一种细胞培养基及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种细胞培养基及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、生物技术等领域，具体地说是涉及单克隆抗体、抗体人源化等生物技术及医药技术领域的一种用于抗体培养基及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种单克隆抗体培养基及其制备方法和用途，再具体地说是涉及一种用于抗CD20单克隆抗体(简称抗CD20单抗)培养基及其制备方法和用途。
背景技术：
(一)抗⑶20单克隆抗体的研究概况
1、概述
肿瘤的死亡率在全世界各种疾病的死亡率居榜首，恶性肿瘤已经成为严重影响人类健康和生命的杀手。据不完全统计，在中国，每年有300余万新发恶性肿瘤患者，其中130 万人死于恶性肿瘤。在美国，每年诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤的患者达54. 7万， 用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。资料显示，今后10年抗肿瘤生物技术药物会急剧增加， 2007年美国共有400余种新药在进行抗肿瘤的临床试验，其中生物技术类产品占接近一半，可见，生物技术类抗肿瘤药物在肿瘤的防治中具有十分重要的意义。
非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma,或称非何杰金氏淋巴瘤,简称NHL) 是常见恶性血液病之一，且是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤，是由B淋巴细胞(简称B细胞)恶性增长引起的(B细胞来源约占85%)，好发于青壮年。近年来，NHL发病率和病死率呈逐年上升趋势，严重危害着人类健康。本发明研究的CD20单抗是治疗非何杰金氏淋巴瘤的一线药物，是世界上销售量最大的抗体之一，2010年全 球销售额达到66亿美元。
B淋巴细胞是体液免疫的起点，大部分的造血恶性肿瘤起源于此。因此，由B细胞和其对应恶性肿瘤表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标。MS4A基因家族的B细胞特异成员⑶20在未成熟和成熟B细胞以及其对应的恶性肿瘤表达(Tedder and Engel (1994) Immunol. Today 15:450-454)ο近年来针对多种恶性肿瘤表面细胞表面抗原标志物的靶向性治疗取得巨大进步，应用单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤的临床结果取得重大进展，使得针对CD20的单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤成为发展前景良好的一种新型抗肿瘤方法。
2、CD20
目前抗CD20单克隆抗体是治疗B淋巴瘤的最有效的治疗药物，在治疗NHL中有极其重要的地位。⑶20是一种分子量为33 37kD的磷酸化蛋白质分子，是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面，即B淋巴细胞表面分化抗原，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达。它主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统起重要作用，⑶20从前-B淋巴细胞阶段开始表达，直到浆细胞阶段才无⑶20表达(Stashenko p. , Nsdler LM, Hardy R, et al. Characterization of a human B lymphocyte-specific antigen. J.1mmun. 1980 ；125 :1678_1685)。CD20 和抗 CD20 抗体结合后不发生内吞作用， 因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少，在人体血清中无游离的CD20存在。 ⑶20抗原高表达于超过95%的正常或恶化的B淋巴瘤细胞，没有显著内吞和脱落(PressOff,FarrAG,Borroz KI et al. Endocytosis and Degradation of Monoclonal Antibodies Targeting Human B-Cell Malignancies. Cancer Resl989 ；49 :4906-4912),因此CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。
3、CD20基因的表达与调控
⑶20是B细胞的重要分化抗原，首先在前-B细胞中表达。成熟的B细胞也表达 ⑶20，B细胞激活将产生⑶20的高表达，激活的扁桃体B细胞上的⑶20可以被沉降下来， 而静态的扁桃体B细胞却不能，生发中心B细胞上的CD20分子也表现为高表达。荧光分析证实，处于生长进化的B细胞均为⑶20高表达。B细胞向浆细胞分化时，⑶20的表达为下降趋势，⑶20在浆细胞中不表达。人⑶20基因为单拷贝基因，位于染色体llql2. 13. 1，长 16kb，有8个外显子，其中外显子I含有转录的起始位点，外显子III含有翻译的起始位点， 外显子VmRNA在剪接时会被剪切下来，外显子VIII编码⑶20分子mRNA的3'端非翻译区。 ⑶20分子的mRNA以三种形式存在第一种mRNA长2. 8kb，含有外显子I到外显子VIII的完整序列，这种mRNA为主要存在形式；第二种mR2NA由于外显子I和外显子III的剪接作用而缺少外显子II，所以在长度上比前者短263bp ;第三种mRNA长3. 4kb，可能是外显子I 上游的某一段序列参与了外显子I内部的剪接而产生的，这种形式的mRNA较少。⑶20的表达受到转录因子的调节，PU.1和Pip是最重要的两个转录因子，二者均结合在⑶20的启动子区，只有结合了 Pip和PU.1的启动子才具有启动转录的功能。CD20的启动子没有TATA 框，转录需要一个保守序列——NF2Y结合位点，约占启动子的30%。B细胞分化成为浆细胞时，CD20 和 PU.1 的水平均下降(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。 ⑶20的表达因淋巴瘤细胞的不同而有所差异，例如⑶20在慢性B淋巴白血病细胞中的表达远低于正常的B细胞和其他B淋巴瘤细胞，⑶20的表达高低在一定程度上决定了抗体和补体杀伤瘤细胞的程度(Perz J等，Leuk Lymphoma, 2002，43 (I) : 149-151 )。细胞的生长因子能够调节一些瘤细胞中 CD20 的表达(Golay J 等，Blood, 2001，98(12) : 3383-3389)。IL24、 TNF2 a、GM2CSF上调慢性B淋巴白血病细胞的⑶20的表达，Sivaraman等发现慢性B淋巴白血病细胞与 500u/ml的IFN2 α作用24小时后，细胞表面的⑶20分子明显增加，作用72 小时CD20增加的程度低于24小时，这说明这种刺激作用经历一个峰值后将随着时间的延长而下降。Morikawa等发现，抗⑶5抗体的加入可以使膜⑶20的数量下降，这说明⑶5可能也参与了 CD20 表达的调节(Morikawa K 等，Scand J Im munol, 2002，55 (I) :44-52)。亦有研究表明离子射线也可持续上调CD20的表达。
4、CD20分子的功能
⑶20的生理作用至今尚未阐明，根据⑶20与抗⑶20的抗体结合后B细胞产生的一系列的生物学反应，推测CD20可能参与B细胞的增殖、分化、信号转导和钙离子的跨膜传递。抗CD20的抗体对B细胞增殖的影响因抗体种类而异，抗体IF5可刺激B细胞由GO期进入Gl期，而抗体BI抑制B细胞由Gl期进入S/G2+M期。抗⑶20的抗体还抑制B细胞的分化和EB病毒诱导Ig的分泌。CD20的胞内区与酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为非共价结合，⑶20与抗⑶20结合将激活这些激酶，诱导PLC Y的磷酸化。同时上调C2myc 和B2myb的mRNA水平，增加⑶18、⑶58和MHCII家族蛋白的表达。越来越多的证据表明， CD20是调节B淋巴细胞生命与分化信号转导的重要分子。抗CD20的抗体可直接抑制B细胞生长并诱导其凋亡的发生，该凋亡的发生与钙离子相关。细胞中钙离子浓度低时，细胞沿循细胞周期生长，CD20与抗体交联形成后，在浆膜上形成钙离子通道，细胞内的钙离子浓度增加，抑制B细胞从Gl期进入S/G2+M期，从而引起细胞凋亡的发生(Shan D et al. Cancer I mmu no Im munother, 2000，48 (12) : 73-76)。二级抗体(如羊抗人抗体)或表达 FcRI β 细胞可增强上述B细胞的凋亡的发生，该凋亡与细胞内的钙离子浓度增加和PTK及其底物的磷酸化有着密切关系(Bt ephan M 等，Cancer Res, 2000，60:7170-7176)。实验证明，CD20 与抗CD20抗体及二级抗体的超级结合能够启动并增强PTK信号通路，底物PLC Y的磷酸化程度与CD20的交联程度有密切依赖关系，内质网储存钙的释放使细胞内的钙离子浓度快速增加，同时胱天蛋白酶(caspase)发生活化。对于耐药的B细胞瘤，⑶20与抗⑶20抗体的结合增加活性氧的爆发(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。以上说明CD20分子本身是一个钙泵，CD20的激活是调节内源性钙离子变化的又一个影响因素， 并通过钙离子变化直接调节钙离子通道活性。
5、抗⑶20单克隆抗体研究进展
多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20 (Anderson等，Blood, 198463 :1424)。 基于抗⑶20嵌合体或放射标记单克隆抗体的疗法已经用于非霍奇金淋巴瘤(Press 等，Hematology，2001，221-240 ;Kaminski 等，N. Engl. J. Med. 1993329:459-465)。 临床研究表明抗CD20单克隆抗体治疗hia改善类风湿性该关节炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其他免疫介导的疾病临床表现(Sliverman等，Arthritis Rheum. , 2002, 48:1484-1492;Enwards 等，Rheumatology,2001, 40:1-7)。
应用竞争性假设解释抗⑶20单克隆抗体的体内(in vivo)治疗效果。在一个模型中，⑶20作为膜整合的靶标用于通过天然免疫系统的活化或效应子机制的启动产生单克隆抗体介导的 B 细胞消除(Reff 等,Blood, 1994, 83:435-445;Maloney 等 Blo od, 1998,90 2188-2195;Maloney 等，J. Clin. Oncol. 1997，15:3266-3274)。
目前，经FDA批准上市用于治疗NHL的抗CD20的单抗有Rituximab、Zevalin, Bexxar等，Rituximab (利妥昔单抗，商品名美罗华；后简称美罗华)是第一个是上市的抗 CD20的单克隆抗体类药物，是一种嵌合体人IgGl抗人CD20单克隆抗体，能高效诱导补体 (C)激活的经典途径和对新鲜分离的淋巴瘤细胞和B细胞系的补体依赖的细胞毒性(RefT 等，Blood, 1994，83 :435-445 ；Golay 等，Blood, 98 :3383-3389 ；Cragg 等 Blood, 2003，101 1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003, 171:1581-1587;Bellosillo 等，Blood, 2001, 98:2771-2777)。美罗华还在病人(van der Klok 等，Br. J. Hematol. 2001，115:807-811) 和灵长类(Kennedy等，Blood，2003，101 :1071-1079)体内激活补体。此外，包括CD59在内的补体调解蛋白的肿瘤细胞中的表达和抗⑶20治疗的抗性相关(Golay等，Blood, 98 3383-3389 ;Treon 等 J.1mmunotheraphy，200124:263-271 )。虽然许多人认为补体依赖的细胞毒性是美罗华在体外(i η V i tr ο )和体内消除人淋巴瘤细胞中所使用的主要用途(Go I ay 等，Blood，98 :3383-3389 ;Cragg 等 Blood，2003，101 :1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003，171:1581-1587;Golay 等，Blood,95 :3900-3908 ；Di Gaetano 等 J. Hematol. 