专利名称：能提高黑色素细胞中谷胱甘肽比率的化合物在治疗灰发症中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能提高毛囊黑色素细胞中谷胱甘肽(GSH)比率的化合物在治疗灰发症中的化妆用途。
毛囊是一种表皮的管状叠套，它进入深处直到真皮的深层。其下部，即毛球本身包括一个真皮乳头处在其中的叠套。该乳头下部是细胞增生区，其中有构成头发的角质化细胞前体。来自这些前体的细胞上升时在该乳头上部逐渐地被角质化，这种角质化细胞集合将构成毛发杆。
头发与体毛的颜色主要基于以不同量与比存在的两组黑色素真黑素(褐色和黑色颜料)和phéomélanine(红色和红色颜料)。头发和体毛着色需要在毛囊乳头处有黑色素细胞。这些黑色素细胞处于活性态，即它们合成黑色素。这些颜料转移到用于构成叠杆的角化细胞，这样导致长出着色头发或体毛。这种结构在下面称之“着色的囊单元”。
在哺乳动物中，该黑素生成涉及至少三种酶酪氨酸酶、多巴色素互变异构酶(TRP-2，与酪氨酸酶相关的蛋白2)和DHICA氧化酶(TRP-1，与酪氨酸酶相关的蛋白1)。
该酪氨酸酶是引发生物合成黑色素的酶。它也被描述是黑素生成的限制酶。
TRP-2催化DOPA色素互变异构化成5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)。没有TRP-2时，DOPA色素进行自发的脱羧作用，生成5，6-二羟基吲哚(DHI)。
DHICA和DHI是两种颜料前体，TRP-1氧化DHICA分子，生成醌衍生物(Pawelek JM和Chakraborty AK，“黑素生成酶学”。在Nordlund JJ，Boissy RE，Hearing VJ，King RA，Ortonne J-P.“颜料系统生理学和病理生理学”。New YorkOxford university press；1998.p.391-400)。
特别出现了在黑素生成中涉及的这三种酶，酪氨酸酶、TRP-2和TRP-1。此外，曾将这三种酶的活性描述是真黑素生物合成最大活性必不可少的。
头发和体毛经受循环。这个循环包括生长期(毛发生长初期)、变性期(毛发生长中期)和休止期(毛发生长终期)，其后将出现新的毛发生长初期。由于这个毛发循环，并且与表皮的着色单元相反，该着色的囊单元也应该循环地重新开始。
该灰发症(头发的自然变白)与头发黑色素细胞特别逐渐地稀化相关，因此同时影响毛球的黑色素细胞和黑色素细胞的前体细胞(Commo等人，《Br J Dermatol》，2004；150435-443)。不影响在这些毛囊中存在的其它类细胞。另外，这种黑色素细胞稀化在表皮中没有观察到。直至今天还没有确定在这种毛囊中黑色素细胞和黑色素细胞前体特别逐渐稀化的原因。
为了对抗该灰发症，因此显然有必要对抗人的毛囊黑色素细胞的消失，即同时影响这些乳头活性黑色素细胞和毛囊上部的休止黑色素细胞的过程。
本申请人已经描述了通过对酶TRP-2起作用对抗头发变白的办法(WO 03/103568)。
申请人现在令人惊奇而又出乎意外地发现，酶TRP-2的表达是与GSH表达相关联的，事实上，TRP-2表达诱发GSH在这些黑色素细胞中的比率增加。
因此，已证明在这些没有表达TRP-2的黑色素细胞(例如，这些头发黑色素细胞前体)中，GSH的比率与表达酶TRP-2黑色素细胞(例如，所有头发的黑色素细胞)相比是低的。
于是，本申请人现在确定了治疗灰发症的新靶物，本申请人已证明，能提高GSH在黑色素细胞中的比率的这些化合物，与在文献中所描述的脱色作用相反，将导致恢复头发着色。
考虑提高GSH在黑色素细胞中的比率的这些已知化合物，例如硫辛酸和氢化香豆素，(Yamamura等人，2002，Lin等人2002)被描述是限制黑色素合成的剂，因此降低皮肤着色，与GSH不利于黑色素合成的结论一致(Del Marmol等人，1993，Jara等人1988)这个事实，这种用途具有特别令人惊奇的特性。
因此，本发明的目的涉及能提高GSH在毛发黑色素细胞中的比率的化合物作为能够防止、限制或停止灰发症发展，和保持和/或促进头发和/或体毛自然再着色的剂的用途。
特别地，本发明的目的涉及能提高GSH比率的化合物在防止和/或限制和/或停止灰发症发展中的用途。
