专利名称：Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株支原体(Mycoplasma)分离株，尤其涉及Leachii支原体中国分离 株以及适合于该分离株分离和传代培养的培养基，本发明还涉及该分离株在研制防制或检 测由Leachii支原体所致疾病的生物制品中的用途，属于支原体的分离和应用领域。
背景技术：
支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、可在无 生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体于1898年由Nocard等首次 分离，1956年正式命名为支原体，在微生物分类中建立了一个新的独立的纲-柔膜体纲 (Mollicutes)，并成为一门独立的学科，即支原体学。支原体在分类上属于柔壁菌门(Tenericutes)，柔膜体纲(Mollicutes)，支原体 目(Mycoplasmatales)，支原体科(Mycoplasmataceae)成员。支原体科包含4个属，即支原 体属(Mycoplasma),附红细胞体属(Eperythrozoon),血巴尔通体属(Haemobartonella)禾口 脲原体属(Ureaplasma)。支原体属包含丝状支原体族(Mycoplasma mycoides)等共约119 种支原体。在以前的分类中，丝状支原体族包含2个群，分别为丝状支原体群 (M. mycoidesgroup)和山羊支原体群(M. capricolum group)。丝状支原体群包含丝状支 原体丝状亚种小菌落型(M. mycoides subsp. mycoides Small Colony，MmmSC)、丝状支原体 丝状亚种大菌落型(M. mycoides subsp. mycoides Large Colony, MmmLC)禾口丝状支原体山 羊亚种(M. mycoides subsp. capricolum, Mmc) 3个种；山羊支原体群包含山羊支原体山羊 亚禾中(M. capricolum subsp. capricolum, Mcc)、山羊支原体山羊月市炎亚禾中(M. capricolum subsp. capripneumoniae,Mccp)禾口牛 7 型支原体(Mycoplasma sp. bovine group 7,MBG7) 3 个种。由于在分析MBG7与丝状支原体族中其他5个种的关系时，用不同的方法得出相互矛 盾的结果。16S rRNA基因序列同源性分析、血清学交叉反应试验以及一维和二维SDS-PAGE 蛋白特性分析结果显示，MBG7与山羊支原体的关系更近，尤其是16S rRNA基因序列同源 性分析结果显示，MBG7与山羊支原体之间具有高度同源性，MBG7菌株PG50和Mcc菌株 California kid的16SrRNA基因序列仅有4个核苷酸变异。但是，DNA杂交试验以及LppA 基因、gtsABS基因和rpoB基因的序列同源性分析却显示，MBG7与MmmSC具有非常近的进 化关系。由于血清学试验显示MBG7与Mcc的关系更近，所以以往的研究一直将MBG7作为 一个独立的种隶属于山羊支原体群。2009年，Manso-Silvan L等提出丝状支原体新的分类 方法，将丝状支原体分成3个群，包括丝状支原体群、山羊支原体群及Leachii支原体新种 群(Mycoplasma Leachii sp. nov.)。丝状支原体群包括MmmSC和Mmc 2个种，由于MmmLC 与Mmc的亲缘关系非常近，所以将MmmLC作为Mmc的一个血清型归属于Mmc ；山羊支原体群 包括Mcc和Mccp 2个种；Leachii支原体新种群包含1个种，即MBG7，新的命名为Leachii 支原体新种(Mycoplasma leachii sp. nov. ) 0这样，新的命名分类将丝状支原体分成3个 群、5个种。