2001，11 4:800-809;Weiner Blood2003,101 :788)，但是其他人发现，根据肿瘤细胞对补体介导裂解的易感性以及补体抑制剂CD46、CD55和CD59在肿瘤细胞上的表达不能预测美罗华的治疗效果(Weng和Levy，Blood，2001，98 :1352_1357)。因为与临床使用的同种型不同的嵌合体抗CD20单克隆抗体不能在非人或灵长类中消除正常的B细胞(Anderson等,Biochem. Soc.Transac.，1997，25 =705-708),并且抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤效应部分地依赖通过IgG 的Fe受体(Fe Y R)的免疫激活(Clynes等,Nature Med. ,2000,6 :443-446),所以其他的抗体依赖作用也是重要的。此外，抗⑶20单克隆抗体处理改变了跨膜Ca2+转运和B细胞功能，这些扰乱了细胞周期进程(Tedder和Engel, Immunol. Today, 1994, 15:450-454)并且能够诱导B细胞的程序性细胞死亡(Shan等，Blood, 1998，91 :1644_1652)。
单独使用美罗华治疗复发以及难治的非霍奇金淋巴瘤有效率达50%左右，若与化疗药物联用，则有效率可达909^100%。同时，美罗华会带来一系列的不良反应，诸如脱发、 恶心、呕吐、血细胞减少等，且有轻微的发热、寒颤等。但美罗华仍由其在治疗非霍奇金淋巴瘤上表现的良好疗效和低毒副作用，已成为美国销售额最大的抗肿瘤药物之一，2008年销售额近30亿，年增长率14%。
但这些药物治疗费用较高，致使中国很多患者难以接受治疗。因此，研究疗效好、 治疗成本低的药物对提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活质量具有重大意义。此外，研发对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的抗CD20单克隆抗体或多克隆抗体， 更成为目前的研究重点。
(二)真核细胞基因表达系统
自20世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。 其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点如通常使用的表达系统无法 对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是
a)根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；
b)能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；
c)能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1、酵母表达系统
最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因-1 (简称A0xl)，在该基因的启动子(简称PAX0I)作用下，外源基因得以表达。PAXOI 是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOxl基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E. coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E. coli复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E. coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。
利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(简称GAP)启动子代替PAX0I，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。
2、昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(简称=AcNPV)作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要4 6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来，与目的蛋白混在一起，从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-Ι基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等(Farrel等， Biotech, and Bioeng. ,1998,60 (6) :656-663)介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列(l)Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子； (2)Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie_l (编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子)；(3) BmNPV的同源重复序列3 (HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及Bni’ qP发展而来。
一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70 (热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。
