细胞移植用临床治疗级真皮多能干细胞规模化制备培养方法
【专利摘要】本发明公开了临床治疗级真皮多能干细胞的培养、筛选、扩增技术，这些瓶颈一直是生物学干细胞领域研究热点和难点，目前利用基底膜显著黏附特性进行分离纯化，采用三维培养扩增手段获得。该发明适合依赖扩增贴壁型细胞并提供三维高拟体内细胞外基质系统进行目标细胞水平的筛选与分离。高模拟体内贴附环境，体外培养成体(胚胎皮肤)干细胞的生物细胞新培养技术。高模拟底物所在环境黏附筛选培养目标真皮多能干细胞，具有高传代能力，高增殖能力，并可在体外环境下形成分化全层真皮结构。筛出免疫原性细胞安全获得免疫逃逸，延长移植时间增加组织工程临床应用，促进创面愈合与皮肤疾病提供了绝对优势临床治疗级细胞的解决方案。
【专利说明】细胞移植用临床治疗级真皮多能干细胞规模化制备培养方 法 一、【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附 环境分离筛选，皮肤干细胞的培养、扩增技术。获得临床治疗级真皮多能干细胞应用于组织 工程皮肤构建技术中的活性种子干细胞。
[0002] 二、【背景技术】介绍：
[0003] 皮肤是人体最大的器官，参与抵御生物入侵、紫外线辐射以及防止水分丢失、调节 体温维持个体外貌等方面起着十分重要的生理作用，其是人体免疫系统组成的重要的一部 分，而皮肤细胞是构成这器官的基本单元，皮肤细胞基础研究领域是揭示皮肤健康、发育、 预防、治疗的重要科研途径。
[0004] 细胞外基质（extracellular matrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分， 是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的极其重要场所。早期研究学者 认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证 明学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。
[0005] Hay在11年后报道了 ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行 为的现象得以关注并进行广泛的研究，但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切 关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间"动态互惠"的模 型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞 浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。
[0006] 并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实 了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、 分化和程序性死（凋亡）的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接 激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们 必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复 中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的"生 物构架"。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM 的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。
[0007] 皮肤干细胞在正常皮肤组织中含量极少，干细胞公认是一种在体内具有无限更新 能力，且可分化形成相应全层组织分化细胞，体外培养具有长期生长潜能并可形成无限克 隆。是愈合修复创面，皮肤更新代谢再生的重要参与者。但由于目前缺乏理想筛选方法，对 干细胞进行筛选及鉴定方法报道较少。
[0008] 三、皮肤干细胞名称概述
[0009] 1981 年 Potten 提出，皮肤干细胞（skin stem cell)。表皮干细胞（epidermal sten cell，ESC)或角脫干细胞（Keratinocyte stem cell，KSC);真皮干细胞（dermis stem cell)、或真皮多能干细胞（dermal multipotent sten cell)或称为皮肤前体细胞 (skin-derived precursor)ο
[0010] 真皮间充质细胞又叫真皮多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有 广泛的分化潜能，可向多种中胚层和外胚层来源的组织细胞分化。近年来发现，这类细胞广 泛存在于成熟个体的多种组织中，并已证实问充质干细胞存在于骨髓、肌肉、大脑、骨膜等 组织中。真皮多能干细胞在体外培养时能分化成神经元、神经纤维、肌肉、脂肪等多种细胞。 [0011] 真皮多能干细胞存在于真皮层内。其数量较少，周围血供良好，营养丰富、所处微 环境具有优异性；在损伤或生长刺激等因素下可增殖，具有慢周期性；具有未分化细胞的 特征；自我更新增殖能力强；体外克隆能力突出等优势细胞特征。创伤修复的再生重建重 要愈合干性细胞。
