本发明涉及发酵食品领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵液、制备方法及用途。
背景技术：
乳酸菌用于发酵面团是当今比较常见的工艺，乳酸菌用于发酵面点具有延缓面包等食品老化，显著提升产品风味、使用方便、降铅功能，非常适于工业化生产，具有非常好的应用前景。目前主要采用直投式发酵剂的形式。
在制备直投式发酵剂时主要采用冷冻干燥的形式，成本较高；此外在干燥过程中乳酸菌挥发性物质损失严重，这大大降低了该类产品的竞争力。乳酸菌在发酵领域若采用单菌株发酵效果较为局限，比较难找到综合效果显著的菌株。
专利申请201510259592.3公开的是乳酸菌液体的乳酸菌灭活方法，灭活的乳酸菌用于微生态制剂，只利用了乳酸菌代谢产物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种乳酸菌发酵液。
为实现上述目的，本发明提供一种乳酸菌发酵液，其特征在于，其由HM60S1、HM6068按活菌数1:2-1:4接种后发酵制备得到。
进一步，按照如下制备方法制备得到，
接种：分别用种子液培养基活化HM60S1种子液和HM6068种子液，然后分别接种活化后的HM60S1种子液和HM6068种子液到发酵培养基中；所述种子液培养基配方为10g蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母粉；20g葡萄糖；5g乙酸钠；0.5g吐温80；2g磷酸二氢钾；2g柠檬酸钠；0.2g硫酸镁；1000g水；调节PH至6.5,121℃灭菌15min；
所述发酵培养基配方为10g蛋白胨；20g酵母粉；40g白砂糖；5g乙酸钠；0.5g吐温80；2g磷酸二氢钾；2g柠檬酸钠；0.2g硫酸镁；1000g水；调节PH至6.5,于发酵罐中121℃灭菌30min。
发酵：将接种后的溶液在37℃±1℃恒温发酵，至pH下降至4.5以下为发酵终点即可。
进一步，所述接种步骤中，按照HM60S1和HM6068的活菌数配比1:2-4进行接种；
进一步，所述接种步骤中，HM60S1、HM6068分别按1×107CFU/mL、2×107CFU/mL接种；
本发明还提供所述乳酸菌发酵液在食品发酵领域的用途。
进一步，提供所述乳酸菌发酵液在发酵面点食品、果蔬发酵、乳酸菌饮料中的用途。
本发明所述种子液培养基是在MRS的基础上改良的，更符合食品安全国家标准食品添加剂使用标准(GB2760—2014)要求。
本发明所述发酵培养基配方是在MRS培养基的基础上改良的，增加培养基的碳源与氮源比例含量，以便让乳酸菌最大限度的使用与生长，增加活菌数与发酵风味。所述发酵培养基配方的碳源氮源含量比例是最合适的形式，比例少了乳酸菌活菌数及发酵风味都较差，比例增大会影响活菌数和风味。
本发明采用了共生发酵，发挥菌株组合优势，在产品应用中发挥最佳的乳酸菌应用效果，同时采用共生发酵省去了生产工艺上的调配步骤，降低了工艺成本且减少污染环节。同时所制得的共生发酵产物稳定，可工业化生产。
本发明主要围绕不同乳酸菌发酵的产酸能力与丰富的代谢物质、天然乳酸菌风味，通过菌株筛选与试验比较，形成2种高活性乳酸菌共生发酵，产生丰富的天然发酵风味，在食品加工过程中增强食品天然发酵风味。
本发明公开了该乳酸菌发酵液在发酵面点食品领域的应用。利用乳酸菌天然产酸与丰富代谢物质，增强面点食品的天然发酵风味。运用乳酸菌菌株共生发酵技术，筛选出菌株组合与培养基优化的工艺，形成优良的共生乳酸菌发酵液，并形成工业化生产工艺，提高发酵面点食品加工的天然乳酸菌风味，提高口感与营养价值。
