专利名称：白地霉菌株、培养方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物催化剂、培养方法及其催化还原酮合成手性醇化合物的用途。
立体选择性还原酮得到手性醇，可以作为许多具有光学活性天然产物的合成砌块和药物的合成前体。目前，不对称还原的方法主要是用化学方法，如有机硼试剂或微生物和酶催化还原，尽管已有众多的文献报导利用微生物转化法获得手性醇(如R.Csuk，B.I.Glanger，Chem.Rev 1991，91，49-97；S.Servi，Syntheses，1990，1-25；E.Santaniello，P.Ferraboschi，P.Grisenti，A.Manzocchi，Chem.Rev.1992，92，1071-1140；R.S.Pereira，Critical Reviews in Biotechrology，1998，18，25-83)，但是几乎都使用啤酒酵母(Baker’s yeast)进行还原转化，虽然啤酒酵母廉价易得，但是其对前手性的羰基催化还原时普遍遵循Prelog规则，催化还原酮只能获得一种构型的手性醇产物，如R-构型，而另外一种构型的手性醇却无法直接获得。所以，寻找一种具有高还原活力的菌株，可以选择性地进行反-Prelog规则还原酮获得与啤酒酵母还原结果相反的另一种构型的手性醇化合物，不仅会拓展微生物催化合成的方法，而且可直接用于合成手性药物。
本发明目的是提供一种具有优良还原能力的白地霉新菌株。
本发明目的还提供一种培养上述菌株的方法。
本发明的另一目的是提供一种上述菌株的用途，可选择性地催化还原醇得到S-手性醇化合物。
本发明提供一种具有优良还原能力的菌株白地霉G 702(Geotrichum sp.702)，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，登记入册的编号为CGMCC NO 0416。该菌株系从泥土中存在的上千种菌株中经大量筛选获得的一株纯的菌株，在沙氏斜面上生长两天后为乳白色，经培养后可用于有机化学反应，在显微镜下观察，该菌株呈丝棒状。
通常可用下述方法对白地霉G 702菌株进行培养和接种。用接种环挑取白地霉G 702菌体接到沙氏斜面上，在培养基中生长1-2天，然后从沙氏斜面上挑取生长良好的菌体接到培养液中，室温下往复摇床培养1-2天，离心(5,000rpm)30分钟，菌体用0.8％生理盐水洗涤，再离心后获菌体可用于反应。
所述的沙氏斜面培养基是由2％葡萄糖、1％酵母膏、1％蛋白栋、2％琼脂的水溶液组成，呈自然PH值。所述的培养液是10％葡萄糖，1％酵母膏，0.1％尿素的水溶液，呈自然PH值。
本发明的白地霉G 702菌株具有高还原活力的菌株，可选择性地还原酮获得与啤酒酵母还原结果相反构型的S-手性醇产物，得到反-Prelog型的S-构型的手性醇化合物。而手性醇化合物是一些重要的生理活性化合物和手性药物的中间体，例如可通过白地霉G 702将下述酮还原成手性S-构型的醇
其中产物13可以转化成有用的合成砌块14。化合物4和16可用于合成手性药物d-Sotalol，又称S-甲磺胺心定，是一种β-阻滞剂。当化合物11中X＝-SO2-时，可用于合成手性药物和甲砜霉素等。
本发明的白地霉G702是一株具有极高还原活力的菌株，培养方法简单，生长速度块，不易变异，而且可以广泛地催化还原不同类型的含羰基化合物，立体选择性地得到相应的手性醇产物，尤其是这些产物是用包括啤酒酵母在内的一般生物还原方法所难以获得的反-Prelog的选择性产物，具有工业化应用前景。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不能限制本发明的内容。
实施例1 菌体的培养用接种环挑取白地霉G702菌体接到沙氏斜面上，在沙氏斜面培养基中生长2天，呈乳白色，然后从沙氏斜面上挑取生长良好的菌体接到培养液中，30℃下往复摇床培养2天，离心(5,000rmp)30分钟，菌体用0.8％生理盐水洗涤一次，再离心后所获菌体用于反应。显微镜下观察菌体呈丝棒状。
沙氏斜面培养基(％)葡萄糖2，酵母膏1，蛋白胨1，琼脂2，自然PH值(PH5.6)。
培养液(％)葡萄糖10，酵母膏1，尿素0.1，自然PH(～PH5.6).
上述培养基和培养液均在120℃和压力下灭菌20分钟。
实施例2 (S)-对硝基苯乙二醇的合成取新鲜培养的白地霉G702湿菌体60g，悬浮于1000ml 5％葡萄糖液中，慢慢加入10gα-羟基对硝基苯乙酮，往复摇床反应(转速120转/分)，TLC跟踪，1天后反应完全。过滤除去菌体，反应液用固体氯化钠饱和后，用乙酸乙酯提取(500ml4)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，获(S)-对硝基苯乙二醇9.5g，产率94％，[α]D2523°(C1.0，CH3OH)，光学纯度100％ee。
实施例3 化合物4的合成α-卤代酮1为底物，操作同实施例2，获产物4，白色固体，mp.88-89℃，产率80％，87％ee，[α]D2528.1°(C1.1，CH2Cl2)。
IR(KBr)，cm-13400，3230，1620，1335，1140，1080，985。
1H NMR(300MHZ，CD3SOCD3)，δ2.97(S，3H)，3.63(dd，1H，J＝11.0，7.1HZ)，3.73(dd，1H，J＝11.0，4.6HZ)，4.73(dd，1H，J＝7.1，4.6HZ)，5.77(bs，1H)，7.17，7.35(AB，4H，J＝8.5HZ)，9.73(S，1H).
