一种敲除arcA提高克雷伯氏菌1,3‑丙二醇产量的方法与流程

本发明提供了一种敲除arcA基因提高克雷伯氏菌1,3-丙二醇产量的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术：

1,3-丙二醇(简称PDO)是一种重要的化工原料，其主要用途是作为聚酯和聚氨酯材料合成的单体。目前，1,3-丙二醇的生产方法主要是化学合成法。由于化学合成法具有高污染、高能耗、高成本等缺点，人们将目光转移到具有绿色生产优势的生物法上。其中，克雷伯氏菌(Klebsiella)在微氧条件下发酵甘油合成PDO具有较高的底物转化率、开发价值及应用前景等优势。但细胞内的还原力供给一直是限制1,3-丙二醇生产的主要瓶颈。

在微生物细胞中，TCA循环是胞内还原力的重要来源，但低溶氧条件会限制TCA循环活性，影响胞内还原力的再生。研究发现，大肠杆菌中双组分信号传导系统arcA-arcB能够感知外界氧含量变化并激活或抑制下游诸多酶的合成。当细胞从有氧环境转移到微氧环境下，arcB被磷酸化激活，其上磷酸基转移传递至arcA使其激活，进而抑制TCA循环活性。Klebsiella中也存在类似的arcA-arcB信号传导系统，调节细胞在不同溶氧条件下的生理代谢。基于此，本研究通过敲除Klebsiella双组分信号传导系统arcA-arcB中arcA基因，提高微氧条件下TCA循环活性，强化胞内还原力再生，从而提高1,3-丙二醇产量。

技术实现要素：

本发明的目的是通过敲除arcA基因强化TCA循环，进而提高胞内氧化还原水平，有利于微氧条件下产物1,3-丙二醇的合成。发明内容简单易操作，可广泛应用Klebsiella属各种菌株，以下以肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)为例

具体工艺步骤包括工艺1、2、3：

工艺1：利用Red重组系统敲除控制微氧条件下TCA循环通量的arcA基因。

A以pKD13质粒为模板，设计引物构建出需敲除基因的打靶片段。

B将A中所克隆出的打靶片段电转入K.pneumoniae(含氯霉素抗性的pKD46质粒)感受态中，并涂布卡那霉素抗性平板，PCR验证筛选出阳性克隆。

C消除所得阳性克隆中pKD46质粒，然后电转入pCP20质粒，以消除菌株卡那霉素抗性标记，并通过PCR验证突变株，此菌株即为arcA基因缺失的K.pneumoniae。

D高温条件下，通过连续传代消除arcA缺失株中的pCP20质粒。

工艺2：利用qRT-PCR分析arcA基因敲除后TCA循环基因转录水平的变化，包括以下步骤：

A提取K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA总RNA。

B去除总RNA中的基因组DNA。

C以总RNA作模板反转录合成cDNA。

D内参基因选用K.pneumoniae的16S rRNA基因，根据NCBI公布的16S rRNA、icd、gltA、sucC、sdhC的基因序列设计引物并合成。

E利用qRT-PCR扩增，分析基因转录水平变化。

工艺3：重组菌在微氧条件下代谢甘油合成1,3-丙二醇。

A种子液培养：挑取单菌落接种于液体LB培养基，37℃、100r·min^-1培养16h。按0.5％(v/v)的接种量转接到50mL的液体LB培养基，培养至OD₆₀₀＝3。

B摇瓶发酵培养：按4％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，37℃，100r·min^-1培养72h。

本发明的有益效果：

现有技术主要涉及副产物途径基因的敲除，使碳流转向1,3-丙二醇的合成。而本专利改造的特殊性在于，解除TCA循环在微氧环境下的转录调控，强化了1,3-丙二醇的积累，此前文献中未有报道在Klebsiella中敲除arcA基因提高1,3-丙二醇的产量。

实施例发酵结果表明，构建的K.pneumoniaeΔarcA具有更高的1,3-丙二醇合成能力，产量提高12.57％。

附图说明

图1 arcA基因敲除突变株菌落PCR示意图。

图2 arcA突变株中TCA循环关键酶基因icd、gltA、sucC、sdhC转录水平与野生菌相比的变化。

图3野生菌及突变株的生物量变化示意图。

图4野生菌及突变株的代谢产物变化示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步说明。

实例1 本实施例说明利用Red重组技术敲除K.pneumoniae中arcA基因的方法

1 K.pneumoniae接种于液体LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，制备电转化感受态。

2 将含有氯霉素抗性的pKD46质粒导入K.pneumoniae感受态，30℃培养12h，转接至液体LB培养基(含氯霉素30μg·L^-1)，30℃培养至OD₆₀₀＝0.25，加入30mM阿拉伯糖，37℃下诱导pKD46质粒表达Exo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备K.pneumonia(pKD46)感受态。

3 以卡那霉素抗性的pKD13质粒作模板，设计两端带有arcA同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA片段。引物序列如下：

