专利名称：生产骨化三醇的发酵培养基以及发酵转化方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种新的生产骨化三醇的发酵培养基以及相应的发酵转化方法和该发酵培养基的用途。
背景技术：
Norman和Boyle等在1971年发现骨化三醇为维生素D3在体内转化后最重要的活性形式。骨化三醇是由罗氏公司研发，并于1978年在瑞士获得通过上市，1988年在我国首次注册。骨化三醇主要用于治疗骨质疏松症和肾性骨病等疾病。随着我国老龄化社会的到来，治疗骨质疏松症的药物市场需求很大。目前骨化三醇的生产主要依赖于化学合成。化学合成骨化三醇的工艺主要是以胆固醇为原料进行大约20步反应得到，产率非常低，小于1%，因此导致骨化三醇原料药的价格非常高，所以开发新的生产工艺十分必要。 1990年，Omura等成功筛选到3株能够将维生素D3转化为骨化三醇的菌株，包括2株链霉菌和I株自养性假诺卡氏菌。1991年，Takeda等在专利EP91305415. I说明向反应体系中加入环糊精可以大幅提高维生素D3的转化率。但该专利中仅报道了菌株ATCC13181的简单培养基和发酵的转化方法，而目前国内外的新的发酵工艺未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有的利用自养性假诺卡氏菌发酵转化生产骨化三醇的发酵培养基转化率低的缺陷，从而提供了一种新的用于自养性假诺卡氏菌发酵转化生产骨化三醇的发酵培养基以及相应的发酵培养方法和该发酵培养基的用途。本发明的发酵培养基可以大大提高骨化三醇的转化率，从而提高生产效率，更加有利于工业化生产,并且能够大大降低骨化三醇的生产成本。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种用于自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)发酵转化生产骨化三醇的发酵培养基,包括碳源和氮源，其中，按所述发酵培养基的总体积计，所述碳源的含量为5-80g/L，较佳地为10-60g/L，更佳地为25-40g/L ;所述氮源的含量为2-80g/L，较佳地为5_50g/L，更佳地为25_40g/L ;所述碳源选自葡萄糖、麦芽糊精和可溶性淀粉中的一种或多种，所述氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一种或多种。在本发明一较佳的实施方式中，所述碳源为葡萄糖和组分A的混合物；其中组分A为麦芽糊精和/或可溶性淀粉，较佳地为麦芽糊精。此时，所述葡萄糖的含量较佳地为5-20g/L,组分A的含量较佳地为5-70g/L，更佳地为5_40g/L ;组分A中，所述麦芽糊精的含量较佳地为10-60g/L，更佳地为20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量较佳地为5_60g/L，更佳地为20-40g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。在本发明的发酵培养基中，所述黄豆饼粉可以选择本领域的各种黄豆饼粉，如热榨黄豆饼粉和/或冷榨黄豆饼粉。所述蛋白胨可选择本领域的各种蛋白胨，较佳地为大豆蛋白胨和/或胰蛋白胨，更佳地为大豆蛋白胨。所述的酵母浸膏或酵母浸粉是采用常规的方法，将新鲜酵母乳液经自溶、酶解、分离、浓缩等技术精制而成的一种可溶性膏状或粉状纯天然制品。其中，所述热榨黄豆饼粉的含量较佳地为5-30g/L ;所述冷榨黄豆饼粉的含量较佳地为5-50g/L，更佳地为5-30g/L ;所述棉籽饼粉的含量较佳地为l_50g/L，更佳地为
2-20g/L ;所述大豆蛋白胨或胰蛋白胨的含量较佳地为l_20g/L，所述酵母浸粉的含量较佳地为l-10g/L，所述酵母浸膏的含量较佳地为l-10g/L;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。在本发明一较佳的实施方式中，所 述氮源为由组分B和组分C组成的混合物，其中组分B选自所述黄豆饼粉、所述棉籽饼粉和所述蛋白胨中的至少一种，较佳地为所述黄豆饼粉和/或所述棉籽饼粉；更佳地为所述黄豆饼粉和/或所述棉籽饼粉，以及所述蛋白胨。所述组分C为酵母浸粉和/或酵母浸膏。此时，所述组分B的含量较佳地为2-65g/L，更佳地为20-40g/L。组分B中，所述黄豆饼粉的含量较佳地为5-50g/L，更佳地为15_40g/L ;所述棉籽饼粉的含量较佳地为l_50g/L，更佳地为2-20g/L ;所述蛋白胨的含量较佳地为2-20g/L0所述组分C的含量较佳地为5-10g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。在本发明的发酵培养基中，如常规的自养性假诺卡氏菌的发酵培养基一样，较佳地还可进一步含有矿物质。所述的矿物质一般作为渗透压调节剂和/或PH调节剂，所述渗透压调节剂较佳地为NaCUNa2HPO4和NaH2PO4中的一种或多种，所述pH调节剂较佳地为CaCO3。所述矿物质的含量按发酵培养基的总体积计较佳地为I. 0-5. Og/L。本发明的发酵培养基如常规的发酵培养基一样，较佳地还可以含有消泡剂。消泡剂的用量为常规用量。