Leachii支原体最初是由Simmons G C等于1963年在澳大利亚患多发性关节炎犊 牛的关节液内分离获得，典型代表菌株为PG50。之后，该病原菌陆续从患乳房炎的母牛、患 关节炎和肺炎的犊牛以及流产胎儿的体内获得分离。目前全世界大约有60个Leachii支 原体分离株，除6株分离于德国、葡萄牙、尼日利亚和法国外，其余所有菌株均分离自澳大 利亚。Simmons G C等通过关节内注射Leachii支原体分离培养物能够复制出犊牛的多 发性关节炎，Cormole M D等通过乳头管内灌注Leachii支原体能够复制出轻度乳房炎，证 明Leachii支原体能够直接引起犊牛多发性关节炎和泌乳母牛乳房炎。尽管Leachii支原 体也从患肺炎犊牛和流产胎儿的体内分离获得，但是其能否直接引起犊牛肺炎和怀孕母牛 流产的致病性试验还未见报道。有关Leachii支原体的致病性，目前的研究认为，Leachii 支原体能够直接引起犊牛关节炎以及泌乳母牛乳房炎，与犊牛肺炎及母牛流产有关。Leachii支原体的确切来源以及传播途径目前尚不清楚。Alexander及Hum等认 为，犊牛关节炎可能是由于饲喂被Leachii支原体污染的乳汁而引起。本发明人通过大量 的调查结果显示，同一批精液配种母牛生产的犊牛多发性关节炎的发生率为100%，而另外 来源精液配种的母牛所产的犊牛则不发生这种多发性关节炎。据此认为精液传播至少是本 病的传播途径之一。有的犊牛在出生时关节即肿大，这一点也佐证了精液传播的可能性。本 发明人对该发病牛场进行追踪性流行病学调查，对患有严重乳房炎的母牛采集鼻拭子、乳 汁样品及乳房破溃面拭子，在这些样品中均检测并分离出Leachii支原体。因此推测，该病 的垂直传播途径为精液传播，水平传播途径主要是在犊牛出生时经脐带创口直接接触而感
^fe ο迄今为止，在中国尚未分离得到Leachii支原体分离株，因此，分离获得一株 Leachii支原体中国分离株，这对于研究Leachii支原体的传播途径以及研制预防或治疗 由Leachii支原体所致疾病的生物制品具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株Leachii支原体中国分离株；本发明目的之二是提供一种适合于该Leachii支原体中国分离株的分离和传代
培养的培养基；本发明目的之三是将所分离的Leachii支原体中国分离株应用于预防或治疗由 Leachii支原体所致的疾病。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一株Leachii支原体(Mycoplasma)中国分离株(GN408)，其微生物保藏号是 CGMCC No. 3808 ；分类命名是Mycoplasma Leachii ；保藏时间是2010年5月6日；保藏单 位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2009年2月 6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关 节炎，大部分在出生3 5天后发病，少数在出生时关节即肿大。发病初期，犊牛呈现轻微 的四肢僵硬和跛行，发病2 3天后病情迅速恶化，腕关节和跗关节迅速肿大，内有积液，触 摸有波动感，后期关节腔内产生大量干酪样纤维素性渗出物，填充整个关节腔，触摸有实质
4感，常规抗生素治疗没有效果。部分犊牛因多种并发症而死亡，没有死亡的犊牛由于造成了 关节的永久损伤、肢体变形，导致卧地不起和生长迟缓，最终被淘汰。为鉴定病原，本发明人 无菌采集2份早期发病并具有典型症状犊牛的关节液样品，经常规细菌学检查，均为阴性。 然后将病料直接接种于支原体液体培养基，待颜色变黄后将培养物接种下一代。原始样品 接种在液体培养基上，2 3天培养基开始变黄，传至2 3代10倍稀释接种24h后开始变 黄，并呈轻微浑浊状。之后转到固体培养基上培养，48h开始出现针尖大小的菌落，至96h在 普通光学显微镜下可看到圆形、边缘整齐、具有典型的“油煎蛋”形态的菌落(图1)。将在 固体琼脂培养基上生长的单菌落经3次克隆进行纯化，作为后续鉴定及其它研究的菌种。 根据分离培养物的培养特性以及在固体琼脂培养基上形成的典型菌落形态特征，初步确定 本发明从患病犊牛关节液中分离的病原为支原体。本发明从患病犊牛关节液中分离的病原纯培养物经负染在电子显微镜下观察，可 见典型的支原体菌体，呈棒状、丝状等多形性形态。