本发明公开了该乳酸菌发酵液在果蔬发酵领域的用途，乳酸菌以发酵液的形式存在，其发酵活力更好，发酵过程中活菌数上升更快更高，活菌数较高有利于后期的储藏运输。乳酸菌发酵液发酵所得产品发酵风味更浓郁。采用两菌株共生发酵制得的发酵液用于果蔬发酵中制得的产品风味更好，两菌株采用科学的菌株组合比例，进行共生发酵，发挥菌株组合优势，在产品应用中发挥最佳的乳酸菌应用效果。
本发明公开了该乳酸菌发酵液同样适合在乳酸菌饮料的应用领域，主要特点在于乳酸菌以发酵液的形式存在，发酵活力更高，采用多菌株共生发酵制得的发酵液用于乳酸菌饮料中制得的产品风味更好。
本发明所用菌株：
采集自然发酵的酸菜汁的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HM60S1。
●菌株名称：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HM60S1；
·保藏日期：2015年8月10日；
●保藏单位：中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
●保藏编号：CGMCC No.11217。
鉴定
1)16s rDNA鉴定
用细菌的16s rDNA通过引物从HM60S1的基因组DNA中PCR扩增得到1条1468bp长的条带，将扩增产物测序，获得序列在GenBank中进行同源序列检索，结果显示所检索的100个相似性较高的菌株的16S rDNA序列中，88.7％为Lactobacilluspalntarum；与相关属种16S rDNA序列构建系统发育树，经同源性比对发现菌株HM60S1与Lactobacillus palntarum的16S rDNA序列同源性超过99％，因此确定其为植物乳杆菌。
2)微生物学特性
L.plantarumHM60S1菌株为革兰氏阳性，兼性厌氧，葡萄糖发酵类型为兼性异型发酵，接触酶阴性，聚肽糖组成B群为阴性，形态为规则杆状，判断其为乳杆菌属；其阿拉伯糖、松三糖、木糖发酵为阳性(利用率为11-89％)，判断其为植物乳杆菌。
显微镜观察形态：呈规则杆状，在液体培养基中成短链，不生芽孢；
根据《常见细菌系统鉴定手册》(2001东秀珠蔡妙英版)判断其属于植物乳杆菌属。
采集自然发酵的酸马奶的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HM6068。
●菌株名称：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HM6068；
●保藏日期：2015年8月10日；
●保藏单位：中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGTCC)；
●保藏编号：CGMCC No.11214。
鉴定
1)16s rDNA鉴定
用细菌的16s rDNA通过引物从HM6068的基因组DNA中PCR扩增得到1条1518bp长的条带，将扩增产物测序，获得序列在GenBank中进行同源序列检索，结果显示所检索的100个相似性较高的菌株的16S rDNA序列中，95％为Lactobacillus palntarum；与相关属种16S rDNA序列构建系统发育树，经同源性比对发现菌株HM6068与Lactobacillus palntarum的16S rDNA序列同源性超过99％，因此确定其为植物乳杆菌。
2)微生物学特性
L.plantarum HM6068菌株为革兰氏阳性，兼性厌氧，葡萄糖发酵类型为兼性异型发酵，接触酶阴性，聚肽糖组成B群为阴性，形态为规则杆状，判断其为乳杆菌属；其阿拉伯糖、松三糖、木糖发酵为阳性(利用率为11-89％)，判断其为植物乳杆菌。
显微镜观察形态：呈规则杆状，在液体培养基中成短链，不生芽孢；