这些能提高GSH比率的化合物例如是诱发合成GSH的化合物或限制其消耗的化合物，它们可以具体地采用下述方法进行鉴定a-培养黑色素细胞，例如像在Commo等人文章《Pigment CellRes》，2004，17488-497中描述所得到皮肤或头发黑色素细胞的初步培养。
b-往培养介质添加希望试验提高GSH比率性能的化合物。
c-黑色素细胞培育时间足够长，以便有可使该化合物成为活性的。
d-测量GSH比率。
e-选择提高GSH比率的化合物。
在鉴定提高GSH比率的化合物的方法特别实施方式中，这些细胞培养在37℃与5％CO2的培养箱(étuve)中进行.。
特别地，步骤(a)可以按照下述方案进行在J0用介质M2(PromoCell，Heidelberg，D)接种这些黑色素细胞。例如可涉及如在Commo等人文章《Pigment Cell Res》，2004，17488-497中描述所得到皮肤或头发黑色素细胞的初步培养。
处理前让这些细胞在这种培养介质中保持12-72小时。
步骤(b)可以按照下述方案进行这些黑色素细胞在培养时使用希望试验提高GSH比率性能的化合物进行处理，其处理时间必需达到让它们显示出这些性能，这个时间一般是12-72小时。
测量GSH比率的步骤(d)例如可以采用HPLC方法进行。在这种测量的特别方式中，从培养与处理细胞中提取的游离氨基酸(AA)采用氨基酸自动分析仪HITACHI L-8500进行分析。以这种方式，这些游离氨基酸使用离子交换柱与使用锂盐基洗脱剂进行分离，然后，在茚三酮反应后采用比色法进行定量。
采用荧光法，使用细胞内GSH的荧光探测器，例如像Monochlorobimane(Molecular Probes，USA)，也可以进行GSH定量。
或者使用商品试剂盒，例如比色法分析的Bioxytech GSH-400试剂盒(Calbiochem，USA)，也可以进行GSH定量。
本发明的目的还涉及能提高GSH比率的化合物在保持灰色头发和/或体毛自然着色中的用途。
能提高GSH比率的化合物特别可以选自硫辛酸、奥替普拉(oltipraz)、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、bensylisothyocyanate(Scharf G等人，《Nutr Cancer》，2003，45(1)74-83；Huber WW等人，《Environ Mol Mutagen.》2004，44(4)265-276；Sbeen LY等人，《Food Chem Toxicol》，1996，34(10)971-978；Gupta E等人，《Clin Cancer Res.》，1995，1(10)1133-1138)。
优选地，能提高GSH比率的化合物不应是N-乙酰基半胱氨酸，也不应是栎素(quercitine)。
本发明的目的还是一种抗灰发症的组合物，它含有在化妆上可接受介质中的至少一种如前面定义的能提高GSH比率的化合物，但N-乙酰基半胱氨酸和栎素除外，与其并用的其它活性剂，该活性剂选自防头皮脱屑状态的剂和/或具有前-着色活性的植物提取物。优选地，能提高GSH比率的化合物选自硫辛酸、奥替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、异硫氰酸苄基酯(bensylisothyocyanate)。
本发明还涉及防灰发症组合物，该组合物含有在化妆上可接受介质中的至少一种能提高GSH比率的化合物，该化合物选自奥替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、异硫氰酸苄基酯(bensylisothyocyanate)，与其并用的有利于头发再长出的剂。
本发明组合物中能提高GSH比率的化合物的量是以重量/体积计0.001％-10％，优选地以重量/体积计0.01-5％，更优选地以重量/体积计0.1-1％。
本发明组合物可以口服给药或在皮肤(在体毛覆盖身体的所有皮肤部位)和/或头皮上局部涂敷。
口服时，本发明的组合物可以含有这种或这些能提高GSH比率的化合物，以在食用液体中的溶液，例如水溶液或水酒精溶液，任选地增加香味的溶液形式。还可以把它们加到口服固体赋形剂中，它们可以是例如颗粒、丸、片或糖衣丸剂型。它们还可以放在食用液体的溶液中，而该液体本身任选地包装在口服胶囊中。
