Imb-ny类化合物在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用

Imb-ny类化合物在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种IMB?NY类化合物在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用，所述IMB?NY类化合物包括IMB?NY1和IMB?NY2，本发明还公开了一种含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法以及一种用于MTB IspD抑制剂表达的ZYM?5052液体培养基；本发明联合应用高通量表型筛选模型和结核分枝杆菌Rv3582c酶抑制剂筛选模型，从70000多个不同来源的化合物中筛选得到酶抑制剂IMB?NY1和IMB?NY2；通过对IMB?NY1和IMB?NY2的抗结核活性评价，确认该化合物具有明确的抗结核杆分枝菌活性。
【专利说明】
IMB-NY类化合物在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于化学药物和药物筛选领域，具体地说，设及一种IMB-NY类化合物在制 备抗结核分枝杆菌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 结核病（TB，Tuberculosis)是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB)感染引起的慢性传染性疾病，目前仍然是威胁到人类生命健康的主要传染病之一。最 新世界卫生组织统计结果表明，目前全球约有Ξ分之一的人口患有结核病，其中每年新增 病例超过880万，死亡140万，成为与AIDS、追疾并称的Ξ大传染病，而我国是全球22个TB高 负担国家之一，表现在:第一，结核杆菌感染者超过5.5亿人，患者人数位居全球第二;第二， 耐药问题非常严重，多药耐药率已经超过了 WHO规定的警戒线;第Ξ，艾滋病患者增长速度 快，可能导致HIV与结核双流行;第四，中国流动人口大，也势必扩大了运一传染性疾病的感 染率。尤其是目前耐药菌W及结核病同艾滋病共感染现象的增加，使结核病成为临床治疗 的棘手问题。目前，结核杆菌的耐药谱和耐药水平不断增加，然而目前研究的现状是，近60 年来都没有全新作用机制和全新骨架结构的抗结核药物问世，而且卡介苗的保护率在发达 国家也不到50%，在中国成年人中的保护率远远达不到发达国家的水平。因此，研制高效、 低毒的新型抗结核药物来解决结核病的威胁是目前众多课题组的主要目标。
[0003] 自青霉素出现W来，研究人员就发现细胞壁对于细菌的生长繁殖至关重要。由于 细胞壁的结构比较复杂，并且是细菌是从头合成的，导致在细胞壁各成分的合成与组装过 程中有众多的酶系参与，而且其中多数的酶是人体内所不存在的。因此，细胞壁合成过程中 存在着诸多新型，并且具有较好的选择毒性潜在抗菌药物祀点。在MTB中亦为为如此。
[0004] 近几年的研究结果表明：MTB的2-甲基-赤薛糖醇憐酸（methylerythritol phos地ate, MEP)途径的功能是合成类异戊二締的前体物质异戊酷焦憐酸或二甲締丙基焦 憐酸。该途径在哺乳动物和植物胞浆中被完全不同的甲径戊酸(MVA)途径替代。加之MEP途 径合成的类异戊二締及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，因此MEP途径已成 为药祀研究的热点。该途径对于MTB也是至关重要的，MTB的MEP途径共包含8个酶参与，其中 Rv3582c编码该途径中的关键酶 ispD(2-C-methyl-D-er}fth;ri to 1-4-phosphate 切tidy lhansf erase，2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸胞喀晚转移酶）为运一途径中的关键 基因，基因的表达产物可催化MEP和CTP(Ξ憐酸胞巧)合成CDP-ME(如图1所示）。目前尚没有 IspD抑制剂在筛选抗结核药物的报道，通过筛选MTB的IspD抑制剂有可能发现全新作用机 制的抗结核药物。

