细胞移植用细胞结构体、生物亲和性高分子块及它们的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞移植用细胞结构体、生物亲和性高分子块以及它们的制造方法。 详细而言，本发明涉及在移植后可以抑制细胞坏死的细胞移植用细胞结构体、其制造中使 用的生物亲和性高分子块、以及它们的制造方法。
【背景技术】
[0002] 目前，使陷入功能障碍、功能衰竭的生物体组织、器官实现再生的再生医疗的实用 化得到发展。再生医疗是使用细胞、支架及生长因子这三种因子重新作出仅通过生物体所 具有的自然痊愈能力无法恢复的生物体组织并使其具有与原来的组织相同的形态、功能的 新的医疗技术。近年来，使用细胞的治疗逐渐得到实现。例如，可以列举使用自体细胞的培 养表皮、使用自体软骨细胞的软骨治疗、使用间充质干细胞的骨再生治疗、使用成肌细胞的 心肌细胞片治疗、利用角膜上皮片的角膜再生治疗及神经再生治疗等。这些新的治疗不同 于以往的利用人造物的替代医疗（例如，人造骨修复剂、透明质酸注射等），可实现生物组 织的修复、再生，能够得到高治疗效果。实际上，使用自体细胞的培养表皮、培养软骨等产品 已在市售。
[0003] 例如，在使用细胞片的心肌的再生中，为了再生具有厚度的组织，认为需要细胞片 的多层结构体。近年来，闪野等人开发了使用温度响应性培养皿的细胞片。由于细胞片不需 要胰蛋白酶等的酶处理，因此可保持细胞与细胞的结合及粘附蛋白（非专利文献1至6)。这 种细胞片制造技术可期待对心肌组织的再生有用（非专利文献7)。另外，为了在细胞片中 形成血管网，闪野等人进行了一并引入有血管内皮细胞的细胞片的开发（非专利文献8)。
[0004] 此外，专利文献1中记载了一种细胞三维结构体，其通过将具有生物亲和性的高 分子块和细胞三维配置为嵌合状来制造。该细胞三维结构体中，能够从外部向细胞三维结 构体的内部进行营养输送，具有充分的厚度，并且细胞在结构体中均匀地存在。另外，专利 文献1的实施例中，使用包含重组明胶、天然明胶材料的高分子块证实了高细胞存活活性。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1 :国际公开W02011/108517号公报
[0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献 1 :Shimizu, T?等，Circ. Res. 90, e40-48 (2002)
[0010] 非专利文献 2 :Kushida, A?等，J. Biomed. Mater. Res. 51，216-223 (2000)
[0011] 非专利文献 3 :Kushida, A?等，J. Biomed. Mater. Res. 45, 355-362 (1999)
[0012] 非专利文献 4 :Shimizu, T.，Yamato, M.，Kikuchi, A. &0kano, T.，Tissue Eng. 7, 141-151(2001)
[0013] 非专利文献 5 :Shimizu, T 等，J. Biomed. Mater. Res. 60, 110-117 (2002)
[0014] 非专利文献 6 :Harimoto, M?等，J. Biomed. Mater. Res. 62, 464-470 (2002)
[0015] 非专利文献 7 :Shimizu, T.，Yamato, M.，Kikuchi, A. &0kano, T.，Biomaterials 24, 2309-2316(2003)
[0016]非专利文献 8 〖Inflammation and Regeneration vol. 25No. 32005, pl58_159?第 26次日本炎症-再生医学会、"炎症学t再生医学?融合爸目指L T "、闪野光夫
【发明内容】
[0017] 发明所要解决的课题
[0018] 专利文献1的实施例记载的细胞结构体的高分子块中，为了进行高分子的交联， 使用了对人体的毒性强的戊二醛。这种使用戊二醛制造而成的细胞结构体对人体的毒性令 人担忧，因此，为保险起见，无法用于细胞移植治疗。因此，尚未提供不含有戊二醛这样的具 有人体毒性的物质、且能够抑制移植后的细胞坏死的细胞结构体，期望满足这些条件的适 合于细胞移植治疗用途的细胞结构体。
[0019] 本发明的课题在于提供不含有戊二醛这样的具有细胞毒性的物质、且抑制结构体 中的移植后的细胞坏死（即，细胞存活率优异）的细胞移植用细胞结构体。此外，本发明的 课题还在于提供适合制造上述细胞移植用细胞结构体的生物亲和性高分子块。此外，本发 明所要解决的课题还在于提供上述细胞移植用细胞结构体的制造方法、以及上述生物亲和 性高分子块的制造方法。