按照给药方式，本发明的组合物可以是通常使用的任何盖仑剂型，特别是在美容术中使用的任何盖仑剂型。本发明的优选组合物是适合于在头皮和/或皮肤上局部涂敷的美容组合物。
对于局部涂敷，本发明可使用的组合物特别可以呈洗剂或血清类水溶液、水酒精或油溶液或分散体剂型，或乳类液体或半液体稠度乳液剂型，这是将脂肪相分散在含水相(H/E)中或反之(E/H)得到的，或含水或无水乳油或凝胶类的柔软稠度悬浮液或乳液剂型，或微胶囊或微粒剂型，或离子和/或非离子类泡状分散体剂型。因此，它可以呈形式软膏剂、酊剂、乳膏、膏、粉剂、timbre、浸透缓冲剂、溶液、乳液或泡状分散体、洗剂、凝胶、喷洒、悬剂、洗发剂、气溶胶或泡沫剂型。它们可以是无水的或含水的。它还可以由构成肥皂或清洁膏的固体制剂组成。这些组合物是按照通常的方法制备的。
本发明可使用的组合物可以特别地是毛发护理组合物，尤其是洗发剂、卷发洗剂、处理洗剂、发乳或发胶，任选地呈染色洗发剂形式的染色组合物(特别是氧化性染色)，头发、面罩的再结构化洗剂。
本发明的化妆组合物优选地是乳膏、毛发洗剂、洗发剂或护发剂。
本发明可使用组合物不同组分的量是在所考虑范围内通常使用的量。
本发明可使用的组合物是乳液时，该脂肪相的比例可以是以该组合物总重量计5-80重量％，优选地5-50重量％。在呈乳液形式的组合物中使用的油、蜡、乳化剂和助乳化剂选自在化妆领域中通常使用的这些组分。乳化剂和助乳化剂在该组合物中的比例是以该组合物总重量计0.3-30重量％，优选地0.5-20重量％。该乳液还可以含有类脂泡。
本发明可使用的组合物是溶液或含油凝胶时，该脂肪相可以是该组合物总重量的90％以上。
在本发明的具体实施方案中，该组合物应是如此的，以致该能提高GSH比率的化合物封装在糖衣中，例如微球、毫微球、油体或毫微胶囊，该糖衣应根据能提高GSH比率的化合物的化学性质进行选择。
作为实例，可以根据专利申请EP 0 375 520中描述的方法制备这些微球。
这些毫微球可以呈含水悬浮液形式，并且可以根据专利申请FR0015686和FR 0101438中描述的方法进行制备。
这些油体是由在水中的含油乳液组成的，该乳液是由具有分散在含水相中的层状液晶糖衣的含油微粒形成的(参见专利申请EP 0 641557和EP 0 705 593)。
该能提高GSH比率的化合物也能够封装在毫微胶囊中，该胶囊是由使用含硅酮表面活性剂得到的层状糖衣组成(参见专利申请EP 0 780115)，还能够制备以水分散磺酸聚酯为基的毫微胶囊(参见专利申请FR0113337)。
这种能提高GSH比率的化合物也能够与阳离子含油微粒表面络合，无论其尺寸如何(参见专利申请EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1010 415、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1 018 363、EP 1 020 219、EP 1 025 898、EP 1 120 101、EP 1 120 102、EP 1 129 684、EP 1 160 005和EP 1 172 077)。
最后，这种能提高GSH比率的化合物可以与具有层状糖衣的毫微胶囊或毫微颗粒表面络合(参见EP 0 447 318和EP 0 557489)，与在其表面含有阳离子表面活性剂的毫微胶囊或毫微颗粒表面络合(参见前面关于阳离子表面活性剂所列举的参考文献)。
特别地，优选如此的组合物，装有能提高GSH比率化合物的糖衣的直径小于或等于10μm。该糖衣没有形成球形囊，直径应该理解是该囊的最大尺寸。
已知，本发明的组合物还可以含有在化妆领域中使用的常见添加剂，例如亲水或亲油的胶凝剂、亲水或亲油的添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、防晒剂、气味吸收剂和着色材料。这些不同添加剂的量是在化妆领域中通常使用的量，例如该组合物总重量的0.01-10％。这些添加剂按照其性质可以加到该脂肪相、含水相和/或类脂物小球中。
作为在本发明中可使用的油或蜡，可以列举矿物油(凡士林油)、植物油(烛果油液体部分、向日葵油)、动物油(全氢角鲨烯)、合成油(Purcellin油)、含硅酮的油或蜡(环甲基硅酮)和氟化油(全氟聚醚)、蜜蜂蜡、巴西蜡棕石蜡。可以往这些油中添加脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)。
