专利名称：一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制法及其应用和制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝干细胞及其制备方法、该肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用、以及包括该肝干细胞的制剂。特别地，本发明涉及胰岛素基因修饰的肝干细胞的制备方法和应用，以及其胰岛素基因修饰的肝干细胞及其制备方法、该胰岛素基因修饰的肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用、制备该胰岛素基因修饰的肝干细胞抗原负载的肝干细胞的制剂。
背景技术：
目前治疗糖尿病的方法主要为传统的治疗方法有注射胰岛素、口服降糖药、控制饮食等，但往往最终患者造成胰岛素依赖，目前也还无合适的治疗手段。为了寻求更安全、 有效及高质量的治疗方法，各国学者在不断地探索并寻找出更好的手术方法，提高糖尿病患者治疗效果或控制糖尿病患者胰岛素使用量。肝干细胞是一种来源于肝脏Herring狭隙和肝内胆管的具有双向分化潜能的细胞，能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞。由于肝脏和胰脏在胚胎发育时期，属于同一发育胚层，在发育过程中两者之间能相互转化分化。已有研究表明肝干细胞能在体内体外转分化成胰岛β细胞，在临床上具有治疗糖尿病的可能。杨立军，等，成体肝干细胞向胰腺产生内分泌激素的细胞的体外转分化，美国国家科学院报，2002，99 (1 =8078-8083.现有技术中肝干细胞多数来源于流产胎儿的肝脏。我们选用骨髓、脐血或脐带，通过体外分离纯化，以及传代培养，这就解决临床应用上来源的问题，和临床上不能应用异体细胞治疗的伦理上问题。现有技术仅公开了如何得到相关肝干细胞但并未教导对获取的肝干细胞进行处理。
发明内容
为了克服现有以无论西医还是传统中医，迄今为止在治疗糖尿病上均局限于“降糖”上，对于激活、修复、再生损伤、硬化、萎缩的胰岛β细胞均无良策。，本发明的目的是提供一种胰岛素基因修饰的肝干细胞及其制备方法、在制备糖尿病制剂中的应用、以及制备该胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂。本研究提供了一种以肝干细胞为目标，通过胰岛素基因修饰制备成能分泌胰岛素并分化为胰岛β细胞的肝干细胞，在治疗糖尿病应用克服现有治疗技术的不足和缺陷。其中，所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过以下方法制备，该方法包括对肝干细胞进行克隆好的胰岛素基因的腺病毒修饰的步骤，所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过使肝干细胞与胰岛素基因克隆载体电穿孔完成，所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。本发明还提供了由上述的方法得到的胰岛素基因修饰的肝干细胞。本发明还提供了一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制剂，所述肝干细胞制剂包括肝干细胞，其特征在于，所述肝干细胞为本发明所述的胰岛素基因修饰的肝干细胞。
本发明还提供了本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞制剂在制备糖尿病制剂中的应用。本发明还提供了一种制备本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂，其中，所述制剂包括1)肝干细胞基础培养基；2)胰岛素基因；3)胰岛素基因克隆的载体；4)生理盐水；以及5)使用说明书；其中，所述胰岛素基因克隆的载体选自由腺病毒、慢病毒所组成的组中；所述使用说明书包括本发明所述的肝干细胞的制备方法。由于本发明的肝干细胞经过了胰岛素基因克隆的载体的修饰，由此得到的肝干细胞产生了与肝干细胞不同的变化(比如特异表达了胰岛素)，因此，由本发明提供的胰岛素基因修饰的肝干细胞以及由该胰岛素基因修饰的肝干细胞得到的制剂，能分泌胰岛素并在体内和体外分化为胰岛β细胞，从而为糖尿病的根治提供了可能。
图1为实施例1的肝干细胞形态；图2为实施例1的肝干细胞表达AFP和SK19的荧光免疫图片；图3为实施例1的肝干细胞表达Nestin蛋白的荧光免疫图片；图4显示胰岛素基因修饰的肝干细胞表达胰岛素蛋白电泳图片；
图5为胰岛素基因修饰的肝干细胞在糖尿病动物模型中修复受损部位的修复。治疗前后变化。