根据《常见细菌系统鉴定手册》(2001东秀珠蔡妙英版)判断其属于植物乳杆菌属。
本发明的乳酸菌发酵液具有如下优势：
1、乳酸菌以发酵液的形式存在，减少了乳酸菌冻干的成本；不仅利用代谢产物的优质效果，同时又发挥了乳酸菌本身的活菌作用。
2、乳酸菌发酵液本身具有更好的发酵香气，不同的乳酸菌配比具有不同的风味，使得发酵面团香气多样化；
3、以乳酸菌菌粉的形式用于酵母发酵，整体发酵时间较长，本发明通过乳酸菌发酵液的形式与酵母共生发酵，有效缩短发酵时间。
利用乳酸菌天然产酸与丰富代谢物质，增强面点食品的天然发酵风味。运用乳酸菌菌株共生发酵技术，筛选出菌株组合与培养基优化的工艺，形成优良的乳酸菌发酵液，并形成工业化生产工艺，提高发酵面点食品加工的天然乳酸菌风味，提高口感与营养价值。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：乳酸菌菌株的制备与鉴定
1、菌株名称：植物乳杆菌LactobacillusplantarumHM60S1；(采集自然发酵的酸菜汁)；
●保藏日期：2015年8月10日；
●保藏单位：中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
●保藏编号：CGMCC No.11217。
鉴定
1)16s rDNA鉴定
用细菌的16s rDNA通过引物从HM60S1的基因组DNA中PCR扩增得到1条1468bp长的条带，将扩增产物测序，获得序列在GenBank中进行同源序列检索，结果显示所检索的100个相似性较高的菌株的16S rDNA序列中，88.7％为Lactobacilluspalntarum；与相关属种16S rDNA序列构建系统发育树，经同源性比对发现菌株HM60S1与Lactobacillus palntarum的16S rDNA序列同源性超过99％，因此确定其为植物乳杆菌。
2)微生物学特性
L.plantarumHM60S1菌株为革兰氏阳性，兼性厌氧，葡萄糖发酵类型为兼性异型发酵，接触酶阴性，聚肽糖组成B群为阴性，形态为规则杆状，判断其为乳杆菌属；其阿拉伯糖、松三糖、木糖发酵为阳性(利用率为11-89％)，判断其为植物乳杆菌。
显微镜观察形态：呈规则杆状，在液体培养基中成短链，不生芽孢；
根据《常见细菌系统鉴定手册》(2001东秀珠蔡妙英版)判断其属于植物乳杆菌属。
2、菌株名称：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum HM6068；(采集自然发酵的酸马奶)
●保藏日期：2015年8月10日；
●保藏单位：中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGTCC)；
●保藏编号：CGMCC No.11214。
鉴定
1)16s rDNA鉴定
用细菌的16s rDNA通过引物从HM6068的基因组DNA中PCR扩增得到1条1518bp长的条带，将扩增产物测序，获得序列在GenBank中进行同源序列检索，结果显示所检索的100个相似性较高的菌株的16S rDNA序列中，95％为Lactobacillus palntarum；与相关属种16S rDNA序列构建系统发育树，经同源性比对发现菌株HM6068与Lactobacillus palntarum的16S rDNA序列同源性超过99％，因此确定其为植物乳杆菌。
2)微生物学特性
L.plantarum HM6068菌株为革兰氏阳性，兼性厌氧，葡萄糖发酵类型为兼性异型发酵，接触酶阴性，聚肽糖组成B群为阴性，形态为规则杆状，判断其为乳杆菌属；其阿拉伯糖、松三糖、木糖发酵为阳性(利用率为11-89％)，判断其为植物乳杆菌。
