本发明涉及一种牛支原体培养基及其制备方法，确切讲是一种其组分中包括有：PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、新鲜酵母浸出液、马血清、青霉素、酚红、去离子水的牛支原体培养基及其制备方法。
背景技术：
牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）能够引起牛肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。该病原引起的疾病在全世界范围流行并造成严重经济损失。牛支原体是牛呼吸疾病综合征的主要病因。我国自2008年首次从湖北省爆发坏死性肺炎肉牛身上分离到牛支原体以来，随后在全国多个省市地区不断有牛支原体病例的报道，现今牛支原体在我国已成普遍感染状态，牛支原体也已经成为威胁我国养牛业的重要病原之一。
牛支原体病的防控需要综合防控措施，疫苗免疫是预防控制牛支原体病发生的一个重要手段，而优质高效疫苗需要优质培养基作为支撑。目前牛支原体的培养基主要有牛心汤培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt’s培养基等。现有技术培养基培养牛支原体存在培养时间较长、活菌滴度较低、繁殖能力较差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量普遍在10%～20%之间，不仅增加了制苗成本，过量的血清制备的疫苗无疑增加了异源体对牛体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效果。单纯降低现有技术培养基中血清含量会导致培养牛支原体抗原滴度低10～100倍左右，既达不到免疫所需抗原剂量，又需提高浓缩倍数，实际上增加了生产成本。
中国发明专利2011100012310公开一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该专利的基础培养基组成成分为：脑心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉汤、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸钠、Hank’s液、丙酮酸钠、0.1％酚红溶液、青霉素和去离子水，以使用前加入140～200ml的健康马血清，并需要再加入琼脂。根据其公开的内容，用该专利的培养基培养的猪肺炎支原体培养基活菌滴度可达1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml,并且具有支原体生长速度快、分离的敏感性强,制备方法工艺简单，可操作性强，适合工业化大生产的特点。
中国发明专利申请2015100244778公开的一种山羊支原体山羊肺炎亚种体外培养基由：PPLO肉汤21g/L，葡萄糖2g/L，丙酮酸钠2g/L，质量体积比25%的酵母浸液100ml/L，0.4%的酚红0.18ml/L，灭活马血清100mL/L，及水溶解的青霉素200IU/ml构成，其pH值为7.4～7.6。采用该培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种，56小时生长滴度可达到4×109ccu，在达到原有培养基生长滴度的同时，培养时间缩短10小时，同时可以降低培养基的成本。
但由于上述专利用于培养猪肺炎支原体和山羊支原体山羊肺炎亚种，培养牛支原体滴度均不高于109 CCU/ml；此外，上述专利所需用的马血清量较大，马血清含量均在10%及以上；因此，开发高效的牛支原体低血清培养基已成为牛支原体疫苗研究和生产中急需解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明提供一种可克服现有技术不足的牛支原体低血清高效培养基，本发明另一目的是提供该培养基的制备方法。
本发明的这种牛支原体培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中每升的培养基内的基础培养基的组成为：
（1）PPLO肉汤 22.0～24.0g
（2）丙酮酸钠 5.0～6.0g
（3）葡萄糖 6.0～8.0g
（4）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5ml
（5）去离子水750 ml；
辅助培养基的组成为：
（6）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110～120ml
（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16～17 ml
（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml
（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml
（10）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml
（11）无菌马血清50 ml
培养基的pH值为7.2～7.4。
本发明的牛支原体培养基制备方法为：将基础培养基的组分逐一溶入750ml去离子水中，115℃高压灭菌20min后晾至室温备用；将辅助培养基的各组分分别经0.22 微米滤膜滤过除菌后充分混合；无菌条件下，将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装，置4℃保存备用。
本发明的牛支原体低血清高效培养基培养牛支原体可在牛支原体疫苗抗原制备中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的牛支原体低血清高效培养基根据牛支原体的生长特性，通过对不同的碳源、氮源、蛋白质、无机盐、胆固醇等诸多营养组分的组合进行筛选，同时对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了比较分析，研究出了适合培养牛支原体的低血清高效培养基。该培养基中PPLO肉汤是支原体生长基础液；丙酮酸钠可作为支原体培养中的替代碳源；培养基中的葡萄糖为牛支原体生长提供能量；通过添加新鲜酵母浸出液，为牛支原体生长提供所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；添加L-谷氨酰胺可促进微生物代谢、促进蛋白质合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白为牛支原体生长提供合适的氨基酸；通过添加少量马血清，向牛支原体提供生长所需的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；通过添加青霉素可抑制杂菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染和延长培养基保存时间；添加酚红作为pH值指示剂，可判断支原体的生长状况。该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸和水解乳蛋白，上述成分的添加既能减少血清用量，还明显提高了牛支原体的活菌滴度；经反复实验证实，未添加之前活菌滴度为108-109 CCU/ml，添加之后活菌滴度可达1010 CCU/ml。而本发明另一个优势在于培养基中低血清含量，培养基中血清用量仅为5%，是现有技术培养基血清含量的1/2～1/4；用本发明方法制备的牛支原体半成品菌液滴度达1010 CCU/ml，活菌滴度明显高于改良KM2培养基（107 CCU/ml）、牛心汤培养基（108 CCU/ml）和改良Thiaucourt’s培养基（108～109CCU/ml）。牛支原体低血清高效培养基大大减轻了疫苗中异源体血清对牛体的过敏应激反应，提高了生物安全，也提高了活菌菌液滴度，降低了生产成本，为牛支原体优质疫苗的研制奠定了基础。
具体实施方式
实施例1：
1、本发明培养基的制备：
基础培养基：
（1）PPLO肉汤22.0 g
（2）丙酮酸钠5.0 g
（3）葡萄糖6.0 g
（4）质量浓度为1%的酚红2.0 ml
（5）去离子水750ml。