作为本发明可使用的乳化剂，可以列举例如硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯60和Gattefosse公司以商品名Tefose63销售的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯混合物。
作为本发明可使用的溶剂，可以列举低级醇，特别是乙醇和异丙醇，聚乙二醇。
作为本发明可使用的亲水胶凝剂，可以列举羧基乙烯聚合物(丙烯酸聚合物(carbomer))、丙烯酸共聚物，例如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺；多糖，例如羟丙基纤维素；天然树胶和粘土，作为亲油胶凝剂，可以列举改性粘土，如膨润土；脂肪酸金属盐，如硬脂酸铝，和疏水二氧化硅、乙基纤维素、聚乙烯。
这些本发明可使用的组合物可以将其它活性剂与至少一种能提高GSH比率的化合物并用。在这些其它活性剂中，作为实例可以列举-调节皮肤细胞分化和/或增生和/或着色的剂，例如视黄醇及其酯、维生素D及其衍生物、雌激素，例如雌甾二醇、AMPc调节剂，例如POMC衍生物、腺苷，或毛喉萜及其衍生物、前列腺素及其衍生物、三碘羟碘苯基二碘酪氨酸盐酸盐及其衍生物；-植物提取物，例如鸢尾科或大豆提取物，即这时可以含有或不含有异黄酮的提取物；-微生物提取物；-抗自由基的剂，例如生育酚或其酯，超氧化物歧化酶或其模仿物，某些金属螯合剂或抗坏血酸及其酯；-抗-脂溢，例如某些含硫的氨基酸、13-顺视黄酸，乙酸去乙酰环丙氯地孕酮；-防头皮脱屑状态的其它剂，如锌羟基吡啶硫酮、二硫化硒、克宁巴索、十一烯酸、酮康唑、羟吡酮(羟甲辛吡酮)或ciclopiroctone(环己吡酮乙醇胺)；特别地，可涉及刺激头发再长出和/或有利于延缓头发脱落的活性剂，更特别地可以非限制性地列举-烟碱酸酯，其中特别是烟碱酸生育酚酯、烟碱酸苄酯和烟碱酸(C1-C6)烷基酯，如烟碱酸甲酯或己酯；-嘧啶衍生物，如在US 4 139 619和US 4 596 812专利中描述的2，4-二氨基6-哌啶子基3-氧化嘧啶或“Minoxidil”；在WO96/09048中描述的Aminexil或2，4-二氨基3氧化嘧啶；-有利于头发再长出的脂肪氧合酶抑制剂或环氧化酶诱导物，如本申请人在欧洲专利申请EP 0 648 488中所描述的；-杀菌剂，例如大环内酯、吡喃糖苷和四环素，特别是红霉素；
-钙拮抗药，如桂利嗪、尼莫地平和硝苯地平；-激素，例如雌三醇或类似物，或甲状腺素及其盐；-抗雄激素剂，例如oxendolone、安体舒通、二乙基己烯雌酚和氟他米特；-5-α-还原酶的类固醇或非类固醇抑制剂，例如本申请人在欧洲专利申请EP 0 964 852和EP 1 068 858中所描述的，或非纳斯特胺；-依赖ATP的钾管激动药，例如克罗卡林和尼可地尔；-具有前-着色活性的植物提取物，例如像在FR 2768343中描述的chrysanthème提取物，在FR 2782920A1中描述的地榆提取物。
优选地，能提高GSH比率的化合物与选自防头皮脱屑状态的剂、有利于头发再长出的剂、具有前着色活性的植物提取物的其它活性剂并用。
本发明的另一个目的涉及灰发症的化妆处理方法，其特征在于在待治疗部位给药或涂敷如前面定义的含有至少一种能提高GSH比率化合物的组合物。
本发明还涉及用于保持灰色或白色头发和/或体毛自然着色的化妆处理方法，其特征在于在待治疗部位给药或涂敷如前面定义的含有至少一种能提高GSH比率化合物的组合物。
灰发症和灰色或白色头发和/或体毛着色的处理方法还可在于摄食含有至少一种能提高GSH比率的化合物的组合物。
待治疗部位可以毫无限制地是例如头皮、眉毛、小胡子和/或胡须和由体毛覆盖的任何皮肤部位。
更特别地，这些灰发症和灰色或白色头发和/或体毛自然着色的化妆处理方法在于涂敷含有至少一种能提高GSH比率的化合物的组合物。
防灰发症和/或保持灰色或白色头发和/或体毛自然着色的化妆处理方法可能在于例如在傍晚把该组合物涂敷在头发与头皮上，保留该组合物一整夜，任选地在早晨进行洗头或使用这种组合物洗涤头发，漂洗前再接触几分钟。本发明的组合物以毛发洗剂形式涂敷，任选地漂洗或甚至以洗发剂形式涂敷时显得特别有利。
附图