具体实施例方式本发明提供了一种胰岛素基因修饰的肝干细胞的制备方法，其中，该方法包括对肝干细胞进行克隆好的胰岛素基因的腺病毒修饰的步骤，所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过使肝干细胞与胰岛素基因克隆载体电穿孔完成，所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。优选地，所述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为0. 1 40到 40 0. 1，所述电穿孔的时间为0.证-1池。更优选所述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为1 2，所述电穿孔的时间为03h-2h。适当电穿孔比例有助于两者产生更好的修饰细胞，并使肝干细胞仅含有一个胰岛素基因克隆载体。本发明可以使用现有的载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。最优选，所述载体选腺病毒、慢病毒所组成的组中。本发明适用于所有能够从中分离出肝干细胞的来自由脐带、骨髓、和脐带血所组成的组中。其中，所述肝干细胞来自骨髓。本发明还提供了由上述的方法得到的肝干细胞。肝干细胞在经过本发明的制备后，所述肝干细胞的所表达的蛋白发生了变化。所述肝干细胞特异表达胰岛素。反过来，通过检测胰岛素的在修饰前后的变化，可以检测出所述修饰过程是否成功。
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肝干细胞通常借用正常肝干细胞标志进行检测。例如白蛋白、AFP等可确定细胞分化程度，是细胞标志的重要蛋白。。本发明还提供了本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞以及本发明的肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用。本发明还提供了一种制备本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂，其中，所述制剂包括1)肝干细胞基础培养基；2)胰岛素基因；3)胰岛素基因克隆的载体；4)生理盐水；以及5)使用说明书；其中，所述胰岛素基因克隆的载体选自由腺病毒、慢病毒所组成的组中；所述使用说明书包括本发明所述的肝干细胞的制备方法。其中，所述肝干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养肝干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述肝干细胞培养体系包括肝干细胞和3mL-50mL的肝干细胞基础培养基，在371、5%0)2培养箱中培养。所述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为1 2，所述电穿孔的时间为03h-2h等。本发明还提供了一种肝干细胞制剂，其中，所述肝干细胞为本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞。在制备肝干细胞制剂之前，用生理盐水洗涤并重悬所述胰岛素基因修饰的肝干细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的肝干细胞制剂在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。所述组合物包括1 X IO5到5 X IO7个/mL本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞；优选为5 X IO5到1 X IO7 个/mL。本发明还提供了本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用。所述肝干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养肝干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述肝干细胞培养体系包括肝干细胞和lmL-100mL、优选30_80mL的肝干细胞基础培养基，在37°C、5% CO2培养箱中培养。其中，述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为1 2，所述电穿孔的时间为03h-2h等。本发明还提供了一种治疗糖尿病的方法，其包括给患者施用选自由本发明的肝干细胞、本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞以及本发明的肝干细胞制剂所组成的组中的制剂。优选所述施用的方式为介入注射。具体地，施用肝干细胞的方式选自由介入注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；所述肝干细胞优选来自细胞浓度为 1 X IO5到1 X IO8细胞/mL的本发明的肝干细胞，其有效量为0. lmL-5mL/个体；所述肝干细胞制剂优选包括1 X IO5到5 X IO7个/mL本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞，其有效量为 0. lmL-2mL/ 个体。以上所述肝干细胞和所述肝干细胞制剂都是一次注射的剂量，一个疗程三次注射，间隔一周。两种肝干细胞一般在注射完第二针后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是空腹血糖降低、胰岛素注射用量减少等。一个疗程结束后，可以间隔两个月后继续给药，可以治疗两个或四个疗程；如有必要，间隔时间为六个月或一年还可继续再治疗。其中，所述有效标准还可以分为以下两个等级1.患者空腹血糖检测对患者空腹血糖水平降低，可能检测水平在正常范围内等。2.患者胰岛素注射用量检测每日监测患者胰岛素注射用量，以减少或停止为目标等。