115℃灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成本发明培养基。
辅助培养基：
（6）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110 ml
（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺17.0 ml
（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0 ml
（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白 33.0 ml
（10）青霉素 (20万IU/ml) 0.25ml
（11）无菌马血清50 ml
将基础培养基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去离子水（5）中，115℃高压灭菌20min后晾至室温备用。将辅助培养基的（6）～（11）成分分别经0.22 微米滤膜滤过除菌后充分混合；无菌条件下，将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装，置4℃保存备用。
2、质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液的制备方法为：
取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：去离子水以=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8-8.0，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补去离子水至2000 ml，-20℃保存备用。
3、质量浓度为1%的酚红溶液的配制：
称取酚红1.0 g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去离子水），研磨至完全溶解。将溶解的酚红吸入100 ml量瓶中，用去离子水小心洗下研钵中残留酚红液至量瓶中，最后补加去离子水至100 ml。
实施例2：
本发明培养基的制备：
基础培养基：
（1）PPLO肉汤22.0 g
（2）丙酮酸钠5.0 g
（3）葡萄糖8.0 g
（4）1%酚红2.0 ml
（5）去离子水750ml。
115℃灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成本发明培养基。
辅助培养基：
（6）25%新鲜酵母浸出液120 ml
（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺17.0 ml
（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0 ml
（9）质量浓度为15%水解乳蛋白33.0 ml
（10）青霉素 (20万IU/ml) 0.25ml
（11）无菌马血清50 ml
将基础培养基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去离子水（5）中，115℃高压灭菌20min后晾至室温备用。将辅助培养基的（6）～（11）成分分别经0.22 微米滤膜滤过除菌后充分混合；无菌条件下，将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装，置4℃保存备用。
对比试验
应用本发明培养基、改良Thiaucourt’s培养基、牛心汤培养基和改良KM2培养基对牛支原体PG45株进行了比较试验，试验及结果如下。
一、培养基制备
1、本发明培养基的制备
基础培养基：
（1）PPLO肉汤22.0 g
（2）丙酮酸钠5.0 g
（3）葡萄糖6.0 g
（4）质量浓度为1%的酚红2.5 ml
（5）去离子水750ml。
115℃灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分，制成本发明培养基。
辅助培养基：
（6）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110 ml
（7）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16.7 ml
（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0ml
（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白 33.0 ml
（10）青霉素 (20万IU/ml) 0.25ml
（11）无菌马血清50 ml
将基础培养基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去离子水（5）中，115℃高压灭菌20min后晾至室温备用。将辅助培养基的（6）～（11）成分分别经0.22 微米滤膜滤过除菌后充分混合；无菌条件下，将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装，置4℃保存备用。
2、改良Thiaucourt’s培养基的配制
基础液：
PPLO肉汤21.0 g
丙酮酸钠2.0 g
葡萄糖1.0 g
0.4%酚红4.5 ml
去离子水700ml。
115℃高压灭菌20min。
培养基：
基础液 700ml
25%新鲜酵母浸出液100 ml
青霉素（20万IU/ml）1ml
10%醋酸铊1 ml
无菌马血清200 ml
混合后用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装备用。
3、牛心汤培养基的配制
1％水解乳蛋白Hank’s液562.5 ml
牛心汤337.5 ml
25%新鲜酵母浸出液20 ml
青霉素（20万IU/ml）1ml
1%酚红2.5 ml
10%醋酸铊1 ml
无菌马血清100 ml
混合后用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装备用。
4、改良KM2培养基的配制
MEM 5 g
葡萄糖0.4 g
丙酮酸钠0.2 g
水解乳蛋白5.1 g
1%酚红2.5 ml
25%新鲜酵母浸出液20 ml
青霉素（20万IU/ml）1ml
10%醋酸铊1 ml
无菌马血清200 ml
混合，用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装备用。
二、牛支原体的培养
将牛支原体PG45株（购自美国菌种保藏中心ATCC，编号ATCC 25523）分别接种本发明培养基（血清含量为5%）、牛心汤培养基（血清含量为10%）、改良Thiaucourt’s培养基（血清含量为20%）和改良KM2培养基（血清含量为20%），种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.4 降至6.8～6.9 时，无菌取出培养物。
三、检测
活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的牛支原体培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10-1-10-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。试验重复3次。
四、试验结果：
牛支原体接种4种培养基3次生长试验CCU测定结果见表1。
经3次试验结果显示，在同样条件下，使用本发明培养基培养牛支原体的生长时间为1天，改良Thiaucourt’s培养基培养牛支原体的生长时间为1天，牛心汤培养基和改良KM2培养基培养牛支原体的生长时间为2天；改良Thiaucourt’s培养基3次CCU测定结果为108～109CCU/ml，牛心汤培养基3次CCU测定结果均为108 CCU/ml，改良KM2培养基3次CCU测定结果均为107 CCU/ml。使用本发明培养基培养牛支原体，3次CCU测定结果均为1010 CCU/ml（表1），明显高于现有技术培养基培养牛支原体的活菌滴度。结果说明，本发明的牛支原体培养基具有血清含量低、生长迅速和活菌滴度高的特点。