黑色素细胞悬浮液的保存方法

专利名称：：黑色素细胞悬浮液的保存方法
技术领域：
：本发明关于一种粘附性细胞悬浮液的保存方法，更具体地，关于一种黑色素细胞悬浮液的保存方法。
背景技术：
：白化症(Leukoderma)中的白斑病(Viti1igo)为一种斑状色素缺失疾病，约发生在1%2%的人口中，其临床症状为皮肤或黏膜上出现不规则的白色斑块，白斑病患部上的黑色素细胞几乎全数缺失。在白斑病的治疗方面，除了利用染剂或化妆品的染色与遮盖方式夕卜，也可利用局部涂抹类固醇制剂，或植皮的方式治疗，然而这些方法除了不适用于大面积之外，也可能会产生皮肤萎縮等副作用。目前治疗白斑最常使用的方法为口服或外用的感光剂(如Psoralen)与长波长紫外光(UVA)的合并治疗，或是窄频UVB治疗。但这些治疗方式疗程冗长，一般需要100到250次治疗，为时l到2年。此外，经过此冗长的疗程后，大约只有50%的病人能得到明显疗效。另一种较新颖的治疗方式是藉由黑色素细胞的移植来进行治疗，此种黑色素细胞移植治疗法与前述口服、照光等相比，仅需数次门诊，且几周之内就可看到色素再现，疗效迅速而明显。由于黑色素细胞为粘附性细胞，故在培养此类型细胞时必须有可粘附的基材与适当的培养基。因此，在临床上使用培养的黑色素细胞来治疗皮肤白化病灶时，须考滤培养基的去除及粘附基材的处理等因素。其中，关于粘附基材的处理方式可以有下列三种方式第一，将细胞与所粘附的基材一同覆盖到病灶上，然而此方式需要考滤生物兼容性/生物可分解性等因素而开发适合的粘附基材，技术上较复杂困难；第二，将细胞从粘附基材上分离后，与水胶混合再覆盖到病灶上，此方式成本较昂贵，且多一道处理步骤；第三，将细胞从粘附基材上分离，和生理兼容液体混合(也即制成细胞悬浮液)，再移植到病灶上。此三种方式相较，以第三种方式(制成细胞悬浮液)较易于进行，也较经济实惠。然而当粘附性细胞(例如黑色素细胞)一旦被制成细胞悬浮液时，由于失去细胞粘附分子的讯号传递，往往在短时间内即死亡；此外，该细胞也容易聚集沉降，难以打散，若将此聚集细胞团移植到要治疗的无色素病灶上(例如白斑症)，则会因细胞分布不均而形成色素斑点；再者，若要作后续的细胞培养，聚集细胞团不能均匀分布于培养皿，也会妨碍培养效果。因此，如何制备并保存该细胞悬浮液是一个重要课题。传统上，细胞的保存多以低温冷冻(例如储存于液态氮)的方式进行，以达到长期保存的效果。但是对于需立即使用，而不需再经处理的细胞(例如运送到医院供病人治疗用的细胞)，则并不适合以上述的低温冷冻方式保存。因为冷冻细胞时需加入特殊试剂，例如DMSO来防止冷冻对细胞造成伤害，而这些试剂无法直接用于临床上。再者，低温冷冻的细胞运送保存时需用干冰或液态氮或其它方式来维持低温状态，造成运送保存困难。此外，冷冻细胞的使用需一定的解冻程序，故也存在使用便利性的问题。临床应用的细胞悬浮液，一般是以非冷冻的方式保存于室温下。科学上一般将室温视为25°C。然而细胞对温度非常敏感，不同的环境温度会对细胞生理有不同的影响，如果要达到好的保存效果，必须找出最适的保存温度范围，而室温未必是最适合的保存温度。一个非冷冻、且温度低于最适合细胞生长的环境，或许能降低细胞化学反应及代谢速率，进而延长细胞寿命。但该低温环境也可能造成细胞内的蛋白质结构改变、细胞生长周期变慢，甚至是使酵素功能丧失等，进而造成细胞的死亡。此外，当细胞回温使用时，也常会引发不良的热休克反应(heatshock),造成细胞的再度损伤。因此，寻找合适的低温环境，使之同时满足降低代谢速率而延长细胞寿命及最低的细胞伤害是一个重要的课题。然而，目前关于非冷冻保存方式对于细胞影响的了解很有限，其中关于低温环境对粘附性细胞影响的研究，仅限于粘附于培养皿上的粘附性细胞，并未对制备成悬浮液的粘附性细胞作研究。