[0020] 用于解决课题的手段
[0021] 本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在通过使用不含戊二醛 的生物亲和性高分子块和至少一种细胞、并在多个细胞间的间隙内配置多个生物亲和性高 分子块来制造细胞移植用细胞结构体时，通过使用振实密度为l〇mg/cm 3以上且500mg/cm3 以下、或者二维截面像的截面积的平方根+周长的值为0. 01以上且0. 13以下的生物亲和 性高分子块，能够提供解决了上述课题的细胞移植用细胞结构体，从而完成了本发明。
[0022] 即，根据本发明，提供一种细胞移植用细胞结构体，其为含有不含戊二醛的生物亲 和性高分子块和至少一种细胞、且在多个细胞间的间隙内配置有多个生物亲和性高分子块 的细胞移植用细胞结构体，上述生物亲和性高分子块的振实密度为l〇mg/cm 3以上且500mg/ cm3以下、或者上述高分子块的二维截面像的截面积的平方根+周长的值为0. 01以上且 0. 13以下。
[0023] 此外，根据本发明，提供一种生物亲和性高分子块，其为不含有戊二醛的生物亲和 性高分子块，振实密度为lOmg/cm 3以上且500mg/cm3以下、或者二维截面像的截面积的平方 根+周长的值为0. 01以上且0. 13以下。
[0024] 优选一个生物亲和性高分子块的大小为20 y m以上且200 y m以下。
[0025] 优选一个生物亲和性高分子块的大小为50 ym以上且120 ym以下。
[0026] 优选生物亲和性高分子利用热、紫外线或酶进行了交联。
[0027] 优选生物亲和性高分子块的交联度为6以上，且上述生物亲和性高分子块的吸水 率为300%以上。
[0028] 优选生物亲和性高分子块为通过将生物亲和性高分子的多孔体粉碎而得到的生 物亲和性高分子块。
[0029] 优选生物亲和性高分子的多孔体通过包括下述步骤的方法制造而成，
[0030] (a)将生物亲和性高分子的溶液通过冻结处理进行冻结的步骤，该冻结处理中，溶 液内液温最高的部分的液温（内部最高液温）在未冻结状态下为"溶剂熔点-3°C"以下；和
[0031] (b)将上述步骤（a)中得到的冻结后的生物亲和性高分子进行冷冻干燥的步骤。
[0032] 优选步骤（a)中，通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的 部分的液温（内部最高液温）在未冻结状态下为"溶剂熔点_7°C "以下。
[0033] 优选生物亲和性高分子的多孔体具有下述（a)和（b)所述的特性。
[0034] (a)具有81%以上且99. 99%以下的孔隙率。
[0035] (b)尺寸为20~200 ym的孔隙所占的空间占有率为85%以上。
[0036] 优选细胞移植用细胞结构体的厚度或直径为400 y m以上且3cm以下。
[0037] 优选细胞移植用细胞结构体中，相对于一个细胞含有〇.〇〇〇〇〇〇1 y g以上且1 y g 以下的生物亲和性高分子块。
[0038] 优选生物亲和性高分子为明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、基因工程合成人 纤连蛋白（ProNectin)、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋 白、重组人纤连蛋白片段（RetroNectin)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质 酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。
[0039] 优选生物亲和性高分子为重组明胶。
[0040] 优选重组明胶由式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示，
[0041] (式中，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n 个X各自独立地表示任意一种氨基酸，n个Y各自独立地表示任意一种氨基酸，n表示3~ 100的整数，m表示2~10的整数。需要说明的是，n个Gly-X-Y各自可以相同也可以不 同）。
[0042] 优选重组明胶具有（1)序列号1记载的氨基酸序列、或（2)与序列号1记载的氨 基酸序列具有80%以上的同源性、且具有生物亲和性的氨基酸序列。
[0043] 优选细胞移植用细胞结构体含有血管发生因子。
[0044] 优选细胞为选自由多潜能细胞、成体干细胞、祖细胞和成熟细胞组成的组中的细 胞。