优选所述肝干细胞和/或所述肝干细胞来自于同一患者，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。实施例1 脐带组织中的肝干细胞的分离和培养脐带组织来自孕妇生产后采集的脐带。与该患者签署了知情同意书，在其生产后采集其脐带。用眼科剪将其剪碎成为约Imm3的小块。所得剪碎的组织小块用0.25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积五分之一的小牛血清(美国Hyclone公司)终止，以IOOOrpm离心收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清， 然后0. 01 % DNAse (DNA酶，上海生工)的HBSS (汉斯缓冲液，上海生工)以1克ImL的重量体积比洗涤三次，所得离心沉淀用0. 25%胰酶溶液以1克ImL的体积比在37°C下混勻接触10分钟，然后在IOOOrpm下离心5min收集细胞，用以1克ImL的重量体积比用杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基重悬。所得重悬液用40-mm分子筛(美国BD公司)过滤。用所述孔径的分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液。收集剩余的所述细胞悬液后，向其中含有10%小牛血清、40ng/mL人表皮生长因子(印idermal growth factor，EGF)、40ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子(bEGF)和 30mg/mL 胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12 (Dulbecco，s modified Eagle，s medium_F12) (DMEM/ F12)培养基(美国Hyclone公司)使细胞悬液浓度被稀释为2X105细胞/mL。然后将每5mL 所得稀释的细胞悬液转移至25cm2灭菌塑料培养瓶中在37°C、5% CO2培养箱中培养Mh。培养所得细胞呈神经球状生长，倾去培养基，然后用5mLHBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。并添加新鲜的含有10% 小牛血清、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔_F12(DMEM/F12)培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90%时， 用Accutase消化后，用含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12 (DMEM/F12)培养基进行传代培养(1瓶传几个瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2 X IO5细胞/mL)。按照上述传代条件再传 4代，得到贴壁的细胞。取1瓶培养到5代的肝干细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用ImLl XPBS重悬， 计数。取1份50yU2X106个)上述的传代得到细胞悬液分别在六孔板中生长，后用ALB、 K19、AFP、Nestin等抗体进行免疫荧光检测，结果显示，大多数的肝干细胞表达为阳性。实施例2 从骨髓和脐带血中培养的肝干细胞骨髓或脐血来源的处理过程经FicolI-Hypaque密度梯度离心，中分离单个细胞后，细胞记数，加入完全培养基，培养为完全培养基，含表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，碱性表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，以及含胎牛血清5% -15%的DMEM/F12(1 1)。按1-5X105细胞/cm2的密度种植于75cm2的培养瓶中，每瓶加入培养液为10ml。将培养瓶盖口拧紧，然后内旋1圈，放入患者专用培养箱，370C，5% C02培养，培养第三天，半量换液。 换液时将培养液缓慢吸出，加入新鲜的完全培养基，每瓶加入5ml，370C，5% C02培养。当细胞贴壁达到80-90 %时，将细胞通过用胰酶或阿库替斯酶消化，离心收集后进行培养，为完全培养基，含表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，碱性表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，以及胎牛血清5%-15%的DMEM/F12(1 1)。同样当细胞贴壁达到80-90%时，进行消化传代培养。取1瓶培养到5代的肝干细胞胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用ImLlXPBS重悬，计数。取1份50yU2X106个)上述的传代得到细胞悬液分别在六孔板中生长，后用 ALB、K19、AFP、NeStin等抗体进行免疫荧光检测，结果显示，大多数的肝干细胞表达为阳性。实施例3 胰岛素基因克隆腺病毒修饰肝干细胞的制备取构建好的胰岛素基因克隆腺病毒(美国htrogen公司)与肝干细胞以1 2 比例，通过电穿孔1小时，将胰岛素基因克隆腺病毒植入肝干细胞中。