而且，温度因子对特定细胞的影响，例如低温对黑色素细胞的影响，更是付之阙如。综合上述，当粘附性细胞，尤其是黑色素细胞，被制成细胞悬浮液商品化时，其运送过程及临床手术前存放的保存条件皆足以影响到该细胞的活性、存活率及细胞在溶液中分布的均匀性。因此，粘附性细胞的细胞悬浮液的最佳化保存条件已经成为研究目标。因此，本发明关于粘附性细胞悬浮液的保存，尤其是黑色素细胞悬浮液的保存，特别是以非冷冻的方式保存黑色素细胞悬浮液，使细胞活性和存活率受到最佳保护，同时避免细胞聚集。
发明内容本发明提供一种黑色素细胞的保存方法，先将黑色素细胞制备成悬浮液，较佳以汉氏培养液(Ham'sNutrientMixtureF-12，Ham'sF12)配制，再分别于约4-22.5°C温度范围下，保存该黑色素细胞悬浮液，其中成人黑色素细胞悬浮液较佳的保存温度范围约为10-22.5t之间，于此温度范围，24小时后成人黑色素细胞仍保有约72。/。以上的活性及存活率，并且细胞无聚集现象。而新生儿黑色素细胞悬浮液较佳的保存温度范围约为4-15t之间，于此温度范围下，48小时后新生儿黑色素细胞仍保有约71%以上的活性及存活率。依照本发明的一个较佳实施例，黑色素细胞的悬浮液也可由杜贝可最低基本培养液(Dulbecco，sModifiedEaglemedia，DMEM)、最低基本培养液(MinimalEssentialMedium,MEM)、磷酸生理食盐7jC(phosphatebufferedsaline,PBS)、罗斯威尔帕克纟己念机构1640培养液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食盐水(normalsaline)或其它生理兼容溶液所配制。本发明还提供一种黑色素细胞悬浮液的保存方法，该黑色素细胞悬浮液用于治疗缺乏黑色素细胞疾病，该方法包含制备黑色素细胞悬浮液，于约4-22.5'C温度范围内保存黑色素细胞悬浮液。与传统低温保存方式相比，本发明是利用悬浮液的方式，不需低温冷冻即可保存黑色素细胞，且本发明的黑色素细胞悬浮液可保存至少24小时，对于远距离运送而言，24小时的运送时间已相当充裕，无论是否马上使用或将黑色素细胞悬浮液暂存于前述适合的保存温度，对于黑色素细胞的活性及存活率的影响差异不大，同时也降低细胞聚集的情形。由于传统悬浮液的治疗方式，被黑色素细胞的保存所局限，因此，本发明在医疗用途上或对于黑色素细胞的商品化具有极为显著的效益。为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对附图的详细说明如下图1是依照本发明的一个较佳实施例的黑色素细胞保存条件实验的概括流程图；图2是本发明的一个较佳实施例的黑色素细胞悬浮液的制备流程图；图3是本发明的一个较佳实施例的新生儿黑色素细胞保存实验的流程图；图4是本发明的一个较佳实施例的成人黑色素细胞保存实验的流程图-,图5是本发明的一个较佳实施例的新生儿黑色素细胞保存实验的统计长条图；图6是本发明的一个较佳实施例的成人黑色素细胞保存实验的统计长条图；图7A至图7G显示本发胞于不同温度下的聚集情形图8A至图8D显示本发胞保存在DMEM、于不同温度图9A至图9D显示本发胞保存在MEM、于不同温度下的聚集情形。图IOA至图10D显示本发明的一个较佳实施例中，成人黑色素细胞保存在PBS、于不同温度下的聚集情形。明的一个较佳实施例中，成人黑色素细明的一个较佳实施例中，成人黑色素细下的聚集情形。明的一个较佳实施例中，成人黑色素细图IIA至图11D显示本发明的一个较佳实施例中，成人黑色素细胞保存在RPMImedium1640、于不同温度下的聚集情形。