【发明内容】

[0005] 有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种IMB-NY类化合物在制备抗结核分枝 杆菌药物中的应用，本发明联合应用高通量表型筛选模型和结核分枝杆菌RV3582C酶抑制 剂筛选模型，从70000多个不同来源的化合物中筛选得到酶抑制剂IMB-NY巧日IMB-NY2;通过 对IMB-NYl和IMB-NY2的抗结核活性评价，确认该化合物具有明确的抗结核杆分枝菌活性。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种IMB-NY类化合物在制备抗结核分枝杆 菌药物中的应用，IMB-NY类化合物包括IMB-NY1和IMB-NY2，所述IMB-NY1的化学式如（I)所 示：
[0010] 本发明还公开了一种含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，包括W下步 骤：
[0011] 1)菌种种子液的准备；
[0012] 2)阳性化合物样品的初筛；
[0013] 3)阳性化合物样品的复筛；
[0014] 4)验证阳性化合物对CG的MIC，确定MTB IspD抑制剂。
[0015] 进一步地，步骤1)中的菌种种子液的准备具体为:在已倒好的固体平板BHI培养基 上划线接种CG，复苏并培养新鲜的CG，培养条件37°C，倒置培养12h，然后挑取单菌落接种到 20血液体册I培养基中37 °C，200巧m过夜培养;后测定600皿处可见波长下的光吸收(0D600) 为4.0~5.5;将菌液用液体BHI培养基稀释至0D600 = 3.0，分装到1.5mL的无菌离屯、管中，每 支lmL，4°C保存10管。
[0016] 进一步地，步骤2)中的阳性化合物样品的初筛具体为：W〇.3%的接菌量将CG接入 预先计算好的培养基中对化合物库中化合物进行筛选，除空白对照外的每孔用8通道移液 器加19祉L菌液，通过观察该模式菌的生长情况，筛选阳性样品；将化合物库的化合物进行 100倍稀释，至终浓度为20yg/mL，在该浓度下肉眼观察其结果为浑浊则是不能抑制CG生长 的样品，判定为初筛阴性样品；在该浓度下肉眼观察其结果为澄清则是能够抑制该菌生长 的样品，判定为初筛阳性样品。
[0017] 进一步地，步骤3)中的阳性化合物样品的复筛具体为：
[0018] (1)准备好要用于初筛得到的阳性化合物、CG菌种（同初筛中菌种种子液的准备）、 无菌的96孔板、8通道移液器、V型槽和无菌的8通道移液器枪头；
[0019] (2)将96孔板、8通道移液器、V型槽放于超净台中紫外照射15min，后通风3~5min;
[0020] (3)取初筛阳性化合物化L加入96孔板中，取两份编号1、2，分别加入19祉LWO. 3% 的接菌量的CG的BH巧邮HIS-I的稀释菌液于已准备好的有初筛阳性化合物的96孔板中；
[0021] (4)96孔板具体为:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔为乙胺下醇阳 性药物对照;每板的左面第一列中设置4孔空白对照和4孔生长对照，其中，空白对照组不加 菌，生长对照组不加药物，在96孔板种剩余的84孔样品的化合物终浓度为20yg/mL，反应体 系总体积为20化レ在BHI和BHIS-I两种方法上做法相同；
[0022] (5)将所有加好样的96孔板至于37°C恒溫培养箱中培养12~16h，用酶标仪测定可 见光波长600nm处的吸收；
[0023] 按照公式（1)计算BHI或者BHIS-I培养基中样品对于CG生长的抑制率；
[0024] (1)