最近，人们又构建了杆状病毒-S2表达系统，该系统能将重组杆状病毒转染果蝇 S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如sf9、sf21)中复制，不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全， 表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。
3、哺乳动物细胞表达系统
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸·钙共沉淀法及DEAE —葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时插入几种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入IaxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre 介导两个IaxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为发明人提供了很好的途径。利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差； 当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。
为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(简称fIA)的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达(Gossen 等，Science, 1995，268 (5218) :1766-1769 ；Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1992,89(12):5547-5551)。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。
外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等(Mielke等，Gene, 2000,254 (1-2) :1_8)构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统， 在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。 内部的顺反子通过内核糖体进入位点(简称=IREs)介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。
哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。
利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统(Mielke等，Gene，2000，254 (1_2):1_8)。Vander Geld等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶(简称PR30)，并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位(Vander Geld 等，J.1mmunol. Meth.，2000，244 (1-2) :117_132)。
哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。因此，研发一种表达量更高，操作简便的哺乳细胞表达系统，具有巨大的应用空间；并且可以提供成本更低的基因工程类药物，具有巨大的社会意义和经济价值。
(三)哺乳动物细胞无血清培养基
1、细胞培养基概述及优缺点分析
细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。
常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物， 其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。所以常规血清细胞培养基存在以下缺点
(I)血清来自于动物体，其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用，但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子，所以存在潜在毒性。、
(2)由于动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵。
(3)动物血清提取的局限，也给细胞培养的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒性作用，给规模化培养细胞增加了难度(Even M S，Sandusky C B, Barnard N D. Serum free hydridoma culture : ethical, scientific and safety considerations[J] . Trendsin Biotechnology,2006, 24(3):105-108.)。
由于上述常规血清细胞培养基存在的诸多问题，促使发 明人改进培养方法，用无血清细胞培养基来替代。细胞工程中无血清培养技术的应用，在很大程度上可以避免含血清培养所带来的不利。无血清培养基具有以下明显的优缺点
无血清培养基的优点
①可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
②避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
③避免血清组分对实验研究的影响。
④有利于体外培养细胞的分化。
⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
缺点
①细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
②成本较高。
③针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。
2、无血清培养基的发展概述
从1975年垂体细胞株Gh3在无血清介质中生长获得成功到现在，无血清培养基的发展大致经历了 3代。