具体实施方式实验流程图1是依据本发明较佳实施例的黑色素细胞保存实验的概括流程。为了测试保存温度及时间对黑色素细胞活性及存活率的影响，先从新生儿的包皮或是成人表皮组织，取得并培养皮肤黑色素细胞(dermalmelanocyte)后，制备成悬浮液(步骤102)。接着，分别于不同的温度下保存一段时间后(步骤104)，进行细胞活性及存活率测试(步骤106)，并观察细胞聚集情形。此实施例中分别使用四氮唑盐(Thiazolylblue)比色法及细胞计数法进行测试。四氮唑盐比色法是一种生物学上常用以测定细胞存活率或增殖作用的方法，其主要依赖活细胞内线粒体中的琥珀酸去氢酶的作用，将四氮唑盐的四唑(tetrazolium)转为蓝色甲瓒(forraazan)产物，并堆积于细胞中。当加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide;DMSO)将其溶解后，则可利用吸光值(opticaldensity;OD)的测定得知细胞的还原能力(甲瓒产量)，此吸光值代表了线粒体的活性，即细胞活性，故四氮唑盐比色法可用作细胞存活率的指针。而细胞计数则是利用锥虫蓝(TrypanBlue)对细胞进行染色来计数。由于锥虫蓝无法穿透活细胞的细胞膜，但是当细胞受伤或死亡，其细胞膜会破损，则锥虫蓝可以通透细胞膜进入细胞内，使细胞染成蓝黑色。利用这一特点，配合血球计数器的使用，则可以在显微镜底下，分辨出细胞样本中的活细胞与死细胞，以方便细胞计数。本发明的详细实验流程及其结果详述如下。(一)制备成人黑色素细胞悬浮液参照图2，首先，利用水泡吸附法取得成人的表皮组织(步骤201)。在此步骤中，以酒精将皮肤消毒后，将针筒放置于皮肤上，以200-300毫米汞柱的吸力吸附皮肤长达60-120分钟，使皮肤形成水泡，再将表皮组织剪下，一般而言，表皮组织上含有约86-90%的角质细胞及5-7%的黑色素细胞。接着，将剪下的表皮组织切碎后(步骤202)，先以胰蛋白溶液浸泡(步骤203)，再移入胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)溶液中(步骤204)，使黑色素细胞从表皮组织分离，最后以离心的方式收集表皮细胞(g卩，角质细胞和黑色素细胞)(步骤205)，并于细胞培养皿中培养(步骤206)。其中角质细胞因无法生长而迅速减少，黑色素细胞则持续增生，而得到接近纯黑色素细胞的细胞族群。由于黑色素细胞属于粘附型细胞(adherentcell)，因此需利用胰蛋白酶(Trypsin)分解细胞与培养皿间的附着蛋白(步骤207)，让黑色素细胞脱落下来，这是收集粘附型细胞常用的方法。接着，洗涤取得的黑色素细胞(步骤208)。之后，以约1.2-1.5X107ml的密度，将黑色素细胞重新悬浮于汉氏培养液(Ham'sF12)中(步骤209)。汉氏培养液(Ham，sFl2)为常见的市售培养液，内含氨基酸、糖类、脂肪酸、盐类等基本细胞生长必须物质。除了汉氏培养液(Hara'sF12)外，也可采用杜贝可最低基本培养液(DMEM)、最低基本培养液(MEM)、磷酸生理食盐水(PBS)、罗斯威尔帕克纪念机构1640培养液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食盐水(normalsaline)或其它生理兼容溶液来配制。最后，将黑色素细胞悬浮液分装入试管中(步骤210),以进行下述的实验。(二)新生儿黑色素细胞保存实验首先，为了模拟在运送过程中，时间及温度对黑色素细胞活性及存活率的影响，因此，将取得的新生儿黑色素细胞分两阶段储存。如图3所示，先将存有新生儿黑色素细胞的试管分别保存于保冷箱中，时间由0小时至24小时不等(步骤301)，此阶段保冷箱的温度仿照运送过程中的温度，其约为1-15T:之间。