对本发明从患病犊牛关节液中分离的病原培养物进行16S rRNA基因和LppA基因 的PCR扩增，结果均扩增出与预期大小相符的目的条带，16S rRNA基因约为1.5kb (图4)， LppA基因约为1. 4kb (图5)。由于扩增LppA基因的引物是Leachii支原体特异性引物， 该引物能够对分离菌株进行特异性扩增，由此确定本发明所分离的支原体为Leachii支原 体。生化试验结果显示，本发明从患病犊牛关节液中分离的病原能发酵葡萄糖、需要 胆固醇、不水解精氨酸、不分解尿素，这些结果也均符合Leachii支原体的特征。为进一步确定本研究分离菌株与其它支原体的亲缘关系，对分离株的16S rRNA基 因和LppA基因进行遗传进化分析。结果显示，就16S rRNA基因而言，本发明分离株(GN408) 与丝状支原体族中的成员亲缘关系较近(图6)，同源性介于97. 4% 99. 9%之间，与其中 的Leachii支原体代表株PG50和山羊支原体山羊亚种(Mcc)同源性最高，达99. 9% ；与丝 状支原体丝状亚种大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，为97. 4%。就LppA基因而言，本发 明支原体分离株也与PG50的亲缘关系最近(图7)，同源性高达99. 6%，而与丝状支原体 族中其它成员的同源性在56. 3% 95. 之间；与丝状支原体丝状亚种小菌落型(MmmSC) 菌株的亲缘关系较近，同源性为95. 1%，而与其他几种支原体的亲缘关系则较远，同源性在 56. 3% 69. 6%之间。序列分析结果确定，本发明所分离的支原体与最初分离的澳大利亚 Leachii支原体具有非常近的进化关系，属于同一来源。现有技术中，常用于支原体的分离及传代培养的培养基多为改良Hayflick培养 基(配方1)，其配方组成见表1。用该培养基分离和传代培养Leachii支原体多存在培养 周期长、生产成本高等缺陷，有待改进。为此，本发明人对改良Hayflick培养基的组成和 用量进行了优化和筛选，在培养基中添加了终浓度为0. 4%的丙酮酸钠，将马血清的浓度由 20%降为15%，得到了改进后的配方(配方2)。改进后的配方组成为按g/ml计，PPLO肉汤2. 1%，水解乳蛋白0. 5%，葡萄糖 1 %，酵母浸出物0. 5%，醋酸铊0. 01 %，青霉素0. 01 %，酚红0. 002%，胸腺DNA 0. 002%， β NAD 0.009%，丙酮酸钠0.4%，马血清15%，余量为水。本发明将本发明所分离的支原体菌株(GN408)同时以相同浓度接种两种不同的 培养基，进行传代培养，不同时间收获培养物，对每个收获样品测定ecu。试验结果显示，配方1达到最高滴度时的C⑶为1 X 10_8，而配方2达到最高滴度时的C⑶为1 X 10_9 (图2)； 并且配方2的传代培养物达到最高滴度所需的时间比较短，这在实际应用过程中可以大大 缩短培养周期，从而降低生产成本。本发明也对不同的马血清浓度进行了摸索，结果显示， 在其他条件不变的情况下，马血清的最小添加量为15%，所以改进的培养基减少了马血清 的含量，不但可以降低生产成本，而且还可以降低在疫苗应用过程中可能出现的副作用。致病性试验结果表明，本发明支原体分离株的传代培养物关节内接种1 2月龄 健康犊牛，可复制出典型的多发性关节炎，并能引起一定的死亡，死亡犊牛具有明显的全身 症状，多组织器官具有明显的病理变化。结合临床发病和人工感染犊牛的临床症状和病理 变化、疾病的流行特点、随后的追踪性流行病学调查以及分离病原的特异性PCR鉴定和遗 传进化分析，认定引起该次疫情的病原为Leachii支原体。
图1普通光学显微镜下可看到菌落呈圆形，边缘整齐，大小不一，典型的“油煎蛋” 形态(40X)。图2同一菌株以相同浓度接种不同培养基的生长曲线。图3分离菌株不同浓度接种相同培养基的一步生长曲线。图4关节液原始样品及纯培养物16S rRNA基因PCR扩增结果；1 :GN407原始样品； 2 :GN408 原始样品；3 :GN407 纯培养物；4 :GN408 纯培养物；M :250bp DNA Iaddermarker0图5关节液原始样品及纯培养物LppA基因PCR扩增结果；M :250bp DNA Iaddermarker ；1 :GN407原始样品；2 :GN408原始样品；3 :GN407纯培养物；4 :GN408纯培养 物·图6GN407和GN40816S rRNA基因的遗传进化分析。