[0012] 四、真皮多能干细胞概述
[0013] 真皮中多能干细胞的研究起步较晚，对于它的生物学认识目前才刚刚开始，因而 真皮多能干细胞目前尚未统一定义。但现在的研究结果证实，这种间充质干细胞来源的真 皮多能干细胞在成体内参与皮肤的再生与修复过程.且皮肤创伤后造成的微环境对真皮 多能干细胞具有一定的调控作用，这可能是由于创伤后皮肤局部因子发生改变，促进了真 皮多能干细胞的迁移分化，从而加速了创伤的修复。因而，有人推测干细胞与微环境之间的 相互作用是其参与修复的生理基础（Watt、Van、史春梦等.Shi等，2004)。真皮中多能干细 胞可作为真皮修复细胞的来源细胞，在毛囊和非毛囊的真皮中都有分布，但目前对其在真 皮内的具体定位尚不清楚。但越来越多的实验结果表明，在毛囊的毛乳头及毛囊真皮鞘中， 有具克隆性生长的成体干细胞分布，这些细胞具有一定的分化潜能，而在毛乳头中富含更 多的真皮多能干细胞（Jahoda等，2003 ;Legue等· 2005)。
[0014] 由于真皮多能干细胞相对易于获得，同时能进行多向分化，从而它在自体干细胞 基因治疗方面有广阔的基础及临床研究前景。
[0015] 五、真皮多能干细胞的特点
[0016] Toma等的研究结果表明，利用添加表皮生长因子（EGF)和碱性成纤维细胞生长因 子（bFGF)的培养液对分离得到的真皮多能干细胞进行体外培养，可形成球形克隆。目前的 资料显示，真皮多能干细胞可在体外进行扩增培养，并能传20代以上，具有强的增殖能力。 大量的实验结果显示=TGF-β抑制皮肤基底层角质形成细胞的增殖，但可促进成纤维细胞 的生长增殖。Yoko等研究证实在真皮多能干细胞的体外培养中添加 TGF-β，在保证细胞特 性稳定的前提下，可进一步促进真皮多能干细胞的增殖，TGF-β在真皮多能干细胞的增殖 过程中具有一定的作用。
[0017] 在添加一定的因子（如地塞米松、维生素 C、维A酸等）的分化诱导体系中培养，真 皮多能干细胞可向骨样细胞、软骨样细胞、脂肪样细胞、神经样细胞进行分化，具有多向分 化潜能（Dyce等，2004)。Gorio等将分离的大鼠真皮多能干细胞在体外培养扩增后，再自体 移植入受损的脊索内.60?90d后观察到移植的细胞依然存活，且分化为具有胶质细胞及 神经元细胞标志分子的细胞。研究结果表明，真皮多能干细胞可能具有异质性，含有一类小 体积但功能更为原始的细胞群，人们利用基因芯片方法检测到真皮多能干细胞表达多种不 同细胞类型的特定转录因子，包括骨细胞、神经细胞、肌肉等，这可能是其多向分化潜能的 分子基础。
[0018] 六、真皮多能干细胞的分离及鉴别
[0019] 对真皮多能干细胞多采用贴壁筛选的方法进行分离，同时利用这一方法并结合相 对特异标识分子、增殖活性、分化潜能等几方面对真皮多能干细胞加以鉴定。
[0020] 目前常根据特异性表面分子标识物和无限更新分化能力有无的特点来鉴别干细 胞。现在对真皮多能干细胞的研究并未发现特异的表面标识物，但它能表达CD90、CD59、 CD44等表面分子，特别在于真皮多能干细胞可表达表达nes-tin，而与真皮成纤维细胞不 同的是它不表达波形丝蛋白，也无胶原分泌功能。
[0021] 真皮多能干细胞在有毛区和无毛区的真皮中均有分布。史春梦等通过贴壁法分离 培养了大鼠和人包皮的真皮多能干细胞，表现出多能分化潜能，经诱导可向成骨细胞及脂 肪细胞分化。近年来，国外学者也通过干细胞培养基，分离培养了不同年龄段的人体真皮多 能干细胞克隆；其在体外培养的克隆数、增殖能力的大小以及其分化能力，受年龄的影响。 目前虽对真皮多能干细胞的研究刚刚起步，但已有研究表明其在组织工程、基因治疗及细 胞治疗等方面具有潜在的应用前景。
[0022] 七、传统筛分方法介绍
[0023] 因为皮肤干细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞胞外基质的粘附速度要比其它 类型细胞快得多，所以利用该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤干细胞筛选如下阐 述：
[0024] 方法一（3T3滋养层法）：人类皮肤细胞体外培养研究已有一个世纪的历史背景， 建立体外扩增培养体系于1975年由学者Rheinwald和Green所设计3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纤维细胞株3T3滋养层细胞，并用γ射线致死剂量照射，防止干细胞受到异种物种的影 响。灭活3T3滋养层细胞作为培养皮肤细胞的滋养层能促进皮肤细胞筛选的贴附和生长， 并具有未被论证的接触性抑制成纤维细胞生长的功能。实验室所选用的、功能较稳定的各 亚系但还不能完全排除对它的顾虑，还需继续观察和探索有效的替代方法。Green研究这种 方法的3T3虽然它是一个异种的具有问变性质的细胞，有不少实验室曾试图用其他措施予 以取代，但至今为止，它的效果在各种方法中仍是最有效的，继续被广泛应用。从第1例临 床应用至令已近30年，尚未发现因它而造成的不良后果。
[0025] 方法二（纤维蛋白原及凝血酶底物法）=Graziella P学者研究用纤维蛋白原及凝 血酶作为基质分离皮肤细胞；
