌的BDNF诱导下定向分化为视网膜 神经细胞，并特异性分泌BDNF因子和相关生长因子修复视网膜损伤 的方法。采用以下技术方案 一种基因修饰的间充质干细胞眼内移植 修复视网膜损伤的方法，其特征在于移植前在体外用外源性神经营养 因子对间充质干细胞进行基因修饰。所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方 法，其特征在于所述的外源性神经营养因子为人脑源性神经营养因子 基因。所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方 法，其特征在于通过脂质体将外源性神经营养因子基因导入间充质干 细胞。所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方 法，其特征在于重组质粒以特定的浓度、时间感染间充质干细胞，从 而使外源基因在间充质干细胞内稳定表达。所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方法，其特征在于通过以特定的剂量和频率注射干细胞动员剂，从外周 血中提取间充质干细胞。机体注入干细胞动员剂，动员骨髓干细胞到达外周血中，提取MSCs，利用梯度离心和反复贴壁的方法进行培养纯化。从人血白细胞 中克隆出人BDNF的DNA片段，构建pcDNA-hBDNF。以重组BDNF基因的脂 质体感染MSCs，通过耐要药基因筛选，使BDNF在MSCs内稳定表达。本 发明能够在通过高效转导使外源性基因在MSCs中稳定表达的同时，保 持MSCs在体内、外的多分化潜能和其他干细胞的生物特性。本发明的另一个主要内容是通过特定的细胞密度和注射方式使 BDNF-MSCs在眼内分化为视网膜神经细胞，同时通过特异性分泌BDNF因子和相关生长因子营养、支持周围视网膜神经细胞。通过多焦视网 膜电生理可以证明BDNF-MSCs移植组与单纯MSCs移植组和生理盐水组 比较修复情况均有显著提高(P〈0.01)。在一个月的时间点由为突出。 本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳 动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的基因转导及眼底移植 的关键技术方法。
具体实施方式
实施例(一)、外周血动员的MSCs提取与纯化每只兔皮下注射重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF) 10Pg/kg， 一 天两次，连续注射5天。心脏取血10ml/只，用肝素化的无菌注射器 抽吸血液与PBS液1: l混匀，轻轻铺于等量的淋巴细胞分离液上(相对密度1. 077) ， 1000g/min离心25min。吸取骨髓单个核细胞存在层， 加入PBS液洗涤3次。取骨髓单个核细胞1X107ml，接种于75ml 培养瓶中恒温培养。于第二天换液，以后每3 4天换液。观察细胞 达80%融合后，加入1 : 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/L EDTA混合液 消化，终止消化后，将上述筛选出来的MSCs重新接种至两个75ml 培养瓶中，反复传代、扩增、纯化，传至第4代流式细胞仪鉴定CD34(-)，CD45 (-)，和CD105(+)。(二)、重组pcDNA—hBDNF表达载体的构建根据NCBI Sequence (BC029795)hBDNF基因序列，设计引物5' gca agc tta tga cca tcc ttt tcc 3，(下戈機为Hind II聰切位点)； 5， get cta gat ctt ccc ctt tta atg 3'(下划线为Xba I酶切位点)。 PCR技术克隆BDNF基因序列。真核表达载体pcDNA3. 1/myc-His (B) 和PCR特异性扩增产物分别用限制性内切酶Hind III和Xbal进行消 化，消化后的载体与hBDNF基因片段以1 : 3的摩尔数比混合，加5U 的T4连接酶，16"C反应16h。反应产物用CaCl2热休克法转化感受态 DH5 a菌。转化菌涂布于含100 u g/ml氨苄青霉素的LB固体平板培养 基，挑取菌落，用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切提取的质粒， 然后进行测序分析如下ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCA TGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAG GTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGA GAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGA GGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGC AGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTT TGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTAC CTAGACGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTG ACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAG TGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACAT GTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCA AAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATC CCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAA GGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCG GGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCA TAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGG GGAAGAT (三)、通过脂质体转导BDNF基因制备溶液A:取10 u g重组质粒pcDNA—hBDNF溶于100 y 1无血 清、无抗生素的DMEM培养基。同时制备溶液B:将20 ul Lipofectamine稀释于80 u 1无血清、无抗生素的DMEM培养基。混 合A、 B液体室温静置15分钟后，加0. 8ml无血清、无抗生素的DMEM 培养基中。弃去六孔板中的培养基，并将lmlA、 B混合液加入六孔板 中，37° C、 5%0)2条件下培养8小时。弃转染液，加入2ml完全培养 基，继续培养。ELISA测定转染后24小时、48小时、72小时、96小时间充质干细胞培养上清在450nm处的吸光度，确定hBDNF表达的相 对含量随时间增加hBDNF表达量增高，72小时达到高峰。间充质 干细胞培养上清经蛋白纯化柱HisTrapHP过柱纯化后，进行 Western-blot检测hBDNF蛋白的表达，得到分子量约为12. 3KD的单 一阳性条带。(四)、兔视网膜移植BDNF-MSCs修复视网膜损伤乌拉坦5ml/kg耳缘静脉注射青紫蓝兔，麻醉后行玻璃体切割手 术，去除玻璃体及后界膜后，于视乳头下方6-8PD位置，氩激光能量 0.2W，暴光时间O. 15S，光斑直径50um，每光斑间距100um，造成4 X6排列，共24个激光斑。角膜缘平坦部进针，缓慢推针l誦/rain，射 BDNF-MSCsl07m10. 5ml。结果细胞移植后7、 14、 30天观察眼压，B 超结果，证明其安全性(P<0.05)。比较各个时间点的眼底照影和病 理切片和多焦ERG统计学分析，可以证明BDNF-MSCs移植组与单纯MSCs 移植组和生理盐水组比较修复情况均有显著提高(P<0.01)。在一个 月的时间点由为突出。
权利要求
1、一种基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方法，其特征在于移植前在体外用外源性神经营养因子对间充质干细胞进行基因修饰。
2、 按照权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复 视网膜损伤的方法，其特征在于所述的外源性神经营养因子是人脑源 性神经营养因子基因。
3、 按照权利要求1或2所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植 修复视网膜损伤的方法，其特征在于通过脂质体将外源性神经营养因 子基因导入间充质干细胞。
4、 按照权利要求1或2所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植 修复视网膜损伤的方法，其特征在于重组质粒以特定的浓度、时间感 染间充质干细胞，从而使外源基因在间充质干细胞内稳定表达。
5、 按照权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复 视网膜损伤的方法，其特征在于通过以特定的剂量和频率注射干细胞 动员剂，从外周血中提取间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及基因修饰的间充质干细胞眼内移植修复视网膜损伤的方法。技术方案用干细胞动员剂将间充质干细胞动员到外周血中，用自身的生物学特性分离、扩增、纯化间充质干细胞；从人血白细胞基因组中克隆人脑源性神经营养因子序列，构建重组人脑源性神经营养因子的pcDNA表达载体，将脑源性神经营养因子基因导入间充质干细胞；制作视网膜激光损伤模型；通过玻璃体及后界膜切除后，将脑源性神经营养因子基因修饰的间充质干细胞植入眼底。在间充质干细胞的分化和脑源性神经营养因子的特异性表达下，视网膜损伤部位的修复程度显著提高。本发明可以明显修复视网膜损伤，提高干细胞移植的应用价值，为基因、干细胞治疗视网膜疾病提供了新的技术。
文档编号C12N5/10GK101333542SQ200710011839
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月25日 优先权日2007年6月25日
发明者何星儒 申请人:何星儒