在本发明的一较佳的实施例中，所述的发酵培养基包括碳源和氮源，其中所述碳源为5-20g/L葡萄糖以及5-40g/L所述组分A ;组分A中所述麦芽糊精的含量较佳地为20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量较佳地为20-40g/L ;所述氮源为20_40g/L所述组分B以及5-10g/L所述组分C ;所述组分B中所述黄豆饼粉的含量较佳地为15-40g/L ;所述棉籽饼粉的含量较佳地为2-20g/L ;所述蛋白胨的含量较佳地为2-20g/L。较佳地所述发酵培养基中还包括I. 0-5. Og/L所述矿物质；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。在本发明另一较佳的实施例中，本发明的发酵培养基包含碳源、氮源和矿物质，其中所述碳源为葡萄糖5-20g/L、麦芽糊精10-60g/L(优选20-40g/L)和可溶性淀粉10-60g/L(优选20-40g/L);所述氮源为冷榨黄豆饼粉5_40g/L、热榨黄豆饼粉5_30g/L、大豆蛋白胨2-20g/L、棉籽饼粉2-40g/L(优选2_20g/L)和酵母浸粉5_10g/L ;所述矿物质包括NaCl I. 0-5. Og/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。本发明的发酵培养基的pH值为本领域此类发酵培养基的常规pH值，较佳地为
5.0-8. 5，更佳地为 7. 0-8. O。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种骨化三醇的发酵转化生产方法，包括下述步骤(a)将自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)的种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是如上所述的任一项发酵培养基；(b)在所述接种后的0-72小时，向发酵液(即整个发酵体系)中添加底物维生素D3;(c)从发酵液中分离出骨化三醇，即可。
在本发明一较佳的实施例中，在步骤(b)中将￠-环糊精与微生物D3—起添加到所述发酵液中。其中，所述3 -环糊精的添加量为本领域此类发酵转化生产方法的常规添加量，较佳地为2-5g/L所述发酵培养基。本发明中，所述的自养性假诺卡氏菌可以是现有的自养性假诺卡氏菌菌株，较佳地是自养性假诺卡氏菌ATCC13181。在步骤(a)中，所述的自养性假诺卡氏菌的种子液可按本领域的常规方法将自养性假诺卡氏菌在种子培养基中培养得到的。所述种子液可由现有的各种自养性假诺卡氏菌的种子培养基培养制得，所述种子培养基较佳地为ISP2培养基或BG培养基。所述种子培养的温度较佳地是25-32°C。所述种子液的接种量为本领域的常规接种量，较佳地为10% -20% (v/v)。在步骤(a)中，所述的发酵培养的温度是本领域的常规发酵培养温度，较佳地为 20-400C，更佳地为25-37°C。所述发酵培养的时间较佳地为4_9天，更佳地为6_7天。在步骤(b)中，向发酵液中添加底物维生素D3的时间较佳地为接种后0_48h。在步骤(b)中，所述维生素D3的添加量较佳地为50mg/L_250mg/L所述发酵培养基。在步骤(C)中，从发酵液中分离出骨化三醇的方法为本领域的常规方法，一般是将发酵液离心取上清，用乙酸乙酯抽提，经过疏水柱的洗脱，浓缩脱色然后结晶，从而得到
骨化三醇。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是所述的发酵培养基在将自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)发酵转化成骨化三醇中的用途。其中，所述的自养性假诺卡氏菌可以是现有的自养性假诺卡氏菌菌株，较佳地是自养性假诺卡氏菌ATCC13181。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明的积极进步效果在于本发明提供了一种有利于自养性假诺卡氏菌高效发酵转化生产骨化三醇的发酵培养基以及相应的发酵转化方法和该发酵培养基的用途。通过优选发酵培养基中碳、氮源的成分及配比，从而提高了骨化三醇的产量。更进一步的，优化了底物添加时间，使产量进一步提高。本发明提供的骨化三醇的发酵转化生产方法大幅提高了骨化三醇的发酵单位，适用于骨化三醇的规模化生产。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。发酵液中骨化三醇含量测定发酵结束时取适量发酵液，经12000rpm离心lOmin，取上清液经0. 45 u m微孔滤膜过滤后用于高压液相色谱检测。色谱条件色谱柱=UltimateXB-C18 柱(3 u m, 4. 6mmX 50mm);流动相乙腈:水(50 : 50)) (pH = 7. 6);流速1. OmL/min ;波长280nm ;柱温40°C ;进样量10ii L，骨化三醇在7分钟左右出峰。