[0026] 方法三（IV型胶原黏附法）Jone PH等利用上述方法从成人包皮或尸体皮经消 化，利用IV型胶原做底物基质分离皮肤细胞，所选用底物为异种胶原，存在不同种属的污 染可能性，并且底物昂贵，不适合产业化规模或长期培养，适合试验性小剂量研究；
[0027] 方法四（流式细胞仪筛选法）：学者Van Rossum丽j与Kaur P等从人小块活检 组织中得到角朊细胞，利用整合素标记异性标志物利用流式细胞仪分离干细胞，选用方法 复杂且技术要求高，大体应用integrinii 1，细胞黏附分子CD49,增列细胞核抗原（PCNA)等 多种标记进行特征分离，虽然干细胞得以筛选，但是会留有标记物标记滞留干细胞无法有 效去除，存在是否影响干细胞增殖、分化、变异性等。此方法适合标记鉴定测定干细胞，并不 适合临床应用的干细胞富集方法；
[0028] 方法五（异种成纤维悬浮筛选法）：学者Hagar B利用DMEM、低钙离子鼠成纤维细 胞条件培养液作为培养基，不用滋养层细胞。但有研究报导表皮干细胞与基底膜脱离可诱 发进入分化周期，分化为过渡性扩充细胞，据猜想皮肤细胞与基底膜的高粘附性有可能是 维持皮肤细胞控制分化特性的可能条件。所以如果不利用滋养层，有可能长期培养过程中 皮肤细胞分化引起后续研究的不可控发展；
[0029] 方法六（同体成纤维贴附筛选法）：学者金岩等利用参考改进学者Hagar B和 Dunnwald鼠成纤维细胞，改成供体预先体外扩增的成纤维细胞为附着底物作为滋养层，培 养同体皮肤细胞，但是专利并没有明确如何制备滋养层平皿的详细步骤，铺皿周期短，成纤 维贴壁力低，筛选反复PBS清洗纯化过程会损失部分培养的目标贴附成功的成纤维细胞， 从而降低目标干细胞的得率，皮肤细胞理论上具有同体同原性，另一技术问题在于，两种细 胞在共有同一培养环境应考虑培养液的复杂性，两种细胞可能出现竞争性的生长增殖抑制 等现象，后续分离皮肤细胞存在技术难度，并不能优于现有的六中常见方法，建议其可把此 方法改成复方加入其它覆皿效果好黏附行为比较大的其它筛选物同用增加目标细胞得率， 或灭活成纤维铺皿层细胞。
[0030] 方法七（甲基纤维素培养皿贴附筛选法）：国外学者利用添加甲基纤维素，用含 2% B27的DMEN/F12进行真皮多能干细胞培养。甲基纤维素易被微生物破坏而腐败，并且 该方法制备培养基溶液粘度加大不利于细胞自由伸展扩增。影响相邻细胞间的融合物质交 换如营养物质，气体交换等，诸多不确定不利因素。并且该无机材料不被机体吸收代谢，培 养过程中引入不易清除，不适于临床治疗级细胞要求。
[0031] 综上所述，真皮多能干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人 真皮多能干细胞得以在国内外方法特异性快速发展。而真皮多能干细胞生物学性能，可 以做到增进功能、本发明避免潜在有害基因及对真皮多能干细胞污染，在基础科研、临床治 疗、干细胞研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时期的 重要不可取代的指导意义。
[0032] 八、组织工程皮肤背景介绍
[0033] 再生组织工程细胞建立系工作始于本世纪（Harrison 1907, Carrel 1912)，指导 引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，成为重要的基础科学之一。组织构建和细胞 体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体内生理环境等系列特定体 外微环境体系，进行孵化培养、使得组织细胞健康生长。
[0034] 组织工程皮肤建立早期应用于修复烧伤和溃疡以及其它皮肤损伤领域，麻省总医 院的John F. Burke与MIT的Yannas I.V.合作，制备首次人工皮肤替代物。但是这种组织 皮肤替代物并不与细胞生物学相关，隶属于组织工程皮肤支架材料学范畴。随着细胞生物 学的基础学科发展，人们开始整合两大学科，共同协作解决创伤皮肤修复构建，真正的含活 性细胞组织工程皮肤在哈福大学Honward Green与MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早 期定制皮肤移植救治取得了生物学医学介瞩目关注。
[0035] 20世纪80年代初期支架材料被FDA许可上市，由胶原网格组成的复合皮肤移植材 料被创造出来，内层为牛胶原和硫酸软骨素构成，外层为硅胶树脂，创面移植后内层与创面 接触被缓慢降解，数周后硅树脂层移除，清创后覆盖自体移植皮肤，覆盖物被临床所接受。
[0036] MIT的科学家Bellhe把材料学和生物学完美结合创造了组织工程皮肤并建立了 世界上第一家组织工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科学界商人的典范。这家活性组 织工程皮肤先驱引领公司仍然是在人工皮肤市场占有率最高的组织工程公司之一。