接着，于第二阶段中，再将存于保冷箱的试管置入4'C冰箱内(步骤302)，此过程模拟黑色素细胞运抵治疗机构后，存放于4'C冰箱内的状况，同样地，时间也由0小时至48小时不等。最后，将新生儿黑色素细胞转移至培养皿中于37。C下恢复5天后(步骤303)，以四氮唑盐比色法(步骤304)及细胞计数(步骤305)的方式测试细胞活性及存活率。表一显示此实施例中，新生儿黑色素细胞的两阶段保存条件200610121539.8说明书第7/12页(a)未经保存阶段，即直接分析；(b)4'C保存4小时；(c)^C保存24小时；(d)4。C保存48小时；(e)保冷箱保存8小时、4'C保存16小时，低温保存共24小时；(f)保冷箱保存24小时；(g)保冷箱保存24小时、4°C保存24小时，低温保存共48小时。表一新生儿黑色素细胞两阶段保存条件标示保冷箱(1-15'C)的保存时数(小时)4t;冰箱的保存时数(小时)保存总时数(小时)000b044c02424d0484881624f24024g242448(三)成人黑色素细胞保存实验由于已于上述实验(二)新生儿黑色素细胞保存实验中，模拟运送过程温度及时间对黑色素细胞的影响。因此，于此实验中，仅就成人黑色素细胞的最佳保存温度及时间作测试，而不分两阶段储存。参照图4，取得成人黑色素细胞后，分别于0°C、4°C、l(TC、15°C、22.5°C、32.5°C、37°C下，保存24小时或48小时(步骤401)。接着，将成人黑色素细胞转移至培养皿中于37'C下恢复5天(步骤402)，以四氮唑盐比色法(步骤403)及细胞计数(步骤404)的方式测试细胞活性及存活率。并观察不同温度下细胞聚集的情形(步骤405)。表二则显示实施例中，成人黑色素细胞的保存温度及时间(h)未经保存阶段，直接分析；(i)4。C保存24小时；(j)10。C保存24小时；(k)15。C保存24小时；(1)22.5"保存24小时；(m)32.5。C保存24小时；(n)37。C保存24小时；(0)4。C保存48小时；(p)l(TC保存48小时；(q)15。C保存48小时；(r)22.5°C保存48小时；(s)32.5°C保存48小时；(t)37t:保存48小时。表二成人黑色素细胞保存条件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果与讨论(A)新生儿黑色素细胞的保存条件表三显示了新生儿黑色素细胞于不同温度及时间下，活性及存活率测试结果。表三新生儿黑色素细胞实验结果新生儿黑色素细胞实验四氮唑盐比色法细胞数保冷箱/4i:冰箱保存时数(小时)百分比(%)标准差百分比(%)标准差<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>图5为表三的统计长条图。白色部份代表四氮唑盐比色法所测试出的保存后细胞存活率，而斜线部份则为所计算出的保存后细胞个数，上述两者的计算基准为(a)未经保存阶段的新生儿黑色素细胞。参见图5，a至d代表将新生儿黑色素细胞分别保存于4'C冰箱中，0小时至48小时后，让细胞在37°C中恢复5天，所测试到的细胞活性与存活率。其结果与未经保存阶段的细胞相比，差异不大，仍保有82%以上的细胞活性和存活率。由此可知，将新生儿黑色素细胞制成悬浮液后可保存于4"的冰箱中近48小时，直至需使用为止。依据图5中的e至g，说明新生儿黑色素细胞在保冷箱保存数小时后，再移入4'C冰箱储存一段时间，于37r下恢复5天的测试结果。其显示尽管将新生儿黑色素细胞储存于保冷箱长达8小时(e)或24小时(f、g)，无论是否转移至4'C冰箱，仍然保有良好的活性与存活率，与未经低温保存的新生儿细胞相较，也保有71%以上的存活率。