实施例I取一株自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)ATCC13181 划线于种子斜面培养基，28°C培养96h后接种于摇瓶种子培养基，装液量为20ml/250ml，于28°C，230rpm的旋转式摇床培养48h，得种子液。种子液以10% (v/v)接种量接种于装液量为20ml/250ml的发酵培养基中，于28°C进行发酵120h。在此过程中，在将种子液接种于发酵培养基后的0h，添加200uL维生素D3(2%，m/v) (2%指2g维生素D3溶于IOOmL乙醇中)和2mL ￠-环糊精(2%，m/v) (2%指2g P -环糊精溶于IOOmL水中)。发酵完毕后得发酵液，在发酵液中加入等体积的乙腈后离心取上清。经HPLC测定，骨化三醇产量达6. 8mg/L。其中所用的斜面培养基组成葡萄糖4. 0g/L，酵母浸粉4. 0g/L，麦芽浸粉10. Og/L，琼脂粉20. 0g/L, pH自然。所用的种子培养基为BG培养基葡萄糖15g/L、蛋白胨15g/L、玉米浆粉5g/L、、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L，pH7. O。发酵培养基的组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 4. Og/L, CaCO31g/L, pH7. O。实施例2发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉 10. 0g/L，冷榨黄豆饼粉 10. 0g/L，热榨黄豆饼粉 5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. ImgfL0实施例3发酵培养基的组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精28. 0g/L，棉籽饼粉10. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L，冷榨黄豆饼粉10. 0g/L，热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaC15. 0g/L, pH7. 0。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. 4mg/L。实施例4发酵培养基组成发酵培养基的组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 5. Og/L, pH 7. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. lmg/L。实施例5发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉 10. 0g/L，酵母浸粉 5. 0g/L，热榨黄豆饼粉 5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 5mg/L。实施例6发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉 10. 0g/L，酵母浸粉 5. 0g/L，冷榨黄豆饼粉 10. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。
将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 3mg/L。实施例7发酵培养基组成葡萄糖5. Og/L，麦芽糊精30. Og/L，大豆蛋白胨5. Og/L，棉籽饼粉10. Og/L，酵母浸粉5. Og/L，冷榨黄豆饼粉10. 0g/L，热榨黄豆饼粉5. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达5. lmg/L。实施例8发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼 粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaH2PO4 2. Og/L, pH7. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达6. 4mg/L。实施例9发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 5. Og/L, pH8. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达7. 2mg/L。实施例10发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH5. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达5. 0mg/L。实施例11发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH8. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达8. 3mg/L。实施例12将按实施例11中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，于37°C发酵120h，其他条件同实施例11。经HPLC测定，骨化三醇的产量达I. 7mg/L。实施例13将按实施例11中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，于30°C发酵120h，其他条件同实施例11。经HPLC测定，骨化三醇的产量达8. 5mg/L。实施例14将按实施例11中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25°C发酵120h，其他条件同实施例11。经HPLC测定，骨化三醇的产量达4. 2mg/L。实施例15在将种子液接种于发酵培养基后24h，添加200uL维生素D3(2%，m/v)和2mL3 -环糊精(2%，m/v)，其他条件同实施例13。经HPLC测定，骨化三醇的产量达9. Omg/L。实施例16