显微镜观察形态：呈规则杆状，在液体培养基中成短链，不生芽孢；
根据《常见细菌系统鉴定手册》(2001东秀珠蔡妙英版)判断其属于植物乳杆菌属。
实施例2：乳酸菌发酵液的制备
培养基配方
种子液培养基配方：
蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；乙酸钠5g；吐温80 0.5g；磷酸二氢钾2g；柠檬酸钠2g；硫酸镁0.2g；水1000g；调节PH至6.5,121℃灭菌15min。
发酵培养基配方：
蛋白胨10g；酵母粉20g；白砂糖40g；乙酸钠5g；吐温80 0.5g；磷酸二氢钾2g；柠檬酸钠2g；硫酸镁0.2g；水1000g；调节PH至6.5,于发酵罐中121℃灭菌30min。
制备方法：
1、培养基配制：按要求配制相应培养基，灭菌待用。
2、种子液传代接种：分别活化HM60S1种子液和HM6068种子液，按不同配比(活菌数配比约1:2)进行接种共生发酵(HM60S1、HM6068分别按1×107CFU/mL、2×107CFU/mL接种比例共生发酵)
3、发酵：37℃±1℃恒温发酵，至pH下降至4.5以下为发酵终点。
4、冷却灌装：冷却降温后真空灌装。
5、检测：按相关标准进行活菌数、菌落总数、霉菌/酵母、非乳酸菌、肠杆菌科、致病菌、产酸活力、发酵酸度等项目检测。
6、合格品贴标，冷藏运输，使用。
实施例3：乳酸菌发酵液的制备
培养基配方同实施例2。
制备方法：
1、培养基配制：按要求配制相应培养基，灭菌待用。
2、种子液传代接种：分别活化HM60S1种子液和HM6068种子液，按不同配比(活菌数配比约1:3)进行接种共生发酵(HM60S1、HM6068分别按1×107CFU/mL、3×107CFU/mL接种比例共生发酵)
3、发酵：37℃±1℃恒温发酵，至PH下降至4.5以下为发酵终点。
4、冷却灌装：冷却降温后真空灌装。
5、检测：按相关标准进行活菌数、菌落总数、霉菌/酵母、非乳酸菌、肠杆菌科等项目检测。
6、合格品贴标，冷藏运输，使用。
实施例4：乳酸菌发酵液的制备
培养基配方同实施例2。
制备方法：
1、培养基配制：按要求配制相应培养基，灭菌待用。
2、种子液传代接种：分别活化HM60S1种子液和HM6068种子液，按不同配比(活菌数配比约1:4)进行接种共生发酵(HM60S1、HM6068分别按1×107CFU/mL、4×107CFU/mL接种比例共生发酵)
3、发酵：37℃±1℃恒温发酵，至PH下降至4.5以下为发酵终点。
4、冷却灌装：冷却降温后真空灌装。
5、检测：按相关标准进行活菌数、菌落总数、霉菌/酵母、非乳酸菌、肠杆菌科等项目检测。
6、合格品贴标，冷藏运输，使用。
以发酵面团生产为例：
面粉：7kg，水3kg，乳酸菌发酵液1kg，安琪酵母0.04kg，碱面6g，白砂糖1.5kg，
混合搅拌均匀，与空白组对照，制得的面团具有更好的发酵香气，且更有韧性。用该面团制得的馒头香气明显增加，撕开后结构蓬松，且有层次感，口感更有嚼劲。
对比例的制备：
对照1：采用润盈购买的植物乳杆菌(活菌数为2×109CFU/g)。
面粉：6-8kg，水3-4kg，乳酸菌发酵液0.1-0.15kg，安琪酵母0.04-0.06kg，碱面6-8g，白砂糖1.5-2kg。混合搅拌均匀，折叠杆面六次，第七次卷成长条形，切块。37℃±1℃恒温醒发半小时，蒸20分钟出锅，冷却后品尝。
对照2：单独采用只含有HM60S1的乳酸菌发酵液，制备方法同实施例2。所用乳酸菌发酵液的活菌数为2×109CFU/g。
对照3：单独采用只含有HM6068的乳酸菌发酵液，制备方法同实施例2。所用乳酸菌发酵液的活菌数为2×109CFU/g。