电穿孔完之后，将胰岛素基因修饰肝干细胞在DMEM/F12(1 1)完全培养基(含表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，碱性表皮生长因子为5ng/ml-50ng/ml，以及胎牛血清 5% -15% )中培养，使细胞贴壁生长达到80-90%。应用胰岛素ELISA试剂盒(美国R&D 公司)检测胰岛素基因修饰肝干细胞表达胰岛素情况。实施例4 胰岛素基因修饰的肝干细胞在糖尿病模型中应用以含10%小牛血清的DMEM/F12(1 1)为培养基，将3 X IO6个的肝干细胞用上述实施例3所得的胰岛素基因修饰的肝干细胞(得自IX IO6肝干细胞)。将所述胰岛素基因修饰的肝干细胞用生理盐水洗涤3次然后重悬至IX IO6个/mL的浓度，4°C下保存备用。建立糖尿病鼠模型，随机分为A、B和C 3组，每组10只，A组为胰岛素基因修饰的肝干细胞治疗组，B组为肝干细胞为对比组(注射液制备方法与A组相同)，C组为同体积生理盐水空白组。A和B两组在第0天鼠模型肝动脉输注0. 5-2 X IO6个/mL肝干细胞，各 0. 5mL，半个月后再同样剂量免疫1次。注射后分别于7、14、21、28d监测鼠模型血糖水平， C组于相同时间点在肝动脉输注0. 5mL生理盐水并计算鼠模型血糖大小。胰岛素基因修饰的肝干细胞对糖尿病鼠模型的血糖情况(mmol/L，x±s)见表1。表 1
組别血糖水平治疗前治疗后7d治疗后Hd治疗后21d治疗后28d治疗组17.310.39.2±3.6*4.3±1.”3.4±1.3#3.2 士 1·3λ对比组18.9:1:0.514.2±1.4*7.2±1.2*6.2±1.2#6.5士1.1#空白组16.5:10.718.2±2.317.1±1.616.8±1.718.3±2.1注空白组与肝干细胞治疗组相比P远小于0. 01 ；#对比组与肝干细胞治疗组相比 P < 0. 01。此外，有关实施例2所得胰岛素基因修饰的肝干细胞的体内减低血糖活性，远远好于有关制备例1中的肝干细胞。
权利要求
1.一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制备方法，该方法包括通过脐带、骨髓或脐带血分离得到肝干细胞，将克隆胰岛素基因的腺病毒修饰肝干细胞得到胰岛素基因修饰的肝干细胞，其特征在于，所述肝干细胞通过以下方法制备，该方法包括对肝干细胞进行克隆好的胰岛素基因的腺病毒修饰的步骤，所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过使肝干细胞与胰岛素基因克隆载体电穿孔完成， 所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为0.1 40到40 0. 1，所述电穿孔的时间为0.证-1 1。
3.据权利要求2所述的方法，其中，所述肝干细胞与胰岛素基因克隆载体中的比例范围为1 5，所述电穿孔的时间为0jh-5h。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体选腺病毒、慢病毒所组成的组中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝干细胞来自由脐带、骨髓、和脐带血所组成的组中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述肝干细胞来自骨髓。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝干细胞表达胰岛素，并能在体内体外分化成胰岛β细胞。
9.由权利要求1-18中任意一项所述的方法得到的胰岛素基因修饰的肝干细胞。
10.一种肝干细胞制剂，所述肝干细胞制剂包括肝干细胞，其特征在于，所述肝干细胞为权利要求13所述的胰岛素基因修饰的肝干细胞。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中，所述制剂包括1X IO5到5 X IO7个/mL所述胰岛素基因修饰的肝干细胞。
12.权利要求17所述的胰岛素基因修饰的肝干细胞在治疗糖尿病制剂中的应用。
13.一种制备权利要求12所述的胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂，其特征在于，所述制剂包括1)肝干细胞基础培养基；2)胰岛素基因；3)胰岛素基因克隆的载体；4)生理盐水；以及5)使用说明书；其中，所述胰岛素基因克隆的载体选自由腺病毒、慢病毒所组成的组中；所述使用说明书包括权利要求1-12中任意一项所述的方法。
全文摘要
本发明提供一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制备方法及其在制备糖尿病制剂中的应用，以及包括该胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂。本发明还包括胰岛素基因修饰的肝干细胞的制备方法和应用。由本发明提供的胰岛素基因修饰的肝干细胞制备的制剂，能够在体内修复糖尿病中损伤的胰岛β细胞，分泌出胰岛素，从而为克服糖尿病依赖胰岛素治疗，根治糖尿病的治疗提供了可能。
文档编号A61K35/14GK102154210SQ20101060883
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者沈达青 申请人:沈达青