[00巧]其中指的是CG菌正常生长对照组所有孔600nm下的吸收值的平均值;玄指的是 无 CG菌生长的培养基空白对照组所有孔600nm下的吸收值的平均值;巧旨的是加入化合物后 影响CG菌生长的试验测试孔600nm下的吸收值；
[0026] 抑制率差（Δ I)为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS-I培养基中的抑制率，再利用 阳性药的A I来确定阳性标准；
[0027] Δ 1 = 1册广Ibhis-i
[0028] Ibhi :样品或对照化合物对CG在BHI培养基中的抑制率；
[0029] Ibhis-i :样品或对照化合物对CG在BHIS-I培养基中的抑制率；
[0030] 挑选出在两种培养基上抑制率都大于70 %的样品进行拆分筛选，并对BH巧邮HIS- I培养基中抑制率差大于20%的进行拆分筛选;对每一种化合物进行筛选，具体确定到底是 某一种化合物起的作用还是某两种或两种W上的协同作用；
[0031] 挑出抑制率仍大于或等于70% W上的复筛阳性化合物样品，根据样品的编号，查 找样品所对应的每一个化合物的编号，并取出每个单一的化合物样品；对每个化合物进行 同复筛一样的验证;仍然具有大于或等于70% W上抑制作用的化合物，进行对CG的纸片法 验证;每个纸片加50化浓度为10化g/mL的待测样品，记录抑菌圈直径;将复筛验证的化合物 命名为活性化合物，即为先导化合物，含有IMB-NY类化合物。
[0032] 进一步地，步骤4)中验证阳性化合物对CG的MIC，确定MTB IspD抑制剂具体为：
[0033] (1)将96孔板、V型槽、移液器等在紫外灯下照射30min;
[0034] (2)将种子液W〇. 3 %的接种量接种于新鲜的BHI/BHIS-I液体培养基中；
[0035] (3)用排式微量移液器将新鲜菌液加入到96孔板中，第一横排19祉L，2~8横排每 孔
[0036] (4)于第1排每孔加入浓度为lOyg/mL的抗菌药物化L混匀，使混合液中药物终浓度 为 0.05yg/ni;
[0037] (5)从第1排吸取10化L液体加入到第2排中混匀，使混合液中药物终浓度为0.02扣 邑/ιΛ;
[0038] (6)2~12排按步骤(5)方法抗菌药物浓度依次2倍稀释，第12排浓度为0.化g/mL
[0039] (7)将96孔板放置在37 °C恒溫培养箱中培养16h;
[0040] (8)观察结果：W细菌生长完全受抑制的浓度记为最低抑菌浓度;从化合物库中获 得对模式替代菌CG的细胞壁有影响的先导化合物共147个。
[0041 ]本发明还公开了一种用于MTB IspD抑制剂表达的ZYM-5052液体培养基，每升的 ZYM-5052的培养基中含有试剂为：1 %的膜蛋白腺、0.5%的酵母提取物、25mM的化2册〇4、 25mM的KH2PO4、50mM的畑此1、5mM的化2S〇4、0.5%的甘油、0.05%的葡萄糖、0.2%的α-乳糖、 2mM的MgS〇4。
[0042] 与现有技术相比，本发明可W获得包括W下技术效果：
[0043] l)IspD蛋白的诱导表达采用了自诱导培养基(ZYM-5052液体培养基），提高了可溶 蛋白IspD的量。
[0044] 2)结合了细菌表型筛选模型和祀标特异性筛选，提高了阳性率。
[0045] 3)新发现的化合物IMB-NY1和IMB-NY2与现有的抗结核药物的结构都不相同。
[0046] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到W上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0047] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [004引图1是本发明【背景技术】中RV3582C的催化反应图
[0049] 图2是本发明实施例1中表型筛选的样品设置图；
[0050] 图3是本发明实施例2中测定MIC的方法流程图；