第I代无血清培养基不含血清，但含有大量成分不明确的动、植物蛋白。因此，其不利于目标蛋白的分离纯化，成本也较高。
第2代无血清培养基是基于生产重组药物的安全考虑而开发的，其主要特点是完全不用动物来源蛋白，称之为无血清，无动物衍生蛋白培养基。它的优点是既可降低生产成本，又能加快报批的速度。
由于生物工程的要求，第3代无血清培养基近年已出现，即完全没有蛋白或含量极低，组成成分全为化学已知物的培养基，称之为双无培养基。其优点在于细胞培养与生产很容易做到恒定，目标蛋白的分离纯化更为容易，细胞培养基的原材料成本大为下降，生产中品质管理更加容易。但其对培养的细胞具有很高的特异性。
目前预测第4代无血清培养基将会进入研究与开发，这将是一种无血清、无蛋白、 又可以高温消毒的适合于许多种不同细胞生长的全能型培养基。小结可见表I (陈峰，无血清培养基的主要补充印子及研究进展[J].海峡药学，2006，18 (4):10-13)。
由上可知，第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势。
表1、无血清培养基的发展过程
权利要求
1.一种细胞培养基，其特征在于，所述的该培养基是无血清无蛋白培养基，由基础培养基和补充因子构成；所述的补充因子由无机盐类、氨基酸、维生素、其他物质组成，其含量分别为 O. ΟΟΓΟ. 9%、0· ΟΟΓΟ. 035%,O. ΟΟΓΟ. 06%,O. 00Γ0. 4%。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的无机盐类是包括无水氯化钙、七水硫酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或七水硫酸锌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、 L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的维生素是包括硫辛酸、维生素H、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i_肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺或维生素B12中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的其他物质是包括D-葡萄糖、 次黄嘌呤、酚红或胸苷等中的一种或多种。
6.根据权利要求1至5任一项所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该无血清无蛋白培养基的制造流程为(1)称取所有成分；(2)溶解于10升纯水中，搅拌溶解；(3)无菌过滤，即为成品无血清无蛋白培养基。
7.根据权利要求1至5任一项所述的细胞培养基作为培养CHO细胞的培养基的应用。
8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其特征在于，所述的无血清培养基培养CHO细胞的具体步骤包括(1)在本发明所述的无血清培养基中接种CHO细胞；(2)在适合生长的条件下培养CHO细胞一段时间，即得所述的CHO细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞培养基，其特征在于，所述的适合生长的条件是 37±2°C, 5± 1% 二氧化碳,所述的一段时间是1-3周。
10.根据权利要求8所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该CHO细胞用于制备抗 CD20单克隆抗体，其制备方法包括如下步骤(O构建一个独特的PMED高效哺乳动物细胞基因表达系统；(2)建立一个悬浮细胞、无血清培养驯化体系，通过转染将⑶20单抗基因整合到CHO 细胞的基因组中，通过逐步增加MTX的浓度使整合在细胞内的目的蛋白基因拷贝数大量扩增，筛选CHO细胞亚克隆，获得高表达工程细胞株，并建立三级种子细胞库；(3)建立适合哺乳动物细胞悬浮培养的无血清培养基，使用该无血清CD培养基培养 CHO工程细胞株；(4)建立哺乳动物细胞大规模培养及蛋白纯化体系，利用哺乳动物细胞大规模发酵及纯化平台，获得外源蛋白的大规模表达。
11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述的该抗CD20单克隆抗体的有关测定情况如下(1)N端氨基酸序列测定测序结果为 Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，该结果与文献报道的美罗华一致；(2)C端搭配序列测定测序结果为 Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His,该结果与文献报道的美罗华一致；(3)肽图分析肽谱与对照品美罗华一致；(4)分子量测定测得的分子量还原型介于6317KD，非还原型约为150KD，与对照品及文献报道的美罗华一致；(5)等电点测定测得的等电点分布在4. 8±0. 5内，与对照品及文献报道的美罗华一致。
12.根据权利要求10所述的细胞培养基，其特征在于，所述的CHO工程细胞株是中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44。
全文摘要
本发明涉及一种用于抗CD20单抗培养基及其制备方法和用途。该培养基是一种无血清无蛋白培养基，由基础培养基和补充因子构成，补充因子由无机盐类、氨基酸、维生素、其他物质组成。该培养基上清用于培养基因工程CHO细胞，用于制备价格昂贵的蛋白质药物如抗CD20单抗、促红细胞生成素、干扰素等。该培养基具有成本低、细胞培养密度大(可达9x106/L)、活力高、蛋白高表达(可达到3g/L)及易纯化等优势。本发明避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响，同时可以降低细胞培养液的成本，提高生物制品成品率和利润率，适于医药、生物技术领域等工业和行业的大规模生产和商业应用，应用前景良好，具有显著的社会效益、经济效益。
文档编号C12N5/00GK102994441SQ20121035281
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者宋华, 白文, 肖钟熙 申请人:上海瀚康生物医药科技有限公司