[0037] 1997年通过美国FDA批准上市的第一个组织工程产品由Advanced Bionhealing 公司生产的TransCyte。用于烧伤创面修复治疗。该产品属于胶原支架材料种植灭活性 的纤维细胞，成为商业化的第一个"异体无活性细胞组织工程真皮疗法"。Dermagraft和 Integra以及Organogenesis Inc制造的Apligraf也获得FDA批准，利用新生儿包皮经生 物学体外培养活性细胞，制备的组织工程皮肤，用于溃疡皮肤和大面积烧伤再生治疗。该产 品是严格意义上具有类皮肤组织工程人工皮肤，含活性4?8传代的细胞并具有完整表皮 真皮细胞构建在组织工程支架之上可降解全层人工皮肤。并且部分剔除减少朗格汉斯细 胞，降低了受体的免疫排斥反应，无活性的死亡细胞经过创面组织液及相关体液因子代谢 的作用被分解可用于创面修复的小分子片段基础营养愈合物质被创面吸收利用。这种产品 制成后置于_70°C保存，37°C迅速复苏，复苏后有50%的活性细胞具有活性，活性维持5天 通过快递邮寄到指定的医疗部门。
[0038] 这些产品的市场准入引领了崭新的再生医学组织工程皮肤时代开创。
[0039] 基于国内国际组织工程人工皮肤现状，建立组织工程皮肤干细胞-高拟体内细胞 外基质，基质附着体外筛选方法设计首例含有表皮干细胞与真皮多能干细胞的全层组织工 程人工皮肤产业化产品。
【发明内容】
[0040] 1. -种用于筛选和培养真皮多能干细胞的培养基组合，
[0041] 配制培养液A :灭活胎牛血清40?60ml、转铁蛋白5?15 μ g/ml、维生素 B40. 5? I X 1(T4/L、维生素 Cl?3 μ g/ml、胰岛素2?4ug/ml、霍乱霉素2. 5?4. 5u/L、维生素 Cl? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml。
[0042] 配制培养液B :灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 维生素 B40. 5 ?I X 1CT4/L、霍乱霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰岛素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛脑垂体提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干细胞生长因子（SCF)5?40ng/ml、 氢化可的松〇. 3yg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(l : 1)定容到SOOmLPH?. 2? 7. 4。
[0043] 配制培养液C :灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 维生素 B40. 5 ?I X 10 4/L、膜岛素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGFlO ?18ng/ml、牛 脑垂体提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干细胞生长因子（SCF) 15?40ng/ml、氢化可的松0. 3 μ g/ 1111、商用培养基01^]?与商用培养基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
[0044] 2. -种制备高拟体内细胞外基质的方法，包括以下步骤：a)取材及皮肤消毒处 理；b)脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、 脱水、辐照灭菌处理；更优选地步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活 性剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。
[0045] 3.权利要求2所述方法，其中冷酶交联剂法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷 消12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸缓冲溶液，PH在7. 20?7. 40之间，交联4?6h，超 纯水或注射用水冲洗8?10次。
[0046] 4.权利要求2所述方法，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0. 1? 0· 25%中性蛋白酶与0· 01?0· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室温下作用 24 ?48h。
[0047] 5.权利要求2所述方法，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0. 01? 0·02%EDTA含0·6?0·8mol/L氯化钠溶液，37°C下作用12?24h，后用（0·2?0·5%SDS 溶液，室温下作用30?60min)。
[0048] 6.权利要求2所述方法，其中胰酶联合EDTA交联液是：0. 25?0. 40%胰蛋白酶 和0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交联液中交联4?6h。交联 后用超纯水或注射用水冲洗8?10次。
[0049] 7.由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。
[0050] 8.权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的 高拟体内细胞外基质在筛选皮肤干细胞中的用途。