在将种子液接种于发酵培养基后72h，添加200uL维生素D3乙醇液(2%，m/v)和2mLP-环糊精(2 %，m/v)，其他条件同实施例13。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. 4mg/L0实施例17发酵培养基组成葡萄糖5. Og/L，冷榨黄豆饼粉50. Og/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. 8mg/L。实施例18发酵培养基组成麦芽糊精80. Og/L，棉籽饼粉50. Og/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. 9mg/L。实施例19发酵培养基组成可溶性淀粉10. 0g/L,冷榨黄豆饼粉50. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. lmg/L。实施例20发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. lmg/L.实施例21发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，棉籽饼粉5. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 0mg/L。实施例22发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L,麦芽糊精30. 0g/L,冷榨黄豆饼粉50. 0g/L,pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 2mg/L。实施例23发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，酵母浸膏80. 0g/L，pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达2. 9mg/L。实施例24发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L,可溶性淀粉60. 0g/L,冷榨黄豆饼粉40. 0g/L,酵母浸膏 5. Og/L, pH7. O0将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 6mg/L。实施例25发酵培养基组成葡萄糖5. Og/L，麦芽糊精60. Og/L，棉籽饼粉2. Og/L，酵母浸膏10. Og/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 4mg/L。实施例26发酵培养基组成葡萄糖20. 0g/L，可溶性淀粉5. 0g/L，酵母浸粉10. 0g/L，棉籽饼 粉 40. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达4. 0mg/L。实施例27发酵培养基组成葡萄糖20. 0g/L,可溶性淀粉5. 0g/L,冷榨黄豆饼粉20. 0g/L,棉籽饼粉 20. 0g/L，pH7.0。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达4. 3mg/L。实施例28发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精60. 0g/L，可溶性淀粉10. 0g/L，大豆蛋白胨20. 0g/L,棉籽饼粉10. 0g/L,酵母浸粉I. 0g/L,冷榨黄豆饼粉5. 0g/L,热榨黄豆饼粉
10.0g/L, NaCl I. 0g/L，pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 2mg/L。实施例29发酵培养基组成葡萄糖20. 0g/L，麦芽糊精10. 0g/L，可溶性淀粉10. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，棉籽饼粉20. 0g/L，酵母浸粉10. 0g/L，冷榨黄豆饼粉10. 0g/L，热榨黄豆饼粉 30. 0g/L, NaCl I. 0g/L，pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达6. 3mg/L。实施例30发酵培养基组成葡萄糖5. 0g/L，麦芽糊精10. 0g/L，可溶性淀粉60. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，棉籽饼粉2. 0g/L，酵母浸膏5. 0g/L，冷榨黄豆饼粉40. 0g/L,热榨黄豆饼粉 5. 0g/L, Na2HPO4 2. 0g/L, pH7. O。将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. lmg/L。实施例31将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，在将种子液接种于发酵培养基后的0h，添加200uL维生素D3(2%，m/v)。