一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法与流程

本发明涉及细胞体外培养技术，具体是一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法。

背景技术：

白癜风(vitiligo)是一种常见的局部或泛发的色素脱失性皮肤病，该病发病率约为0.5-1％，与遗传、免疫、氧化应激失衡等因素有关系，目前对于其发病机制的研究倾向于认为以上综合性的因素引起的黑素细胞被破坏，从而引起的色素脱失，及白斑形成。该病治疗方法很多，如药物、激光、手术等，但疗效均不确切。

传统的治疗手段包括内服药物、外用糖皮质激素、紫外线照射以及外科手术治疗等。但药物治疗和紫外线照射的治愈率有限。

外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植、表皮细胞悬液移植以及培养的自体黑素细胞移植等。

这些治疗方法证实是有效的，但表皮移植需大面积取皮，不适合大面积移植。黑素细胞悬液移植是近年来发展的新疗法，但需要短时间内在体外大量扩增高纯度的黑素细胞。

为此，前人设计了多种适合黑素细胞生长的培养基和纯化方法，包括使用含有高浓度胎牛血清的培养基促进细胞生长、使用细胞分裂促进剂佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)促进黑素细胞增殖、以及使用基因素(geneticin)选择性去除非黑素细胞等。

这些方法存在潜在的医疗风险：胎牛血清可能含有疯牛病病毒，化学物质TPA和基因素具有一定的致癌性。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术中，黑素细胞的临床应用安全性不足的问题。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取健康人群外科手术后1小时内丢弃的皮肤作为材料；将材料置于无菌平衡盐溶液中，修剪掉血块和皮下脂肪；

2)将步骤1)中得到的经过修剪后的材料使用无菌平衡盐溶液进行漂洗1～3次；

3)将步骤2)中得到的经过漂洗后的材料剪成2mm宽的长条；将修剪成长条状的材料置入浓度为0.25％的EDTA中，在4℃条件下消化8～12小时；

4)将步骤3)中得到的消化后的材料通过镊子分离表皮和真皮，取表皮，将表皮通过无菌平衡盐溶液进行漂洗3次；

5)将步骤4)中得到的表皮剪成若干个2mm×2mm的片状结构；将片状结构置于浓度为0.25％的TrypLE^TM中(ThermoFisher Scientific 12563029)，在37℃条件下消化20min，得到混合物A；

6)向混合物A中加入无菌平衡盐溶液，得到细胞悬液；所述无菌平衡盐溶液的体积是混合物A的两倍；

7)将步骤6)中得到的细胞悬液通过200目筛网进行过滤，离心，收集沉淀；

8)将步骤7)中收集到的沉淀重悬于黑素细胞培养基中；

9)将步骤8)中的黑素细胞培养基中的细胞密度调整至1×10⁵个/mL后，将细胞接种于培养瓶中；

10)将步骤9)中的培养瓶置于37℃条件下，浓度为5％的CO₂培养箱内进行培养，6h后更换培养基去除未贴壁细胞；

11)待步骤10)中经过更换培养基后的细胞长至80％满时，将细胞置于浓度为0.25％的TrypLE^TM中，消化3～10分钟，得到分离纯化后的黑素细胞；

12)将步骤11)中得到的分离纯化后的黑素细胞，按照1︰2～1︰3进行接种，传代培养；

13)待步骤12)中得到的分离纯化后的细胞生长至足够临床移植后，留存备用。

进一步，所述步骤5)和步骤12)中采用的TrypLE^TM为植物来源的细胞消化液。

进一步，所述步骤7)中的离心过程的离心速率为1000rpm，离心时间为3min。

进一步，所述步骤12)中采用差速消化的方法进行分离纯化黑素细胞。

进一步，所述步骤8)中的黑素细胞培养基配方包括市售的黑素细胞基本培养液Medium 254、市售的生长成分HMGS-2、全反式维甲酸、2-巯基乙醇、维生素C、青霉素和链霉素；