图7GN407和GN408 LppA基因的遗传进化分析。图8分离培养物的电子显微镜形态学观察。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例一、试验材料和方法1.样品来源2009年2月 6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关 节炎，从中无菌采集了 2份早期发病并具有典型症状的犊牛的关节液，_70°C冻存备用。2.试验材料DNA凝胶回收试剂盒，柱式小量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒；Ex Taq DNA聚 合酶；Hyclone供体马血清；PPLO肉汤(BD-Difco)；酵母浸液(BD-Bacto)；实验中所用其它 化学试剂均为分析纯级别。
3.主要仪器设备各种规格移液器及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国印pendorf公司)； MC0-15AC 二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；1X51倒置显微镜 (OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABC0NC0公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精 宏)；空气浴恒温摇床(KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江 苏海门麒麟医用仪器厂)；PCR仪(MyCycler 型，美国Bio-Rad公司)；GIS-2020全自动凝 胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTA⑶S小型超纯 水仪(德国MEMBRAPURE公司)。4.常规细菌学检查将无菌采集的关节液样品直接接种在普通肉汤、脑心浸汤、厌氧肉肝汤、血琼脂培 养基上，均置于37°C培养箱内培养，2 3天后观察生长情况。5.支原体分离培养(1)支原体培养基成份溶液I 基础肉汤乳清蛋白水解物，5g ；PPLO肉汤，21g ；溶于700ml超纯水，调pH 7. 8，高压灭菌4°C保存备用。溶液II 50% (W/V)葡萄糖溶液，过滤除菌4°C保存备用。溶液III 5% (W/V)酵母浸液，过滤除菌4°C保存备用。溶液IV 5% (W/V)醋酸铊溶液，过滤除菌_20°C保存备用。溶液V :100mg/ml青霉素，过滤除菌，_20°C保存备用。溶液VI 酚红溶液Ig酚红置于研钵中，慢慢滴加0. 025mol/L NaOH溶液，边加 边研磨，直到完全溶解，将溶液倾入IOOmL量瓶中，以超纯水洗涤研钵数次，洗涤液均倾入 量瓶内，加水到100mL，116°C 20min高压灭菌，4°C保存备用。溶液Vn 0.2%小牛胸腺DNA，现用现配，无菌操作。溶液VDI 0.9% β NAD，现用现配，无菌操作。溶液IX :50%丙酮酸钠溶液，过滤除菌，4°C保存备用。马血清。(2)支原体培养基配方配方 1 改良 Hayflick 培养基配方见表 1。(PPLO(pleuropneumoniae-likeorgan isms)，胸膜肺炎类微生物)。表 1 配方2本发明对改良Hayflick培养基进行改进，添加了终浓度为0.4%的丙酮酸钠，马血清的浓度降为15%，其配方见表2。