[0045] 优选细胞仅为非血管系细胞。
[0046] 优选细胞含有非血管系细胞和血管系细胞这两者。
[0047] 优选细胞移植用细胞结构体中，在细胞结构体中具有中心部的血管系细胞的面积 大于周边部的血管系细胞的面积的区域。
[0048] 优选细胞移植用细胞结构体具有中心部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞 的总面积为60%~100%的区域。
[0049] 优选细胞移植用细胞结构体具有细胞结构体的中心部的血管系细胞密度为 1. 0X104个细胞/ym3以上的区域。
[0050] 优选在细胞移植用细胞结构体的内部形成有血管。
[0051] 本发明的生物亲和性高分子块优选为了制造本发明的细胞移植用细胞结构体而 使用。
[0052] 根据本发明，还提供一种用于制造本发明的细胞移植用细胞结构体的试剂，其含 有本发明的生物亲和性高分子块。
[0053] 根据本发明，还提供一种用于制造本发明的细胞移植用细胞结构体的方法，其包 括将本发明的生物亲和性高分子块与至少一种细胞混合的步骤。
[0054] 根据本发明，还提供一种制造生物亲和性高分子的多孔体的方法，其包括：
[0055] (a)将生物亲和性高分子的溶液通过冻结处理进行冻结的步骤，该冻结处理中，溶 液内液温最高的部分的液温（内部最高液温）在未冻结状态下为"溶剂熔点_3°C "以下； 和
[0056] (b)将上述步骤（a)中得到的冻结后的生物亲和性高分子进行冷冻干燥的步骤。
[0057] 优选步骤（a)中，通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的 部分的液温（内部最高液温）在未冻结状态下为"溶剂熔点_7°C"以下。
[0058] 发明效果
[0059] 本发明的细胞移植用细胞结构体不含有戊二醛这样的具有细胞毒性的物质，由 此，能够用于细胞移植治疗，并且可抑制结构体中的移植后的细胞坏死，细胞存活率优异。
【附图说明】
[0060] 图1示出了体外ATP分析中的不同块的差异。
[0061] 图2示出了使用本发明的块或比较用块的hMSC嵌合细胞块中的细胞的存活状态 的差异（2周后）。
[0062] 图3示出了本发明的块群中的移植细胞的存活状态。该图示出了 hMSC嵌合细胞 块中的存活和块尺寸所带来的差异。
[0063] 图4示出了移植2周后的hMSC嵌合细胞块中的血管形成。
[0064] 图5示出了移植2周后的hMSC+hECFC嵌合细胞块中的血管形成。
[0065] 图6示出了多孔体中的各孔隙尺寸的空间占有率。
[0066] 图7示出了 CBE3多孔体的HE截面图像、孔形状和内部最高液温。
[0067] 图8示出了搁板温度-40°C(玻璃板2. 2mm)下的内部最高液温的时间变化。
【具体实施方式】
[0068] 以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
[0069] 本发明的细胞移植用细胞结构体为含有不含戊二醛的生物亲和性高分子块和至 少一种细胞、且在多个细胞间的间隙内配置有多个生物亲和性高分子块的细胞移植用细胞 结构体，上述生物亲和性高分子块的振实密度为l〇mg/cm 3以上且500mg/cm3以下、或者上述 高分子块的二维截面像的截面积的平方根+周长的值为〇. 01以上且〇. 13以下。
[0070] (1)生物亲和性高分子块
[0071] (1-1)生物亲和性高分子
[0072] 本发明中使用的生物亲和性高分子只要对生物体具有亲和性，则对于是否在生物 体内分解没有特别限定，但优选由生物分解性材料构成。作为非生物分解性材料，具体而言 为选自聚四氟乙烯（PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、有 机硅和MPC(2_甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱）的组中的至少一种材料。作为生物分解性 材料，具体而言为选自多肽（例如，以下说明的明胶等）、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共 聚物（PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳 素和壳聚糖的组中的至少一种材料。上述中，特别优选多肽。需要说明的是，这些高分子材 料可以进行了用于提高细胞粘附性的设计，作为具体的方法，可以利用如下方法：1. "利用 细胞粘附基质（纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白）、细胞粘附序列（利用氨基酸单字母表 示法表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG 序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列）肽对基材表面进行 包覆"、2. "基材表面的氨基化、阳离子化"、3. "利用等离子体处理、电晕放电对基材表面进 行亲水性处理"。