其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达0. 6mg/L。实施例32发酵培养基组成葡萄糖5. Og/L，麦芽糊精30. Og/L，大豆蛋白胨5. Og/L，棉籽饼粉10. Og/L,酵母浸粉5. Og/L,冷榨黄豆饼粉10. 0g/L,热榨黄豆饼粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH8. 50将按实施例I中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于上述发酵培养基中，其他条件皆同实施例I。经HPLC测定，骨化三醇的产量达5. 5mg/L。实施例33将按实施例11中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中， 于40°C发酵120h，其他条件同实施例11。经HPLC测定，骨化三醇的产量达I. 0mg/L。实施例34将按实施例11中的方法制得的种子液以10% (v/v)接种量接种于发酵培养基中，于20°C发酵120h，其他条件同实施例11。经HPLC测定，骨化三醇的产量达3. 0mg/L。实施例35 在将种子液接种于发酵培养基后48h，添加200uL维生素D3乙醇液(2%，m/v)和2mL ^ -环糊精(2%，m/v)，其他条件同实施例13。经HPLC测定，骨化三醇的产量达6. Omg/L0对比实施例I按专利EP 91305415. I所述方法，取一株自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica) ATCC13181斜面，使用接种环接种于摇瓶BG培养基，装液量为100ml/500ml，230rpm的旋转式摇床28°C培养48h，得种子液。种子液以8% (v/v)接种量接种于装液量为50mL/500mL的TM-I培养基中，于28°C进行发酵120h。在此过程中，在将种子液接种于发酵培养基后48h后，加入0. 5mL的维生素D3乙醇液(2%，m/v)和ImL的P -环糊精(5%，m/v)。骨化三醇产量为2. 7mg/L。BG 培养基为葡萄糖 15g/L、蛋白胨 15g/L、玉米浆粉 5g/L、NaCl 5g/L、CaC032g/L,pH7. 0。TM-I培养基为葡萄糖20g/L、脱脂豆粉10g/L、蛋白胨5g/L、玉米浆粉5g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl 4g/L、KH2PO4O. 4g/L, pH7. 0。由对比实施例I可见，采用TM-I培养基需要在投入0. 5ml (500uL)的情况下，才
能产生与本发明培养基相当的产量，由此证明本发明的培养基能够明显提高骨化三醇的产量。对比实施例2按照对比实施例I的方法制得的种子液以8% (v/v)接种量接种于装液量为50mL/500mL的TM-I培养基中，于28°C发酵120h，在此过程中，在将种子液接种于发酵培养基后0h，加入0. 5mL的维生素D3乙醇液(2%，m/v)。其他条件皆同实施例31。骨化三醇产量为 0. lmg/Lo
权利要求
1.一种生产骨化三醇的发酵培养基，包括碳源和氮源，其中，按所述发酵培养基的总体积计，所述碳源的含量为5-80g/L ;所述氮源的含量为2-80g/L ;所述碳源选自葡萄糖、麦芽糊精和可溶性淀粉中的一种或多种，所述氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一种或多种。
2.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于所述碳源的含量为10-60g/L，较佳地为25-40g/L ;所述氮源的含量为5-50g/L，较佳地为25_40g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
3.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于所述碳源为葡萄糖和组分A的混合物；其中组分A为麦芽糊精和/或可溶性淀粉，较佳地为麦芽糊精； 其中，所述葡萄糖的含量较佳地为5-20g/L ;组分A的含量较佳地为5-70g/L，更佳地为5-40g/L ;组分A中，所述麦芽糊精的含量较佳地为10-60g/L，更佳地为20_40g/L ;所述可溶性淀粉的含量较佳地为5-60g/L，更佳地为20-40g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
4.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于所述黄豆饼粉为热榨黄豆饼粉和/或冷榨黄豆饼粉；所述蛋白胨为大豆蛋白胨和/或胰蛋白胨；所述热榨黄豆饼粉的含量较佳地为5-30g/L ;所述冷榨黄豆饼粉的含量较佳地为5-50g/L，更佳地为5_30g/L ;所述棉籽饼粉的含量较佳地为l_50g/L，更佳地为2-20g/L ;所述大豆蛋白胨或所述胰蛋白胨的含量较佳地为l_20g/L ;所述酵母浸粉的含量较佳地为l-10g/L，所述酵母浸膏的含量较佳地为l-10g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