表2 L0060」 在基础肉汤中添加约1. 4%的琼脂糖，高压灭菌后冷却至60°C左右再添加液体培 养基的其他成份，制备成含琼脂糖的固体培养基，倒平板，待冷却后置4°C保存备用。(3)支原体分离培养将无菌采集的关节液样品直接接种到液体培养基内，置37°C培养箱内静置培养， 待培养基颜色变黄后将培养物接种下一代。将稳定传代的培养物接种到支原体固体培养基 上，置37°C含有5% CO2的培养箱内培养，2 3天后在固体培养基上肉眼可见针尖大小的 菌落，在普通光学显微镜下呈现支原体菌落典型的“油煎蛋”形态。挑取1个单菌落克隆3 次进行纯化。6.颜色变化单位(CXU)的测定将液体培养基分装于小管中，每管0. 9ml，于第1管加备检液0. 1ml，吹吸混勻后取 0. Iml至第2管，依次作10倍梯度稀释8 10管，最后1管不加被检液作为阴性对照。置 37°C温箱孵育，以培养基不发生颜色改变为阴性，发生颜色改变的最后一管的稀释倍数即 为 CCU。7. PCR 检测(1)引物设计针对支原体16S rRNA基因全长序列(U26053. 1)设计一对引
8物(16S-U 5 ‘ AAAATGAGAGTTTGATCCTGG 3 ‘和 16S-L 5 ‘ AGAAAGGAGGTGATCCATCCG 3')，用于16S rRNA基因全序列的扩增。应用Frey等研究设计的针对LppA基因的 Leachii 支原体特异性引物(P67BG7-L 5 ‘ GGTAATTCGAATAATGATCCT 3 ‘和 P67BG7-R 5 ‘ TAAGTTTATTGAATTAAAGCG3 ‘)对LppA基因全序列进行扩增。引物均由上海生物工程技 术服务有限公司合成。(2) DNA提取应用上海华舜生物工程公司的柱式小量组织/细胞基因组DNA抽提 试剂盒提取病料或纯培养物的DNA，操作按说明书进行，简述如下a.取待检测样品或纯培养物300 μ 1，加入200 μ 1 DS液和25 μ 1 proteinase K， 温和地来回颠倒离心管彻底混勻，置50°C温育lOmin，期间来回颠倒离心管数次；b.加入200 μ 1 DLT液和8ul RNase Α,迅速来回颠倒离心管彻底混勻，置65°C温 育15min，期间来回颠倒离心管数次，12000Xg离心2min，将上清全部移入干净的离心管 中；c.加入200μ 1无水乙醇，混勻后全部移入吸附柱中，9000Xg离心30S，倒掉收集 管内液体，将吸附柱放回收集管中；d.加入500μ1 WGP液，静置lmin，9000Xg离心30S，倒掉收集管内液体，将吸附
柱放回收集管中；e.加入500 μ 1 WGP液，9000Xg离心30S，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集
管中；f.空柱离心 Imin ；g.将吸附柱移入一个新的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入50 μ 1 65°C预热的 超纯水，静置5min，9000Xg离心2min，将DNA轻微混勻后，_20°C保存备用。(3)PCR 扩增25μ1 反应体系水 16μ1，Ex-Taq Buffer 2. 5μ 1, dNTPs (2. 5mM)2y 1，上、下游引物(10ρΜ/μ 1)各 1· 5 μ 1，Ex-Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ 1，DNA 模板 2. 5 μ 1。反应条件为94°C 预变性 4min，94°C 45S，55°C 45S，72°C 1. 5min 30 个循环， 最后72°C延伸lOmin。16S rRNA基因预计扩增片段长度约为1. 5kb，LppA基因预计扩增片 段长度约为1.4kb。8.序列测定与分析PCR扩增产物用上海华舜生物工程公司生产的凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产 物直接送上海生物工程公司进行测序，用MegAlign软件将测序结果与国际已知菌株的相 应基因序列进行比对分析。9.生化实验使用北京陆桥技术有限责任公司生产的生化鉴定管对纯培养物进行生化指标鉴 定，按说明书进行操作，主要步骤如下(1)实验准备从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点(瓶颈上方蓝点)反方向用力折 开安瓿瓶，插入安瓿瓶架中；(2)接种方法用接种针从平板上挑取已分离的单一菌落分别接种于需要试验的 安瓿瓶中；(3)培养及判定将接种好的安瓿瓶置适宜温度下培养，培养24 48h观察结果， 按说明书的判定标准进行判定。