图1图1表示如实施例1描述的在黑色素细胞WM35-wt(野型)、C2、C4、C7和C8(转染和选择克隆)细胞系上有抗体抗-TRP-2和抗-波形蛋白的蛋白质印迹。由这个蛋白质印迹得出只是克隆C2、C4和C8表达TRP-2。
图2图2是直方图，它表示在黑色素细胞WM35-wt(野型)、C2、C4、C7和C8细胞系中GSH与选择定量氨基酸之和的比(参见实施例1，部分C)。
图3和4图3和4表示氧化应激(H2O2)对表达不多或没有表达TRP-2的野生黑色素细胞(菱形)、TRP2(+)黑色素细胞(方形)和使用并用的咖啡醇+咖啡豆醇(图3)或使用奥替普拉(图4)(三角形)处理的表达不多或没有表达TRP-2的野生黑色素细胞的细胞生活力的影响。
实施例1定量测定在黑色素细胞中GSH随着TRP-2表达而变化。
A-制备正TRP-2和负TRP-2黑色素细胞系。
A1克隆蛋白质TRP-2。
根据基因库D17547序列，使用探针5′-GGAGATGGTGAGAAGCGCTAC-3′和5′-GCGGAAACTACAGCTAAGCAT-3′，采用RT-PCR技术，由皮肤黑色素细胞初步培养物提取的信使RNA，克隆编码蛋白质TRP-2的整个信使RNA域。所得到的PCR产物再使用探针进行克隆，该探针含有相应于在真核细胞表达媒介物中克隆的限制位点的核苷酸序列5′-AGGGATCCATGAGCCCCCTTTGGTGGGGGTTT-3′和5′-GGAATTCAGCACCCTAGGCTTC-3′。使用的表达媒介物是pCDNA3.1(+)。然后由有能力的细菌产生含有编码蛋白质TRP-2的域的媒介物，再进行纯化，这种媒介物然后称之pCDNA-TRP2。
A2制备正TRP-2黑色素细胞系。
用质粒pCDNA-TRP2转染黑色素瘤WM35类的细胞(Pak BJ等人，《Melanoma Res.》，2000，10499)，它们在活体外以构建方式表达不多的蛋白质TRP-2(野生细胞系)。然后，通过用généticine(G418)处理选种稳定转染的细胞。这些得到的克隆再进行分离与扩增。
B采用蛋白质印迹方法(参见Commo等人，《Pigment Cell Res》，2004，17488-497)检测在这些不同的选种克隆中TRP-2的不同表达。
每种克隆培养物用适合于蛋白质提取与蛋白质印迹分析的同样细胞溶解缓冲液进行细胞溶解。采用蛋白质印迹方法，使用8μg蛋白质提取物测定在不同提取物中的TRP-2比率。该蛋白质印迹(参见Maniatis等人的方案)是用下述抗体进行的αPEP8h、Dr VJ Hearing提供的多克隆抗体(NIH，Bethesda，USA)和α波形蛋白、Vim3B4单克隆抗体(Cymbus，UK)。
图1表明与克隆7和野生细胞系(wt)相比，克隆C2、C4和C8表达更多蛋白质TRP-2。
C定量测定在正TRP-2和负TRP-2克隆中的GSH对于每个所研究的克隆，按照2×104个细胞/cm2接种这些细胞。然后，这些细胞培养物使用pH 2细胞溶解缓冲液进行细胞溶解。
提取的游离氨基酸(AA)采用HITACHI L-8500氨基酸自动分析仪进行分析。这样采用离子交换柱，使用锂盐基洗脱剂分离游离的AA，然后在与茚三酮反应后采用比色法进行定量测定。在每个提取物中，测量的GSH比率是以AA总量计的(proline(P)，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)、苯基丙氨酸(F)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)、精氨酸(R))，以便使该试样标准化。
图2表明C2、C4和C8克隆的GSH比率比C7克隆和野生细胞的高。
实施例2-提高GSH比率或限制其降低的化合物对TRP-2M黑色素细胞生活力的影响实施例。
这个试验的原理如下a-培养两个表达TRP-2和没有表达TRP-2的细胞型，它们已根据与实施例1A采用的类似方法发育，分别为Cell-TRP2(+)和Cell-TRP2(-)，可涉及所有的细胞型，优选地黑色素细胞型。
b-往Cell-TRP2(-)细胞培养介质中添加能有利于GSH积累的化合物。
c-培育培养物的时间之长足以有可提高这些细胞中的GSH比率。
d-在诱发自然死亡或衰老的条件下照射细胞。
e-测量自然死亡或衰老。
f-选择有利于GSH积累与能够保护TRP2(-)细胞的化合物。