[0073] 关于多肽的种类，只要具有生物亲和性则没有特别限定，例如，优选为明胶、胶原 蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、基因工程合成人纤连蛋白、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝 心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、重组人纤连蛋白片段，最优选为明胶、胶原蛋白、去端胶 原蛋白（atelocollagen)。作为本发明中使用的明胶，优选天然明胶或重组明胶。进一步优 选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指利用来自于天然的胶原蛋白制作的明胶。关于重 组明胶，在本说明书中如后所述。
[0074] 本发明中使用的生物亲和性高分子的亲水性值" 1/I0B"值优选为0~1. 0。更优选 为0~0. 6,进一步优选为0~0. 4。I0B是以藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极 性的有机概念图为基础的亲疏水性的指标，其详细内容例如在"Pharmaceutical Bulletin "，vol. 2,2, pp. 163-173(1954)化学的领域"vol. 11，10, pp. 719-725 (1957) ;"FRAGRANCE JOURNAL"，vol. 50, pp. 79-82(1981)等中进行了说明。简言之，是将甲烷（CH4)作为所有有 机化合物的根源，将其他化合物全部视为甲烷的衍生物，对其碳原子数、取代基、修饰部、环 等分别设定一定的数值，将其得分相加，求出有机性值（0V)、无机性值（IV)，将该值绘制在 以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上而得到的图。有机概念图中的I0B是指有机概念 图中的无机性值（IV)与有机性值（0V)之比、即"无机性值（IV)/有机性值（0V)"。关于有 机概念图的详细内容，请参照《新版有机概念图-基础与应用》（甲田善生等著、三共出版、 2008)。本说明书中，使用取I0B的倒数而得到的"1/I0B"值来表示亲疏水性。"1/I0B"值 越小（越接近于〇)，表示越为亲水性。
[0075] 通过使本发明中使用的高分子的"1/I0B"值为上述范围，亲水性升高，且吸水性升 高，因此，推测其对营养成分的保持产生有效作用，结果，有助于本发明的细胞三维结构体 (嵌合细胞块）中的细胞的稳定化、易存活性。
[0076] 在本发明中使用的生物亲和性高分子为多肽的情况下，对于以总平均亲水性 (Grand average of hydropathicity，GRAVY)值表示的亲疏水性指标而言，优选为0.3 以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性（GRAVY)值可 以通过"Gasteiger E.，Hoogland C.，Gattiker A.，Duvaud S.，Wilkins M.R.，Appel R. D. , Bairoch A. ；Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server ； (In)John M. Walker (ed):The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005) ? pp. 571-607"及"Gasteiger E.，Gattiker A.，Hoogland C.，Ivanyi I.，Appel R. D. , Bairoch A. ;ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. ;Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)." 的方法得到。
[0077] 通过