10.电镜观察取Iml本发明所分离的纯培养物，12000r/min离心10分钟，弃去上清液。用 50 μ IPBS缓冲液(ρΗ7. 4)重悬沉淀，取混悬液一滴滴在蜡板上，将200目有膜的铜网翻扣插 入悬液中，静置20min。用滤纸吸干铜网周围水分，用2%磷钨酸(pH7. 0)固定2 5min，将 载样铜网进行电子显微镜观察。11.犊牛接种4头1月龄健康犊牛，分别编号为1 4号。1、2号牛左趾关节和左腕关节内接种 Iml本发明所分离的支原体培养物；3、4号牛左趾关节和左腕关节内接种Iml支原体液体培 养基(表3)。4头犊牛饲养在同一个牛舍内，接种后逐日观察每头犊牛身体状况。(接种分 离株的CCU为1 X IO"8)。表3接种犊牛分组 二、试验结果(一)支原体分离培养1、支原体的分离及传代培养2009年2月 6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关 节炎，大部分在出生3 5天后发病，少数在出生时关节即肿大。发病初期，犊牛呈现轻微 的四肢僵硬和跛行，发病2 3天后病情迅速恶化，腕关节和跗关节迅速肿大，内有积液，触 摸有波动感，后期关节腔内产生大量干酪样纤维素性渗出物，填充整个关节腔，触摸有实质 感，常规抗生素治疗没有效果。部分犊牛因多种并发症而死亡，没有死亡的犊牛由于造成了 关节的永久损伤、肢体变形，导致卧地不起和生长迟缓，最终被淘汰。为鉴定病原，本发明无菌采集2份早期发病并具有典型症状犊牛的关节液样品， 经常规细菌学检查，均为阴性。然后将病料直接接种于支原体液体培养基，待颜色变黄后将 培养物接种下一代。原始样品接种在液体培养基上，2 3天培养基开始变黄，传至2 3 代10倍稀释接种24h后开始变黄，并呈轻微浑浊状。之后转到固体培养基上培养，48h开始 出现针尖大小的菌落，至96h在普通光学显微镜下可看到圆形、边缘整齐、具有典型的“油 煎蛋”形态的菌落(图1)。将在固体琼脂培养基上生长的单菌落经3次克隆进行纯化，作 为后续鉴定及其它研究的菌种。根据分离培养物的培养特性以及在固体琼脂培养基上形成 的典型菌落形态特征，初步确定本发明从患病犊牛关节液中分离的病原为支原体。2、本发明改进的培养基配方对Leachii支原体培养的影响配方1(改良Hayflick培养基配方)和配方2 (本发明改进的培养基配方)均可以 用于支原体的分离及传代培养。为了比较两种培养基之间的差别，本试验将本发明所分离 得支原体菌株(GN408)同时以相同浓度接种两种不同的培养基，进行传代培养，不同时间 收获培养物，对每个收获样品测定(XU。结果显示，配方1达到最高滴度时的C⑶为IX 10_8，而配方2达到最高滴度时的C⑶为1 X ΙΟ"9 (图2)；并且配方2的传代培养物达到最高滴度 所需的时间比较短，这在实际应用过程中可以大大缩短培养周期，从而降低生产成本。本研 究也对不同的马血清浓度进行了摸索，结果显示，在其他条件不变的情况下，马血清的最小 添加量为15%，所以改进的培养基减少了马血清的含量不但可以降低生产成本，而且还可 以降低在疫苗应用过程中可能出现的副作用。( 二)分离菌株的培养特性为确定本发明分离的支原体的体外培养特性，将已经适应传代的分离菌株分别以 1 X 106(XU、1 X IO5CCU和1 X IO4CCU的浓度接种液体培养基。结果显示，适应传代的分离菌 株在液体培养基中达到最高生长滴度时的c⑶为IX10Λ初始接种浓度越低，达到最高 滴度的速度就越慢，并且最高滴度的维持时间也越短，但不同接种浓度均能够达到CCU为 1X10_9的生长滴度(图3)。(三)分离物的鉴定1、PCR 鉴定对关节液病料及其纯培养物进行16S rRNA基因和LppA基因的PCR扩增，结果 均扩增出与预期大小相符的目的条带，16S rRNA基因约为1.5kb (图4)，LppA基因约为 1.4kb (图5)。由于扩增LppA基因的引物是Leachii支原体特异性引物，该引物能够对分 离菌株进行特异性扩增，由此确定本发明分离的支原体为Leachii支原体。2、序列分析为进一步确定本发明分离菌株(GN408)与其他支原体的亲缘关系，对分离株的 16S rRNA基因和LppA基因进行遗传进化分析。结果显示，就16S rRNA基因而言，本发明 分离菌株(GN408)与丝状支原体族中的成员亲缘关系较近(图6)，同源性介于97. 