在该方法的特别实施方式中，在37℃与5％CO2培养箱中进行这些细胞培养。
特别地，步骤(a)可以按照下述方案进行在J0用介质M2(PromoCell，Heidelberg，D)接种这些细胞，密度为5×104细胞/cm2。处理前，这些细胞在这种培养介质中保持12-72小时。
步骤(b)可以按照下述方案进行这些细胞在培养时用待试验化合物处理达到为显示这种性质所必要的时间，这个时间一般是12-72小时。
对于步骤(d)的实施，在培养时，在诱发自然死亡或衰老的条件下照射Cell-TRP2(+)和Cell-TRP2(-)细胞群，例如可能涉及使用顺-铂(Pak BJ.等人，2000，《Melanoma Res.》，10，499-505)或奥沙利铂，使用毒性剂或毒性分子前体化合物，例如阿霉素、二羟基苯基丙氨酸、对草快、扑热息痛、4-羟基雌二醇或4-羟基苯甲醚，紫外辐射照射、氧化应激(H2O2，马来酸二乙酯)(参见Vaux D.L.& StrasserA.，1996，《Proc.Natl.Acad.Sci.》，932239-2244)处理。
对于步骤(e)的实施，可以采用下述自然死亡或衰老的显示方法-可以采用任何能够显示细胞自然死亡的方法，例如鉴定DNA在琼脂糖凝胶电泳后的碎裂情况，采用“TUNEL”方法(Gavrieli Y等人，《J Cell Biol》，1992，119493-501)标记DNA片段，anexine V的显色(ApoAlert Annexin V Apoptosis Kit(1996)CLONTECHniques XI(3)9-11(BD Biosciences，Belgium))，定量测定胞质溶胶核小体(Kit CellDeath Detection ElisaPlus(1-774-425，Roche，Allemagne)；测量细胞生活力确定自然死亡反应。
-可以采用任何能够显示细胞衰老的方法，例如测定端粒缩短，测量端粒酶活性(TRAPeze kit，Intergen)，测定环化素E比率降低，测定磷酸化蛋白质Rb比率降低(Bandyopadhyay D等人，《ExperimentalGerontology》，2001，361265-1275)，测量β-半乳糖苷酶活性(DimriGP等人PNAS 1995；929363-9367)确定衰老反应。
在现在这种情况下，已测定一方面咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面奥替普拉补偿野生WM35细胞系中TRP-2低表达的能力，同时这些细胞受到H2O2应激反应时保护这些细胞系。
使用在该研究中称之“野生”细胞系的WM35人黑色素细胞系进行了这种研究，该细胞系非常低地表达TRP-2(Pak BJ等人，《(Melanoma Res.》，2000，10499)，还使用通过转染得到的在该研究中称之“克隆-2”的WM35细胞系的衍生细胞系进行了这种研究，该WM35细胞系强表达TRP-2(参见实施例1的点A和B)。
为了进行这种试验，这些细胞按照密度2.5×104个细胞/孔接种，然后使用待评价化合物进行处理a-4μg/ml咖啡醇和咖啡豆醇1∶1混合物；b-50μM奥替普拉。
24h后，让这些细胞受到由H2O2诱发的应激反应。
在这种应激后24h，使用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA；D399，分子探针)测量了细胞生存力。
得到的结果(表1和2，图3和4)表明，一方面用咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面用奥替普拉处理这种野生细胞系制约了这些细胞对H2O2诱发的应激反应的敏感性。这些结果因此表明在这种处理后，这种野生细胞系的敏感性接近于克隆-2细胞系的敏感性。
表1咖啡醇+咖啡豆醇处理(这些结果是生存力随H2O2处理而变化的％表示的)
表2奥替普拉处理(这些结果是生存力随H2O2处理而变化的％表示的)
因此，我们可以得出结论，一方面用咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面用奥替普拉处理表达不多或没有表达TRP-2的黑色素细胞，补偿了低表达TRP-2有关H2O2诱发应激反应的敏感性，因此为TRP-2低或无表达水平的黑色素细胞提供了好处.