[0051] 图4是本发明实施例3中吸收值与PPi浓度的标准曲线拟合图。
【具体实施方式】
[0052] W下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据W实施。
[0053] 实施例1:潜在的体外抗结核分枝杆菌细胞壁的先导化合物的筛选
[0054] 通过应用高通量的祀向于结核分枝杆菌细胞壁的替代菌谷氨酸棒状杆菌(CG)表 型筛选模型，筛选潜在的体外抗结核分枝杆菌细胞壁的先导化合物，包括W下步骤：
[0055] 1、菌种种子液的准备:在已倒好的固体平板BHI培养基（3.7%的抓公司的脑屯、浸 液培养基中添加1.5%的琼脂，货号:211065)上划线接种CG，复苏并培养新鲜的CG，培养条 件37°C，倒置培养12h，然后挑取单菌落接种到20mL液体BHI培养基(3.7 %的抓公司的脑屯、 浸液培养基，货号：211065)中37°C，200rpm过夜培养。后测定60化m处可见波长下的光吸收 (ο化00)约为4. ο~5.5。将菌液用液体BHI培养基稀释至0D600 = 3. ο，分装到1.5mL的无菌离 屯、管中，每支lmL，4°C保存10管。经后期试验证明可使用1周。
[0056] 2、初筛模型的应用
[0057] 基于96孔板法的初步筛选：W0.3%的接菌量将CG接入预先计算好的培养基中对 化合物库(来源于中国医学科学院医药生物技术研究所筛选实验室构建保存的截止2014年 年底的化合物样品库）中化合物进行筛选，除空白对照外的每孔用8通道移液器加19如L菌 液，通过观察该模式菌的生长情况，筛选阳性样品。将化合物库的化合物进行100倍稀释，至 终浓度为20yg/mL，在该浓度下肉眼观察其结果为浑浊则是不能抑制CG生长的样品，判定为 初筛阴性样品；在该浓度下肉眼观察其结果为澄清则是能够抑制该菌生长的样品，判定为 初筛阳性样品；具体步骤如下所示：
[0058] (1)准备好要用于筛选的化合物、已灭好菌的8通道移液器枪头。
[0059] (2)将96孔板、8通道移液器、V型槽放于超净台中紫外照射15min，后通风3~5min。
[0060] (3)取化合物化L于96孔板中，板号一一对应W免混淆，将上述配好的W0.3%接菌 量的CG菌液取19祉L于有化合物的96孔板中。
[0061] (4)左面第一列留为对照，前四孔只加19祉L CG的菌液和化L无菌水作为阳性对 照、后四孔只加19祉L BHI纯培养基和化L水作为阴性对照。
[0062] (5)将所有加好样的96孔板至于37°C恒溫培养箱中培养12~16h，用酶标仪测定可 见光波长600nm处的吸收值；
[0063] 按照如下公式计算在BHI培养基中样品对于CG生长的抑制率。
[0064] (1)
[00化]其中歹指的是CG菌正常生长对照组所有孔eOOnm下的吸收值的平均值;基指的是 无 CG菌生长的培养基空白对照组所有孔600nm下的吸收值的平均值;巧旨的是加入化合物后 影响CG菌生长的试验测试孔600nm下的吸收值。
[0066] 抑制率大于70%的孔作为初筛阳性化合物样品。
[0067] 3、复筛验证基于96孔板法初筛的阳性化合物
[0068] 对前面得到的阳性化合物进行复筛，应用BHK3.7%的BD公司的脑屯、浸液培养基， 货号：211065)和BHIS-I(在册I培养基中添加了 10.92%的山梨醇，1 %的氯化钢和0.05%的 硫酸儀)两种培养基进行复筛;具体步骤如下：
[0069] (1)准备好要用于初筛得到的阳性化合物、CG菌种（同初筛中菌种种子液的准备）、 无菌的96孔板、8通道移液器、V型槽和无菌的8通道移液器枪头。
[0070] (2)将96孔板、8通道移液器、V型槽放于超净台中紫外照射15min，后通风3~5min。
[0071] (3)取初筛阳性化合物化L加入96孔板中，取两份编号1、2，分别加入19祉LW0.3% 的接菌量的CG的BH巧邮HIS-I的稀释菌液于已准备好的有初筛阳性化合物的96孔板中。