对照4：采用共生发酵(HM60S1、HM6068分别按1×107CFU/mL、2×107CFU/mL共生发酵)的发酵液制得的乳酸菌菌粉，制备方法同实施例2.所用乳酸菌粉活菌数为2×109CFU/g。
实施例5：效果验证试验
1、以发酵面团生产为例：
面粉：7kg，水3kg，实施例2-4制备得到的乳酸菌发酵液1kg，安琪酵母0.04kg，碱面6g，白砂糖1.5kg。混合搅拌均匀，折叠杆面六次，第七次卷成长条形，切块。37℃±1℃恒温醒发半小时，蒸20分钟，冷却后品尝。
空白对照：面粉：6-8kg，水3-4kg，对照1-40.1-0.15kg，安琪酵母0.04-0.06kg，碱面6-8g，白砂糖1.5-2kg。
与空白对照比较，采用本发明所述的乳酸菌发酵液制得的面团结果见表1-3。
表1实施例2-4及对照1-4用来发酵面团的面团结构结果表
表2实施例2-4及对照1-4用来发酵面团的面团风味结果表
表3实施例2-4及对照1-4用来发酵面团的面团Q劲结果表
从表1-3可以看出，采用本发明所述的乳酸菌发酵液制得的面团与单独的乳酸菌比较(对照2-3)，两种乳酸菌的乳酸菌粉(对照4)，市场上购买到的乳酸菌粉(对照1)相比，在面团结构方面：外表更加光滑，组织细腻，切面气孔更为均匀；面团风味方面：香气更加浓郁，持续时间长，入口清香；面团Q劲方面：呈海绵状有更明显弹性，咀嚼感明显。可以看出，本发明所述的乳酸菌发酵液制得的面团具有更好的发酵香气，且更有韧性。用该面团制得的馒头香气明显增加，撕开后结构蓬松，且有层次感，口感更有嚼劲。
2、以果蔬发酵为例
发酵苹果汁的制备方法：调节苹果浓缩汁的糖度(BX)至20，接种乳酸菌进行发酵，至pH为4.5以下为发酵终点(时间约为20小时)，冷却灌装，检测，出库。
对照5：单独采用只含有HM60S1的乳酸菌发酵液，所用乳酸菌发酵液的活菌数为2×109CFU/mL。
对照6：单独采用只含有HM6068的乳酸菌发酵液，所用乳酸菌发酵液的活菌数为2×109CFU/mL。
对照7：采用HM60S1、HM6068按活菌数1:2接种制得的乳酸菌发酵液，进行冷冻干燥形成乳酸菌菌粉，总活菌数约为2×109CFU/g。
实验组：采用HM60S1、HM6068按活菌数1:2接种制得的乳酸菌发酵液，总活菌数约为2×109CFU/mL。
发酵条件：将上述对照5-7和实验组相同活菌数接种(2×107CFU/mL)到上述苹果浓缩汁，37℃±1℃发酵20个小时，测定表4中的参数。
检测方法：
乳酸菌活菌数：食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验(GB4789.35—2010)，
发酵酸度：食品加工用乳酸菌(QB/T 4575-2013)。
其他数据用指定仪器可以直接测量。
表4实施例4的效果对比表
从表4可以看出：
1、在乳酸菌发酵过程中，随着PH降低，对应的OD值与乳酸菌活菌数成反比例增长，乳酸菌在果汁发酵中都没大量的利用果汁中的糖度。实际生产中可根据PH值得变化情况来直观判断产品的时时发酵情况。
2、乳酸菌以发酵液的形式存在其发酵活力更好、发酵酸度更高，相同时间相同条件下进行发酵，乳酸菌发酵液的活菌数上升更快。
3、乳酸菌发酵液发酵所得产品发酵风味更浓郁，采用乳酸菌菌粉发酵，延长发酵时间后的发酵风味仍然较差、相应的活菌数也较低。
4、乳酸菌发酵液发酵所得产品活菌数更高，活菌数较高有利于后期的储藏运输。试验表明采用乳酸菌菌粉发酵果汁虽延长时间，但最终活菌数仍然较低。
采用多菌株共生发酵制得的发酵液用于果蔬发酵中制得的产品风味更好，多菌株采用科学的菌株组合比例，进行共生发酵，发挥菌株组合优势，在产品应用中发挥最佳的乳酸菌应用效果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。