实施例3-组合物-毛发洗液能对多巴色素互变异构酶代谢途径起作用的化合物 0.5g聚乙二醇 20g乙醇95° 30g水 适量至100g每天把这种洗液涂敷在待治疗部位上，优选地涂敷在整个头皮上至少10天，优选地1-2月。这时观察到白色或灰色出现减少，并且灰色头发再着色。
-治疗洗发液能对多巴色素互变异构酶代谢途径起作用的化合物 1.5g聚甘油基3-羟基芳基醚 26gHercules公司以商品名Klucell G销售的羟丙基纤维素 2g防腐剂 适量乙醇95° 50g水 适量至100g每次洗涤使用这种洗发剂，停留时间约1分钟.持续使用约两个月得到灰色头发逐渐再着色。
这种洗发剂还可以用于预防，以延缓头发变白。
-治疗凝胺能对多巴色素互变异构酶代谢途径起作用的化合物 0.75g桉树精油 1gEconozole 0.2g月桂基聚甘油基6棕榈糖醚(cetearyl glycoether) 1.9g防腐剂适量BF Goodrich Corporation公司销售的Carbopol 934P0.3g中和剂 适量 pH7水 适量至 100g采用定期按摩方法每天两次(早上和晚上)把这种凝胶涂敷在待治疗部位。涂敷三个月后，观察到待治疗部位的体毛或头发再着色。
权利要求
1.除栎素外的能提高GSH比率的化合物在防止和/或限制或停止灰发症发展中的化妆用途。
2.根据权利要求1所述的用途，用于保持和/或恢复灰色头发和/或体毛自然着色。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于能提高GSH比率的化合物选自硫辛酸、奥替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、异硫氰酸苄基酯。
4.根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的用途，其特征在于通过局部或口服途径给药使用能提高GSH比率的化合物。
5.防灰发症的化妆组合物，它含有在化妆上可接受介质中除栎素外的至少一种能提高GSH比率的化合物与并用的其它活性剂，该活性剂选自防头皮脱屑状态的剂和/或具有前着色活性的植物提取物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述的化合物选自硫辛酸、奥替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、异硫氰酸苄基酯。
7.化妆组合物，它含有在化妆上可接受介质中的至少一种能提高GSH比率的化合物，它选自奥替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、异硫氰酸苄基酯，与其并用的有利于头发再长出的剂。
8.根据权利要求5-7中任一项权利要求所述的组合物，其特征在于能提高GSH比率的化合物封装在糖衣中，例如微球、毫微球、油体或毫微胶囊中。
9.根据权利要求5-8中任一项权利要求所述的组合物，其特征在于它适合于局部涂敷在头皮上和/或体毛覆盖的皮肤部位上。
10.灰发症的化妆治疗方法，其特征在于口服给药或将含有能提高GSH比率的化合物的组合物局部涂敷在待治疗部位上。
全文摘要
本发明涉及能提高毛囊黑色素细胞中谷胱甘肽(GSH)比率的化合物在治疗灰发症中的用途。
文档编号A61Q7/00GK101087584SQ200580044414
公开日2007年12月12日 申请日期2005年12月20日 优先权日2004年12月22日
发明者S·康莫 申请人:莱雅公司