[0051] 9. 一种利用权利要求1所述的培养基组合和权利要求7所述的高拟体内细胞外基 质筛选和培养真皮多能干细胞的方法，包括：
[0052] a)制备真皮多能干细胞悬液：取材，消化，用权利要求1所述的培养液A终止消 化，剥离表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集细胞混悬液。离心后加入培养液A养 液；
[0053] b)真皮多能干细胞的筛选及培养：将权利要求7所述的高拟体内细胞外基质加入 权利要求1所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标真皮多能干细胞 贴壁粘附于高拟体内细胞外基质，加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养；
[0054] c)消化富集传代培养：消化，离心后加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培 养。
[0055] 优选地，免疫逃逸方法处理取材前皮肤或获得细胞，免疫逃逸方法可以为射线法、 低温冻融法
【专利附图】
【附图说明】
[0056] 图1高拟体内细胞外基质制备流程
[0057] 图2细胞筛选培养
[0058] -、高拟体内细胞外基质种类
[0059] (涉及的皮肤均为器官捐献，包皮环切皮肤、以及医疗救治过程中植皮取皮废弃皮 肤组织）
[0060] 1. 1其特征在于：针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体 内真皮层作为细胞外基质为筛选贴附，成体或胚胎皮肤真皮多能干细胞筛选分离和体外培 养的方法，并使获得的高纯度真皮多能干细胞。
[0061] 1.2其特征在于：针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体 内全层皮肤作为为细胞外基质为筛选贴附，成体或胚胎皮肤皮肤干细胞筛选分离和体外培 养的方法，并使获得的高纯度皮肤干细胞。皮肤细胞包括：（真皮多能干细胞、毛囊干细胞、 表皮干细胞、及其它皮肤附件附属相关的干细胞及皮肤相关细胞）。
[0062] 这种筛选分离和体外培养的方法，获得的真皮多能干细胞细胞克服以上传统七种 方法的缺陷。
[0063] 发明属生物成体（胎儿）干细胞细胞【技术领域】，涉及真皮多能干细胞的分离与培 养方法。方法特征包括：同体表皮、真皮、全层脱细胞表皮底物预备；同体真皮细胞的分离； 利用高拟体内附着基质真皮多能干细胞的筛选及培养。目前用该法在体外已稳定培养传代 超过20?30 (代），经体内外实验证实该细胞无细胞毒，具有强的增殖能力，并可以形成成 熟的全层分化真皮层结构为有关皮肤干细胞在科研、教学及临床的应用起到不可估量的作 用，同时孕育着巨大学术方向与社会效益和经济效益。通过此种方法理论基础推进我国其 他干细胞的学术基础建立。
[0064] 二、高拟拟体内细胞基质构成：
[0065] 经分析含有多种胶原并包含IV型、其中I型胶原含量最大（I与III型胶原的比 例为10 : 1)，同时还保留了完整的基底膜结构。
[0066] 三、高拟体内细胞基质底物孔隙率与黏附表面特征：
[0067] 高拟底物电镜观察，测定表皮黏附的底物组织再生的基底膜孔隙直径为32? 145um，促进黏附真皮组织再生底物基底膜多孔孔隙直径为72?191 μ m。这种孔隙率所购 建的空间黏附表面均有利干细胞黏附附着生长、增殖、分化。
[0068] 通过以上制备方法；有效的保留了皮肤细胞外基质的微观构架和完整的基底膜结 构，其主要成分包括各型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基质成分，可为真 皮干细胞等快速粘附、表皮干细胞、增殖扩展提供有力的支持。因此，高拟底物是目前最理 想的组织工程皮肤干细胞筛选的解决方案。
[0069] 四、皮肤干细胞高拟拟体内细胞基质制备具体实施步骤与方法：
[0070] 一、包括以下两个步骤种方法：
[0071] 步骤一：皮肤消毒处理过程：取供体皮肤包括以下（胚胎皮肤、成体包皮外板、头 皮、腋下皮肤、及躯干皮肤均可）含表皮真皮结构的断层皮肤，剪切成组织块浸泡在生理盐 水稀释含〇. 05?0. 1 %苯扎溴铵溶液中10?15min，消毒处理，用无菌生理盐水反复冲洗 残余苯扎溴铵。
[0072] 步骤二：低温-60?-80°C冷冻干燥，真空度达到20?llOpa，脱去组织块90? 95%以上水分，取出密封与真空包装，经辐照25?60KGY剂量灭菌。终品可以在室温中保 存长达5年。启动只需浸泡37°C，PBS液或下面所述营养液复苏15?30min即可应用，浸 泡延长至10?12h效果更佳。使用后并且应用去细胞漂洗液（见下方法中相应提及适合 的脱细胞液）脱细胞处理、再经过上述过程永生反复使用的特点。
[0073] 1 :步骤二【具体实施方式】：
[0074]
【权利要求】