[0072] (4)如图2所示，96孔板具体为:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔为 乙胺下醇化MB)阳性药物对照。每板的左面第一列中设置4孔空白对照和4孔生长对照，其 中，空白对照组不加菌，生长对照组不加药物，在96孔板中剩余的84孔样品的化合物终浓度 为20yg/mL，反应体系总体积为20化L。在BHI和BHIS-I两种方法上做法相同。
[0073] (5)将所有加好样的96孔板至于37°C恒溫培养箱中培养12~16h，用酶标仪测定可 见光波长600nm处的吸收；
[0074] 按照公式（1)计算BHI或者BHIS-I培养基中样品对于CG生长的抑制率。
[0075] 抑制率差（Δ I)为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS-I培养基中的抑制率，再利用 阳性药的A I来确定阳性标准。
[0076] Δ I = Ibhi-Ibhis-i
[0077] Ibhi :样品或对照化合物对CG在BHI培养基中的抑制率；
[0078] Ibhis-i:样品或对照化合物对CG在BHIS-I培养基中的抑制率。
[0079] 挑选出在两种培养基上抑制率都大于70 %的样品进行拆分筛选，并对BH巧邮HIS- I培养基中抑制率差大于20%的进行拆分筛选。因上述用于筛选的化合物都是五合一的，所 W进行对每一种化合物进行筛选，具体确定到底是某一种化合物起的作用还是某两种或两 种W上的协同作用。
[0080] 挑出抑制率仍大于或等于70% W上的复筛阳性化合物样品，根据样品的编号，查 找样品所对应的每一个化合物的编号，并取出每个单一的化合物样品。对每个化合物进行 同复筛一样的验证。仍然具有大于或等于70% W上抑制作用的化合物，进行对CG的纸片法 验证。每个纸片加50化浓度为l(K)yg/mL的待测样品，记录抑菌圈直径。将复筛验证的化合物 命名为活性化合物，即为先导化合物，含有本发明的IMB-NY类化合物。
[0081] 4、测定活性化合物对CG的MIC
[0082] 进一步测定活性化合物对CG的MIC,将保存的CG种子液W〇. 3 %的接种量分别接种 在BH巧邮HIS-I培养基。96孔板上，每孔终体积为20化L。于37°C培养1化后，使用酶标仪读取 可见光波长600nm处的吸收值，结果中细胞密度数值小于0.020D视为最小抑菌浓度;96孔板 法测定MIC值具体步骤如下(如图3所示）：
[0083] (1)将96孔板、V型槽、移液器等在紫外灯下照射30min;
[0084] (2)将种子液W〇. 3 %的接种量接种于新鲜的BHI/BHIS-I液体培养基中；
[0085] (3)用排式微量移液器将新鲜菌液加入到96孔板中，第一横排19祉L，2~8横排每 孔
[0086] (4)于第1排每孔加入浓度为lOyg/mL的抗菌药物化L混匀，使混合液中药物终浓度 为 0.05yg/ni;
[0087] (5)从第1排吸取10化L液体加入到第2排中混匀，使混合液中药物终浓度为0.02扣 邑/ιΛ;
[0088] (6)2~12排按步骤(5)方法抗菌药物浓度依次2倍稀释，第12排浓度为0.化g/mL
[0089] (7)将96孔板放置在37 °C恒溫培养箱中培养16h;
[0090] (8)观察结果：W细菌生长完全受抑制（同空白对照一致）的浓度记为最低抑菌浓 度。
[0091] 通过上述的筛选研究从化合物库中获得对模式替代菌CG的细胞壁有影响的先导 化合物共147个。
[0092] 实施例2:MTB IspD的表达、纯化和应用研究
[0093] 通过应用高通量的MTB IspD抑制剂筛选模型，筛选WMTB IspD为祀点的新型抗结 核药物。
[0094] IspD蛋白的克隆载体的构建方法参见专利（专利名称：IspD抑制剂筛选模型W及 IspD抑制剂杜米芬的新用途，专利公开号CN 102277411A，发明日：2010-06-10);