由此可知，若为远距离的运送，24小时的运送时间已相当充裕，无论是否马上使用或将黑色素细胞悬浮液暂存于4t:冰箱，对于黑色素细胞的活性及存活率的影响差异不大。依据上述可知，新生儿黑色素细胞较佳的保存温度范围为4-15"，以此温度保存48小时后，仍可保有至少71%以上的细胞存活率及活性。而此415°C的温度范围，远低于公知常用的室温范围。(三)成人黑色素细胞的保存条件经由上述实验(二)的结果可知，新生儿黑色素细胞于4-15°C下，保存48小时，仍保有71%以上的细胞存活率及活性。实验(三)则扩大此温度范围，测试成人黑色素细胞的最佳保存温度及时间。表四为成人黑色素细胞的活性及存活率测试结果。表四成人黑色素细胞实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>图6为表四的统计长条图，其显示于0-37'C之间，保存24小时或48小时后，成人黑色素细胞活性及存活率，h至n分别代表于0°C、4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37°C下，保存24小时后的测试结果，而o至t则为分别4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37t:下，保存48小时后的测试结果。同样地，上述两者的计算基准为(h)未经保存阶段，即直接分析的成人黑色素细胞。显然地，无论是24小时或48小时，保存在10-22.5。C之间的成人黑色素细胞，皆有较高的细胞活性及存活率，若以4'C以下或22.5°C以上的温度保存，则明显伤害细胞的活性及存活率。此外，以10-22.5'C保存24小时的成人黑色素细胞(图6j、k、1)，甚至仍保有72%以上的细胞活性及存活率。然而，随着时间的增加，48小时后(图6o至t)，细胞活性及存活率比未经低温保存的细胞降低许多。图7A至图7G分别显示成人黑色素细胞于4°C、l(TC、15°C、22.5°C、25°C、32.5°C及37°C下，以Ham，sF12培养液保存24小时后，所观测到的细胞聚集情形。由图7A至图7C可知，保存在15°C或更低温度下的黑色素细胞无明显聚集，以22.5t;保存的细胞则轻微聚集，随着温度上升，细胞聚集的情形则更为严重。此外，为了探讨当黑色素细胞以其它生理兼容溶液保存时，此最佳保存温度范围是否仍具优越性，故先将黑色素细胞保存于4种不同的生理兼容溶液中，再分别置于15°C、22.5°C、25'C及37'C下24小时后，恢复5天后，最后观察细胞聚集情形。此4种溶液为DMEM、MEM、PBS以及RPMImedium1640，实验结果贝lj依序显示于图8A-8D、图9A—9D、图10A-10D以及图11A-11D中，由15°C、22.5°C、25°C至37'C排列。如图所示，于15度下，细胞均无聚集现象。保存于22.5度时，细胞略有聚集现象。然而，随着温度的上升，于25度和37度下的细胞则有严重的聚集现象。综合细胞活性、存活率和聚集结果判断，成人黑色素细胞的较佳保存温度为10-22.5°C，以此温度范围保存24小时后，依然具有72%以上的存活率与活性。此外，上述的黑色素细胞悬浮液可用以治疗缺乏黑色素细胞疾病，例如白斑症(Vitiligo)或白化症(Leukoderma)。由于此类型病症是因患部黑色素细胞缺乏所致，因而呈现白色，利用涂抹悬浮液的方式将黑色素细胞移植于患部上，可改善病征。此外，本发明也可应用于任何缺乏黑色素细胞的情形，例如白发现象，可利用此黑色素细胞悬浮液加以治疗。由于人体的发色亦是由皮肤上的黑色素细胞所提供，可知白发的产生原因之一可为黑色素细胞供给的短缺所致。