1. 一种用于筛选和培养真皮多能干细胞的培养基组合， 配制培养液A :灭活胎牛血清40?60ml、转铁蛋白5?15 μ g/ml、维生素 B40. 5? 1X1(T4/L、维生素 C1?3μ g/ml、胰岛素2?4μ g/ml、霍乱霉素2. 5?4. 5u/L、维生素 C1? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml〇 配制培养液B :灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6?17μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、维 生素 B40. 5 ?1XKTVL、霍乱霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰岛素 4 ?6μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛脑垂体提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干细胞生长因子（SCF)5?40ng/ml、 氢化可的松〇. 3yg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(l : 1)定容到δΟΟπιΚΡΗ?. 2? 7. 4。 配制培养液C :灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、维生 素 B40. 5 ?1 X 10 4/L、膜岛素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛脑垂体 提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干细胞生长因子（SCF) 15?40ng/ml、氢化可的松0. 3 μ g/ml、商用 培养基〇1^]?与商用培养基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
2. -种制备高拟体内细胞外基质的方法，包括以下步骤：a)取材及皮肤消毒处理；b) 脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、脱水、 辐照灭菌处理；更优选地步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活性 剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。
3. 权利要求2所述方法，其中冷酶交联剂法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷消 12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸缓冲溶液，PH在7. 20?7. 40之间，交联4?6h，超纯 水或注射用水冲洗8?10次。
4. 权利要求2所述方法，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0. 1?0. 25% 中性蛋白酶与〇· 01?〇· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室温下作用24? 48h。
5. 权利要求2所述方法，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0. 01?0. 02% EDTA含0. 6?0. 8mol/L氯化钠溶液，37°C下作用12?24h，后用（0. 2?0. 5% SDS溶液， 室温下作用30?60min)。
6. 权利要求2所述方法，其中胰酶联合EDTA交联液是：0. 25?0. 40 %胰蛋白酶和 0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交联液中交联4?6h。交联后用 超纯水或注射用水冲洗8?10次。
7. 由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。
8. 权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的高拟 体内细胞外基质在筛选皮肤干细胞中的用途。
9. 一种利用权利要求1所述的培养基组合和权利要求7所述的高拟体内细胞外基质筛 选和培养真皮多能干细胞的方法，包括： a) 制备真皮多能干细胞悬液：取材，消化，用权利要求1所述的培养液A终止消化，剥 离表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集细胞混悬液。离心后加入培养液A养液； b) 真皮多能干细胞的筛选及培养：将权利要求7所述的高拟体内细胞外基质加入权利 要求1所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标真皮多能干细胞贴壁 粘附于高拟体内细胞外基质，加入权利要求1所述的培养液c进行扩增培养； C)消化富集传代培养：消化，离心后加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养。 优选地，免疫逃逸方法处理取材前皮肤或获得细胞，免疫逃逸方法可以为射线法、低温 冻融法。
【文档编号】C12N5/074GK104263699SQ201410482325
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】朱宁文, 王凌仪 申请人:江苏华亿细胞组织工程有限公司