4% 99. 9%之间，与其中的Leachii支原体代表株PG50和山羊支原体山羊亚种(Mcc)同源性最 高，达99. 9% ；与丝状支原体丝状亚种大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，为97. 4%。就 LppA基因而言，本发明分离菌株(GN408)与PG50的亲缘关系最近(图7)，同源性达99. 6%, 与丝状支原体族中其它成员的同源性在56. 3% 95. 之间，与其中的丝状支原体丝状 亚种小菌落型(MmmSC)菌株的亲缘关系较近，同源性为95. 1 %，而与其他几种支原体的亲 缘关系则较远，同源性在56. 3% 69. 6%之间。序列分析结果确定，本发明所分离的支原 体与最初分离与澳大利亚的Leachii支原体具有非常近的进化关系。3、生化实验生化试验结果显示，本发明分离株(GN408)能发酵葡萄糖、需要胆固醇、不水解精 氨酸、不分解尿素，这些结果均符合Leachii支原体的特征。4、电镜观察纯培养物经负染在电子显微镜下观察，可见典型的支原体菌体，呈棒状、丝状等多 形性形态(图8)。(四)致病性试验关节内接种支原体分离物的2头犊牛先后发生了多发性关节炎，并伴有体温升高 (39. 8°C )、呼吸困难及食欲减退等症状。行走呈缓慢姿态，强行驱赶时出现跛行症状。到病 程后期1、2号犊牛不能自行站立，机体极度消瘦，四肢所有关节全部明显肿胀，腕关节和跗 关节最严重。其中2号犊牛于接种后第21天死亡。关节内接种支原体培养基的犊牛(即3、4号犊牛)在接种后均未发生多发性关节炎及其它临床病理变化，至试验结束(接种1个 月后)健康状况一直良好。对死亡犊牛进行剖检，关节腔内有半透明状关节积液，腔内充满 大量的干酪样纤维素性渗出物，关节滑膜囊肿。肺脏、肝脏、脾脏以及肾脏也具有明显的病 理变化。在无菌采集的关节液中再次检测并分离到Leachii支原体，再次分离菌株的16S rRNA基因和LppA基因的核苷酸序列与接种株的同源性为100%。
权利要求
一株Leachii支原体(Mycoplasma)中国分离株，其微生物保藏号是CGMCCNo.3808。
2.用于分离或传代培养权利要求1所述Leachii支原体中国分离株的培养基，包 括按g/ml计，胸膜肺炎类微生物肉汤2. 1%，水解乳蛋白0. 5%，葡萄糖1%，酵母浸出物 0. 5%，醋酸铊 0. 01%，青霉素 0. 01%，酚红0. 002%，胸腺 DNA 0. 002%, β-NADO. 009%，丙 酮酸钠0.4%，马血清15%，余量为水。
3.权利要求1所述Leachii支原体中国分离株在制备预防或治疗由Leachii支原体所 引起的疾病的生物制品中的用途。
4.权利要求1所述Leachii支原体中国分离株在制备诊断或检测由Leachii支原体所 引起的疾病的试剂中的用途。
5.按照权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的由Leachii支原体所引起的 疾病包括犊牛多发性关节炎或犊牛肺炎。
全文摘要
本发明公开了一株Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途。本发明所分离的Leachii支原体中国分离株的微生物保藏号是CGMCC No.3808。本发明还公开了适合于所述Leachii支原体中国分离株的分离或传代培养用的培养基。致病性试验结果表明，本发明支原体分离株的传代培养物关节内接种1～2月龄健康犊牛，可复制出典型的多发性关节炎，并能引起一定的死亡，死亡犊牛具有明显的全身症状，多组织器官具有明显的病理变化。结合临床发病和人工接种犊牛的临床症状和病理变化、疾病的流行特点、追踪性流行病学调查以及分离病原的特异性PCR鉴定和遗传进化分析，确证本发明所分离的支原体为Leachii支原体。
文档编号A61P31/04GK101880646SQ20101019772
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者于力, 刘海军, 常继涛 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所