因此可将本发明的黑色素细胞悬浮液注射于头皮中，进而将黑色素细胞植入皮肤里，改善黑色素细胞的缺乏情形，使黑色素细胞对毛发提供色素，达到治疗的效果。黑色素细胞在治疗上的应用会为其保存条件所局限，然而，本发明的黑色素细胞悬浮液的保存条件，可使细胞在至少24小时以内，还保持良好的活性与存活率，也无严重细胞聚集现象，应用于临床治疗时，细胞可发挥功能，也不会有因为细胞聚集而产生的皮肤呈色不均匀的重大缺点。对于远距离运送而言，24小时的运送时间己相当充裕，无论是否马上使用或将黑色素细胞悬浮液暂存于适当温度的冰箱，都可有良好使用效果。在医疗用途上或对于黑色素细胞商品化具有极为显著的效益。虽然本发明已经以较佳实施例揭示如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的为准。权利要求1.一种黑色素细胞悬浮液的保存方法，其特征在于，以非室温(25℃)条件进行保存处理，包含制备黑色素细胞悬浮液；于约4-22.5℃温度范围内，保存该黑色素细胞悬浮液。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，该黑色素细胞悬浮液以汉氏培养液、杜贝可最低基本培养液、最低基本培养液、磷酸生理食盐水、罗斯威尔帕克纪念机构1640培养液、一般生理食盐水或其它生理兼容溶液所配制。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，该黑色素细胞为成人黑色素细胞。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该温度范围约为10-22.5""C之间。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，该黑色素细胞为新生儿黑色素细胞。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该温度范围约为4-15。C之间。7.—种成人黑色素细胞悬浮液的保存方法，其特征在于，以非室温(25。C)条件进行保存，其包含制备一成人黑色素细胞悬浮液，其中该成人黑色素细胞悬浮液是以选自于由汉氏培养液、杜贝可最低基本培养液、最低基本培养液、磷酸生理食盐水、罗斯威尔帕克纪念机构1640培养液、一般生理食盐水或其它生理兼容溶液所组成的一族群配制而得；于约10-22.5'C温度范围，保存该悬浮液。8.—种新生儿黑色素细胞悬浮液的保存方法，其特征在于，以非室温(25°C)条件进行保存，其包含制备一新生儿黑色素细胞悬浮液，其中该新生儿黑色素细胞悬浮液是以选自于由汉氏培养液、杜贝可最低基本培养液、最低基本培养液、磷酸生理食盐水、罗斯威尔帕克纪念机构1640培养液、一般生理食盐水或其它生理兼容溶液所组成的一族群配制而得；于约4-15"C温度范围，保存该悬浮液。全文摘要本发明关于一种黑色素细胞的保存方法。将黑色素细胞制成悬浮液后可保存于4-22.5℃的温度范围内，其中新生儿黑色素细胞悬浮液的保存温度较佳为4-15℃间，保存48小时后仍然保持71％以上的细胞存活率和活性。成人黑色素细胞的保存温度较佳约为10-22.5℃间，保存24小时后亦保有72％以上的细胞存活率和活性。同时，于此温度范围下，可避免黑色素细胞聚集(aggregate)的情形产生。该黑色素细胞悬浮液可用以治疗皮肤白化症(leukoderma)，及其它黑色素细胞缺乏的症状。文档编号A01N1/02GK101126079SQ200610121539公开日2008年2月20日申请日期2006年8月18日优先权日2006年8月18日发明者吴怡萍,廖智菁,施冰如,杨莹蓉,申屠子萍申请人:财团法人工业技术研究院