5.如权利要求I或4所述的发酵培养基，其特征在于所述氮源为由组分B和组分C组成的混合物；组分B选自所述黄豆饼粉、所述棉籽饼粉和所述蛋白胨中的至少一种，较佳地为所述黄豆饼粉和/或所述棉籽饼粉，更佳地为所述黄豆饼粉和/或所述棉籽饼粉，以及所述蛋白胨；所述组分C为酵母浸粉和/或酵母浸膏； 其中，所述组分B的含量较佳地为2-65g/L，更佳地为20-40g/L ;此时组分B中，所述黄豆饼粉的含量更佳地为5-50g/L，最佳地为15-40g/L ;所述棉籽饼粉的含量更佳地为l-50g/L，最佳地为2-20g/L ;所述蛋白胨的含量更佳地为2-20g/L ;所述组分C的含量较佳地为5-10g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
6.如权利要求1-5中任一项所述的发酵培养基，其特征在于其还包括消泡剂和/或矿物质；所述矿物质较佳地为渗透压调节剂和/或PH调节剂，所述渗透压调节剂较佳地为NaCUNa2HPO4和NaH2PO4中的一种或多种，所述pH调节剂较佳地为CaCO3 ;所述矿物质的含量按发酵培养基的总体积计较佳地为I. 0-5. Og/L。
7.如权利要求1、3、5或6所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基包括碳源和氮源，其中所述碳源为5_20g/L葡萄糖以及5-40g/L所述组分A ;组分A中所述麦芽糊精的含量较佳地为20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量较佳地为20-40g/L ;所述氮源为20-40g/L所述组分B以及5-10g/L所述组分C ;所述组分B中所述黄豆饼粉的含量较佳地为15-40g/L ;所述棉籽饼粉的含量较佳地为2-20g/L ;所述蛋白胨的含量较佳地为2_20g/L ;所述发酵培养基较佳地还包括I. 0-5. Og/L所述矿物质；所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
8.如权利要求I所述的发酵培养基，其特征在于所述的发酵培养基包含所述碳源、所述氮源和所述矿物质，其中所述碳源为葡萄糖5-20g/L、麦芽糊精10-60g/L和可溶性淀粉10-60g/L ;所述氮源为冷榨黄豆饼粉5-40g/L、热榨黄豆饼粉5-30g/L、大豆蛋白胨2-20g/L、棉籽饼粉2-40g/L和酵母浸粉5-10g/L ;所述矿物质包括NaCl I. 0-5. Og/L ;其中，麦芽糊精的含量较佳地为20-40g/L，可溶性淀粉的含量较佳地为20-40g/L，棉籽饼粉的含量较佳地为2-20g/L，大豆蛋白胨的含量较佳地为2-10g/L ;所述含量皆按所述发酵培养基的总体积计。
9.如权利要求1-8中任一项所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基的pH值为 5. 0-8. 5，较佳地为 7. 0-8. O。
10.一种骨化三醇的发酵转化生产方法，其特征在于其包括下述步骤 (a)将自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)的种子液接种于权利要求1-9中任一项所述的发酵培养基中进行液体发酵培养； (b)在所述接种后的0-72小时，向发酵液中添加底物维生素D3； (c)从发酵液中分离出骨化三醇，即可。
11.如权利要求10所述的骨化三醇的发酵转化生产方法，其特征在于在步骤(b)中将￠-环糊精与微生物D3—起添加到所述发酵液中；所述3 -环糊精的添加量较佳地为2-5g/L所述发酵培养基。
12.如权利要求10或11所述的骨化三醇的发酵转化生产方法，其特征在于所述的自养性假诺卡氏菌为自养性假诺卡氏菌ATCC13181 ;在步骤(b)中，所述维生素D3的添加量为50mg/L-250mg/L所述发酵培养基。
13.如权利要求10-12中任一项所述的骨化三醇的发酵转化生产方法，其特征在于在步骤(a)中，所述种子液由ISP2培养基或BG培养基培养制得；种子培养的温度为25-32°C;所述种子液的接种量为体积百分比10% -20% ;所述发酵培养的温度为20-40°C，较佳地为25-370C ;所述发酵培养的时间为4-9天，较佳地为6-7天；在步骤(b)中，向发酵液中添加底物维生素D3的时间为接种后0-48h。
14.如权利要求1-9中任一项所述的发酵培养基在将自养性假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)发酵转化成骨化三醇中的用途,其中所述的自养性假诺卡氏菌较佳地是自养性假诺卡氏菌ATCC13181。
全文摘要
本发明涉及一种生产骨化三醇的发酵培养基以及相应的转化方法和该发酵培养基的用途。该发酵培养基包括碳源和氮源，其中，按所述发酵培养基的总体积计，所述碳源的含量为5-80g/L；所述氮源的含量为2-80g/L；所述碳源选自葡萄糖、麦芽糊精和可溶性淀粉中的一种或多种，所述氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一种或多种。本发明的发酵培养基可以大大提高骨化三醇的转化率，从而提高生产效率，更有利于工业化生产，并且能够大大降低骨化三醇的生产成本。
文档编号C12R1/01GK102732571SQ201110095568
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者王向阳, 赵浩, 陈少欣 申请人:上海医药工业研究院