HRMS(C9H12ClNO3S+H)+计算值250 305，实测值250.0320。
实施例4 化合物8和9的合成用含杂原子的酮7为底物，操作同实施例2，获产物8和9，8和9为白色固体，mp 69～71℃，[α]D22-96.2(C2.0，CH3OH)，8和9的比例为83∶17，ee值分别为100％和87％。
IR(KBr)，cm-13350，1640，1450，1090，1050，750。
1HNMR(300MHZ，CDCl3)，δ3.06-3.10(m，2H)，3.53-3.75(m，2H)，3.8(6s，1H)，4.41-4.48(m，1H)，7.50-7.70(m，5H).
MS(％)218(m+，2.7)，126(100)，125(64.4)，78(73.8)，77(33.3)，51(20.4)HRMS，(C9H11ClO2S)+，计算值218.0168，实测值218.0168。
实施例5 化合物11的合成用X＝-SO2-的底物，操作同上获化合物11(X＝-SO2-)。产率为92％，ee值为93％。1HNMR(CDCl3，300MHZ)，δ1.23(t，J＝7.1HZ，3H)，3.06(S，3H)，3.5(bs，1H)，4.2(q，2H，J＝7.1HZ)，4.36(d，1H，J＝7.9HZ)，5.20(d，1H，J＝7.9HZ)，7.6，7.9(AB，4H，J＝8.4HZ).MS(％)306(m+，10.92)，255(87.2)，217(69.30)，213(73.05)，185(93.72)，122(100)，94(79.63)，79(52.66)，77(55.31).IR(Kbr)，cm-13350，1710，1640，1350，1100，870.
实施例6 环状双酮12的还原用环状双酮12作底物，操作同上，获化合物13，产率88％，[α]D2331℃(C1.1，CHCl3)，ee值96％。1H NMR(300MHZ，CDCl3)，δ1.14(s，3H)，1.67(m，1H)，1.90(m，1H)，2.05(m，2H)，2.40(m，4H)，2.82(bs，1H)，3.79(m，1H)，5.10(m，2H)，5.73(m，1H)。13CNMR(CDCl3，75MHZ)，δ19.61，20.52，28.45，36.60，37.64，54.11，76.41，117.85，133.87，214.19。IR(薄膜)，cm-13450，3100，2950，1710，1645，1460，1070，1000，920。MS(％)168(M+，13.60)，99(82.05)，97(69.80)，93(86.83)，79(65.05)，67(71.87)，69(69.56)，55(85.65)，43(100)。HRMS(C10H16O2)+计算值168.1150；实测值168.1151。
实施例7 α-羟基酮的还原用α-羟基酮15为底物，操作同上，以75％产率获化合物16，白色固体，mp.135-136℃，[α]D2012.6(C11，CH3OH)，ee值为100％。1HNMR(300MHZ，CD3COCD3)，δ2.94(S，3H)，3.41(S，2H)，3.52(dd，1H，J＝7.7，11.0HZ)，3.60(dd，1H，J＝4.4，11.0HZ)，4.68(dd，1H，J＝4.4，7.6HZ)，7.28，7.37(AB，4H，J＝8.5HZ)。IR(KBr)，cm-13250，1630，1510，1390，1320，1215，1150，1080，1050，990，765。元素分析(％)计算值C46.74，H5.67，N6.06，S13.87；实测值C46.58，H5.65，N5.95，S14.15。
权利要求
1.一种白地霉菌株，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO 0416的白地霉G 702(Geotrichum sp.702)，呈丝棒状。
2.一种如权利要求1所述的白地霉G 702菌株的培养方法，其特征是白地霉G702在沙氏斜面上生长，从沙氏斜面挑取菌体在培养液中室温下培养1～2天，所述的沙氏斜面上有2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％琼脂，自然PH值组成的培养基，所述的培养液含有10％葡萄糖、1％酵母膏，0.1％尿素，自然PH。
3.一种如权利要求2所述的培养方法，其特征是所述的白地霉G 702在沙氏斜面上生长1-2天。
4.一种如权利要求2所述的培养方法，其特征是所述的白地霉G 702经培养液中培养后，菌体用0.8％的氯化钠溶液洗涤，再离心获菌体。
5.一种如权利要求2所述的培养方法，其特征是所述的自然PH值为PH5.6。
6.一种如权利要求1所述的白地霉G702菌株的用途其特征是用于催化还原酮化合物制取手性醇化合物。
7.一种如权利要求6所述的用途，其特征是所述的手性醇化合物具有S构型。
全文摘要
本发明是一种白地霉G702(Geotrichum sp.702)菌株,系从土壤中筛选出并经沙氏斜面上生长良好的菌体在培养液中培养二天获得纯的菌株。该菌株具有高还原活力,可选择性还原酮得到S－型手性醇化合物。
文档编号C07C29/143GK1258735SQ9912575
公开日2000年7月5日 申请日期1999年12月24日 优先权日1999年12月24日
发明者魏志亮, 李祖义, 林国强 申请人:中国科学院上海有机化学研究所