专利名称：分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及ー种分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
分枝杆菌属(Mycobacterium)是ー类细长略带弯曲的杆菌,有分枝生长的趋势，因而得名。本菌属种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。结核分枝杆菌(M. tuberculosis),俗称结核杆菌或結核菌,是引起结核病的病原菌。结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛 存在于土壤、环境、动物中。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺結核患者451万，菌阳肺結核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86. 4%，牛结核分枝杆菌占2. 5%，非结核分枝杆菌占11. 1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4. 9%，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费吋，需I 2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌属的快速鉴定对结核病及非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。传统分枝杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在ー些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步,现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的分枝杆菌属检测试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现ー种分枝杆菌属检测试剂盒，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外弓丨物F3/B3，所述的两对弓I物为外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3:(SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC内引物FIP: (SEQ ID NO 3)
GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP: (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；或外引物F3’ (SEQ ID NO 5)AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ (SEQ ID NO 6)AGGACCGCCTCCTGAC内引物FIP’ (SEQ ID NO 7)GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA内引物BIP’ (SEQ ID NO 8)GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT ；或外引物F3” (SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3，，(SEQ ID NO 9)AGCGGCAGCAGRTCCT内引物FIP”(SEQ ID NO 10)CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP” (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；其中，V代表 A/C/G，R 代表 A/G。本发明针对分枝杆菌属的hsp65基因设计引物，所述hsp65基因为65kDa热休克蛋白(heat shock protein)基因，由于该基因高度保守并广泛存在于各分枝杆菌属菌种中，因此其引物能够扩增并检测出结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌所有菌种，包括结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、牛分枝杆菌(M. bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、龟分枝杆菌(M. chelonae)、偶发分枝杆菌(M. fortuitum)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、海分枝杆菌(M. marinum)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)、土分枝杆菌(M. terrae)、鸟分枝杆菌(M. avium)、草分枝杆菌(M. phlei )、瘰病分枝杆菌(M. scrofulaceum)、胺肿分枝杆菌(Μ· abscessus)、溃瘍分枝杆菌(Μ· ulcerans)、施氏分枝杆菌(M. shimoidei)、亚洲分枝杆菌(M. asiaticum)、蟾蜍分枝杆菌(M. xenopi)、胃分枝杆菌(M. gastri)。作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的优选实施方式，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的更优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶酶浓度4-10U/ μ L ；所述的反应液含I.6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L(NH4)2S04、8 10mmol/L MgS04、0. I 0· 125 体积％ TritonX-100、0. 8 lmol/L甜菜碱；所述的样品预处理液含10 20mmol/L pH 8· O 的 Tris-HCl、I 2mmol/LEDTA和 I I. 2 体积 %Triton X-100 ;所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为BCG基因组DNA ；所述的内引物FIP/BIP各为0. 2 0. 25 μ mol/L，外引物F3/B3的浓度各为I. 2
2.O μ mol/し作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的最优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶酶浓度8U/ μ L ;所述的反应液含2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-HCl ,12. 5mmol/L KCl,12. 5mmol/L (NH4) 2S04、lOmmol/L MgS04、0. 125 体积％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；所述的样品预处理液含20mmol/LpH 8. O 的 Tris-HCl、2mmol/L EDTA 和 I. 2 体积 %Triton X-I00 ;所述的显色液为SYBR Green I ；所述的内引物FIP/BIP的浓度为0. 2 μ mol/L ；所述的外引物F3/B3的浓度为I. 6 μ mol/L。作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的优选实施方式，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。环介导恒温扩增技术(LAMP)是ー种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效率超強，表现在两个方面(I)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μ g，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极其容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。本发明还提供一种分枝杆菌属检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤(I)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；( 2)将步骤(I)的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA;(3)在反应容器中加入Bst DNA聚合酶O. 9 I. 8体积份数、反应液38 40体积份数、稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。作为本发明使用分枝杆菌属检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplication of DNA,简称LAMP)快速检测分枝杆菌属的方法，是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是ー种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技木)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技木，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技木。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初歩鉴定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小吋。