上游引物序列为：

GGACTTTGGTACTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

下游引物序列为：

ACGGCGCCCTGAGGCGCCGTTTTCACATCATGGCTGCGGAATAAAACGCACTGTCAAACATGAGAATTAA

以pKD13作模板进行PCR反应，反应条件：95℃变性5min，经94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，30个循环，再经过72℃延伸10min，降温至20℃，加入适量核酸内切酶Dpn I(购自Takara)去除模板，获得arcA基因敲除盒。

4 电转化线性DNA片段(含有卡那霉素抗性基因)至K.pneumoniae感受态(含有pKD46质粒)，并涂布于含有卡那霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得阳性克隆。

5 以上述阳性克隆制备电转感受态，导入能够诱导表达FLP重组酶(FLP是一个单体蛋白，在质粒pCP20中高温诱导表达，该蛋白表达后，可以消除由质粒pKD13引入的外源基因)的质粒pCP20，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除上述引入的卡那霉素抗性基因。

6 以K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA基因组作为模板PCR验证，结果见说明书附图中图1所示，泳道1所示PCR条带在1100bp左右，泳道2所示条带在600bp左右，与理论条带一致，表明arcA缺失株构建成功。

实例2 arcA基因敲除后微氧条件下TCA循环关键基因转录水平变化。

1 K.pneumoniae总RNA的提取

(1)将收集的新鲜菌体立即在液氮中研磨。

(2)加入1mL TRIzon，使菌体充分裂解，室温放置5min，分离蛋白核酸复合物。

(3)向上步骤溶液中加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。

(4)4℃，12000r·min^-1离心15min，将上层水相转移到新的无RNase的离心管中。

(5)加入等体积异丙醇，吹打均匀，室温放置10min。

(6)4℃，12000r·min^-1离心10min，弃除上清。

(7)加入1mL无RNase的75％乙醇洗涤沉淀。

(8)4℃，12000r·min^-1离心3min，弃除上清。

(9)室温放置至乙醇挥发完全，加入30μL无RNase水溶解，于-70℃保存。

2 引物的设计与合成

内参基因选用K.pneumonia(GenBank Accession No.NC_011283)的16S rRNA基因，根据NCBI公布的16S rRNA、icd、gltA、sucC、sdhC基因序列设计引物，引物序列见表1：

表1研究中所用的引物

3 去基因组DNA

(1)反应体系

将无RNase的PCR管置于冰上，加入以下反应物：

(2)42℃反应2min。

4 逆转录合成cDNA

(1)将上步已除基因组DNA反应液的PCR管置于冰上，加入如下反应试剂：

(2)混匀，短暂离心。

(3)42℃反应15min，85℃反应5min。

5 荧光定量PCR扩增使用程序

6 定量PCR结果见说明书附图2所示，K.pneumoniaeΔarcA在微氧条件下TCA循环基因icd、gltA、sucC、sdhC转录水平较K.pneumoniae分别提高5.97、14.72、183.55、11.63倍。表明敲除arcA基因能够显著提高微氧下K.pneumoniae的TCA循环活性。

实例3、利用构建的K.pneumoniaeΔarcA发酵产1,3-丙二醇。

1 配制种子培养基：酵母粉10g·L^-1，蛋白胨5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，余量为水；发酵培养基：甘油40g·L^-1，酵母粉6g·L^-1，葡萄糖2g·L^-1，KH₂PO₄7.5g·L^-1，MgSO₄ 2g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 2g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.005g·L^-1，VB₁₂ 0.015g·L^-1，微量元素溶液(MnCl₂·4H₂O 0.1g·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.2g·L^-1，ZnCl₂ 0.07g·L^-1，CuCl₂ 0.02g·L^-1，NiCl₂·6H₂O 0.025g·L^-1，H₃BO₃ 0.06g·L^-1)100μL·L^-1，余量为水，KOH调节pH至8.5左右。

2 将K.pneumonia与上述所得突变株接种于液体LB培养基，37℃，100r·min^-1振荡培养16h，按0.5％(v/v)的接种量转接种子培养基，37℃，100r·min^-1培养到OD₆₀₀＝3，将种子液按4％接种量转接50mL发酵培养基，37℃、100r·min^-1培养72h，发酵结束。

3 发酵液中1,3-丙二醇及副产物的含量采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器：Agilent高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱柱：Bio-RAD Aminex HPX-87H column 300mm×7.8mm；流动相：5mmol·L^-1硫酸；流速：0.6mL·min^-1，柱温：60℃，紫外检测器(210nm)，进样10μL。结果见表2：

表2 K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA发酵72h产物

由表可知，K.pneumoniaeΔarcA发酵甘油合成1,3-丙二醇的产量提高12.57％，达到17.64g·L^-1。表明敲除参与K.pneumoniae细胞TCA循环转录调控的arcA基因能够有效促进微氧条件下1,3-丙二醇积累。

本发明内容简单易操作，可广泛应用Klebsiella属各种菌株的改造以提高1,3-丙二醇产量。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。