其中，市售的黑素细胞基本培养液Medium 254的体积为1L；

所述市售的生长成分HMGS-2在培养基中的体积配比为0.5～5％；

所述全反式维甲酸在培养基中的终浓度为1～1000nM；

所述2-巯基乙醇在培养基中的终浓度为1～1000nM；

所述维生素C在培养基中的终浓度为2～2000nM；

所述青霉素在培养基中的体积配比为0.5～5％；

所述链霉素在培养基中的体积配比为0.5～5％；

进一步，所述步骤1)～13)制得的黑素细胞在制备白癜风药物中的应用。

本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明具有以下效果：

1)本发明培养出的黑素细胞的纯度较高、细胞活力强，能够更好的应用于移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。

2)本发明的培养基中仅含有低浓度的胎牛血清，并且培养过程不会带入其他动物来源的因素和/或有害性物质的选择培养方法。因而，本发明公开的方法降低了临床应用的风险。

附图说明

图1为体外培养的人黑素细胞；

图2为体外培养的人黑素细胞的免疫荧光鉴定。

图中，A：接种后6h换液，刚贴壁的黑素细胞；

B：培养3天后的黑素细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。

一种基于临床应用的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)收取健康人群外科包皮环切手术后丢弃的皮肤作为材料；将材料置于无菌平衡盐溶液中，修剪掉血块和皮下脂肪；

2)将步骤1)中得到的经过修剪后的材料使用无菌平衡盐溶液进行漂洗3次；

3)将步骤2)中得到的经过漂洗后的材料剪成2mm宽的长条；将修剪成长条状的材料置入浓度为0.25％EDTA(乙二胺四乙酸)中，在4℃条件下消化8小时；

4)将步骤3)中得到的消化后的材料通过镊子分离表皮和真皮，取表皮，将表皮通过无菌平衡盐溶液进行漂洗3次；

5)将步骤4)中得到的表皮剪成若干个2mm×2mm的片状结构；将片状结构置于浓度为0.25％的TrypLE^TM(ThermoFisher Scientific 12563029)，在37℃条件下消化20min，得到混合物A；

6)向混合物A中加入无菌平衡盐溶液，得到细胞悬液；所述无菌平衡盐溶液的体积是混合物A的两倍；

7)将步骤6)中得到的细胞悬液通过200目筛网进行过滤，离心，收集沉淀；所述离心过程的离心速率为1000rpm，离心时间为3min。

8)将步骤7)中收集到的沉淀重悬于黑素细胞培养基中；

所述黑素细胞培养基配方包括市售的黑素细胞基本培养液Medium 254、市售的生长成分HMGS-2、全反式维甲酸、2-巯基乙醇、维生素C、青霉素和链霉素；

其中，市售的黑素细胞基本培养液Medium 254的体积为1L；

所述市售的生长成分HMGS-2在培养基中的体积配比为0.5；

所述全反式维甲酸在培养基中的终浓度为1nM；

所述2-巯基乙醇在培养基中的终浓度为1nM；

所述维生素C在培养基中的终浓度为2nM；

所述青霉素在培养基中的体积配比为0.5％；

9)将步骤8)中的黑素细胞培养基中的细胞密度调整至1×10⁵个/mL后，将细胞接种于培养瓶中；

10)将步骤9)中的培养瓶置于37℃条件下，浓度为5％的CO₂培养箱内进行培养，6h后更换培养基去除未贴壁细胞；此时的细胞如图1的A所示。

11)待步骤10)中经过更换培养基后的细胞长至80％满时，将细胞置于浓度为0.25％的TrypLE^TM中，消化10分钟，得到分离纯化后的黑素细胞；

12)将步骤11)中得到的分离纯化后的黑素细胞，按照1︰3进行接种，传代培养；13)将步骤12)中得到的分离纯化后的细胞进行体外培养，三天后细胞数量生长至足够临床移植后，留存备用，此时的细胞如图1中的B所示。

对培养出的细胞进行鉴定，如图2所示，所有细胞都表达黑素细胞特异性标志物Mitf_M,Trp-1,Trp-2，说明成功培养出了纯化的人黑素细胞。