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需ー个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到I小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的hsp65基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测分枝杆菌属的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列缩略语适用于本发明LAMP loop-mediated isothermal amplification,环介导恒温扩增 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三憐酸Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)EDTA ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸Betaine :甜菜碱Triton X-100 :聚乙二醇辛基苯基醚hsp65 :65kDa 热休克蛋白BCG :卡介苗实施例I试剂盒的制备(I)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3 (SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC内引物FIP: (SEQ ID NO 3)GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP:(SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG(V 代表 A/C/G)(2)购置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；(3)配制反应液和引物反应液含有 2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris_Cl、12. 5mmol/L KCl、12. 5mmol/L (NH4)2S04、lOmmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱、内引物FIP/BIP各0. 2 ii mol/L和外引物F3/B3各0. 25 y mol/L,置于容器；(4)配制样品预处理液样品预处理液含有20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、2mmol/L EDTA 和 I. 2 体积 %Triton X-100,置于容器；(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；(6)购置显色液SYBR Green I，置于容器；(7)提取阳性对照提取BCG基因组DNA，置于容器；(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下I、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将上述(2) (4)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备(I)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC 外引物B3 (SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC内引物FIP: (SEQ ID NO 3)GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP: (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG(V 代表 A/C/G)(2)购置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；(3)配制反应液和引物反应液含有 I. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-ClUOmmol/L KClUOmmol/L (NH4) 2S04、8mmol/L MgS04、0. I 体积 ％ TritonX_100、0. 8mol/L 甜菜碱、内引物FIP/BIP各0. 2 ii mol/L和外引物F3/B3各0. 25 y mol/L,置于容器；(4)配制样品预处理液样品预处理液含有10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、lmmol/L EDTA 和 I. 0 体积 %Triton X-100,置于容器；(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；(6)购置显色液EVA Green I,置于容器；(7)提取阳性对照提取BCG基因组DNA，置于容器；(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。其他同实施例I。实施例3试剂盒的制备其他条件与实施例I相同，其不同仅在于步骤(I)中的引物为外引物F3’ (SEQ ID NO 5)AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ (SEQ ID NO 6)AGGACCGCCTCCTGAC内引物FIP’ (SEQ ID NO 7)GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA内引物BIP’ (SEQ ID NO 8)GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT实施例4试剂盒的制备其他条件与实施例I相同，其不同仅在于步骤(I)中的引物为
外引物F3”(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3”(SEQ ID NO 9)AGCGGCAGCAGRTCCT内引物FIP”(SEQ ID NO 10)CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP”(SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG (V 代表 A/C/G，R 代表 A/G)实施例5分枝杆菌属检测试剂盒的应用一、方法和材料I、菌株本发明采用菌株有29株，主要来源于美国标准生物品收藏中心、中国药品生物制品检定所。详见表I。表I菌株名称及来源
权利要求
1.一种分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的两对引物为 外引物F3 TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3 CGGCTCCGATGACCTTCTC内引物FIP GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ； 或 外引物F3’ AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ AGGACCGCCTCCTGAC内引物FIP’ GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA内引物BIP’ GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT ； 或 外引物F3”TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3”:AGCGGCAGCAGRTCCT内引物FIP”CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC内引物BIP”AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ； 其中，V代表A/C/G，R代表A/G。
2.根据权利要求I所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
3.根据权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶浓度4-10U/ u L ； 所述的反应液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/LKCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2S04、8 lOmmol/L MgS04、0. I 0. 125 体积％ TritonX-100、0.8 lmol/L甜菜碱； 所述的样品预处理液含10 20mmol/L pH 8. 0的Tris_HCl、l 2mmol/LEDTA和I 1.2 体积 %Triton X-100 ;所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油； 所述的阳性对照为BCG基因组DNA ； 所述的内引物FIP/BIP各为0. 2 0. 25 ii mol/L,外引物F3/B3的浓度各为I. 2 2.0 u mol/L。
4.根据权利要求3所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶浓度8U/ ii L ; 所述的反应液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L(NH4) 2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱； 所述的样品预处理液含20mmol/L pH 8. 0的Tris_HCl、2mmol/L EDTA和I. 2体积 %Triton X-I00 ; 所述的显色液为SYBR Green I ； 所述的内引物FIP/BIP的浓度各为0. 2 u mol/L ； 所述的外引物F3/B3的浓度各为I. 6 ii mol/L。
5.根据权利要求2、3或4所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
6.根据权利要求5所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。
7.一种使用如权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀； (2)将步骤(I)的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA ； (3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 I. 8体积份数、反应液38 40体积份数、稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应； (4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性； 所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
8.根据权利要求7所述的使用分枝杆菌属检测试剂盒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种分枝杆菌属检测试剂盒，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的分枝杆菌属检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
文档编号C12Q1/68GK102827944SQ201210352230
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者曹以诚, 茅莉娜, 陈振柳, 杜正平, 王静, 吕冰凌 申请人:广州华峰生物科技有限公司