[00巧]应用构建成功的的祀T28a( + )-Rv3582c质粒(pET28a( + )-Rv3582c质粒采用常规的 技术手段进行构建)热击转化大肠埃希菌化21(DE3)plysS感受态后，涂布于含有卡那霉素 化an)的LB平板，37°C，过夜培养获得高效表达MTB IspD蛋白pET28a( + )-Rv3582c: :BL21 (DE3)plysS菌株开展蛋白的表达、纯化和应用研究。具体方法是：
[0096] 1)将可高效表达结核杆菌139〇蛋白的大肠杆菌祀了28曰(+ )-1?￥3582(3::81^21(063) plysS划线接种于含有50μg/ml Kan的LB平板，37°C，过夜培养。
[0097] 2)挑取单菌落接种于含有50μg/ml Kan的LB液体培养基，200r.p.m.，37°C，过夜培 养；
[0098] 将过夜培养物按1:1000接种于含有20化g/ml Kan的新鲜ZYM-5052液体培养基中 (每升的ZYM-5052的培养基中含有试剂为：1 %的膜蛋白腺、0.5 %的酵母提取物、25mM的 Na 抽 P〇4、25mM 的 KH2PO4、50mM 的畑此1、5mM 的化 2S〇4、0.5 % 的甘油、0.05 % 的葡萄糖、0.2 % 的 日-乳糖、2mM的MgS〇4)，2lOr. P.m.，37°C，培养化至菌体0〇6日日>0.3。
[0099] 3)将溫度调整到16°C，210r.p.m.，培养1她，诱导IspD蛋白的表达。
[0100] 4)10000Xg离屯、lOmin收集菌体;裂解缓冲液悬浮菌体细胞，冰浴、使用压力破碎 系统将菌体细胞破碎，4°C下14000 X g离屯、化收集上清液；使用AKTAPrime系统，在pH 8.0的条件下，上清液上化s-trap亲和柱(GE公司，17-5247-01 )，用缓冲液进行梯度洗脱，收 集洗脱液；收集到的样品加入15mL超滤离屯、管（lOkDa，Mi 11 iPore公司），4°C下5000g离屯、 15min，至样品量小于2.5ιΛ;使用PD-10脱盐柱和脱盐缓冲液将超滤后的样品脱盐。对蛋白 定量后-8〇°C保存。
[0101] 实施例3:酶活性分析
[0102] 反应体系：10μ1离子试剂（含终浓度lOmM的MgCl2、20mM化F及ImM DTT);lyg的实 施例2获得的纯化的IspD;CTP和MEP(其终浓度分别为500μΜ和250μΜ)。酶反应缓冲液为50mM TriS-HC1 (pH 8.0)，反应体系总体积为10化1。设加入热失活的IspD作为对照。同时设加入8 个不同浓度（ΟμΜ，2扣Μ，50μΜ，7扣Μ，100μΜ，150μΜ，200μΜ，250μΜ)的 100μΙ PPi，在活性测定 中绘制吸收值与PPi浓度的标准曲线，通过Excel拟合出相关直线公式(参见图4);从而根据 公式计算酶的反应进程。
[0103] y = 3.589x+16.418
[0104] r2 = 〇.9997
[01化]活性测定:将上述体系在37°C解育40min，加入10μ1颜色试剂A(1M β-琉基乙醇)和 40μ1颜色试剂Β (2.5 %钢酸锭溶解至2.5Μ的此S〇4)后，37 °C继续解育lOmin，酶标仪在590皿 波长下检测反应体系的吸收值。
[0106] 结果:将样品的吸收值参照标准曲线，计算出反应生成的PPi的浓度。将生成的PPi 的浓度除W完全反应可能生成的PPi的浓度，作为反应进程。
[0107] 代入公式:反应进程=生成的PPi的浓度/完全反应生成的PPi的浓度*100%;
[0108] 当反应进程大于40%，酶的活性即被认为是正常。
[0109] 实施例4: IspD抑制剂的筛选
[0110] 筛选所用方法(祀标特异性筛选）的原理、反应体系和活性测定方法同实施例3具 体筛选分组见表1。
[0111]
[0112] 其中办指完全正常的酶促反应体系作为阴性对照组的吸收值平均值；声指W失活 的IspD作为阳性对照组的吸收值平均值;巧旨的是加入化合物后试验测试孔的吸收值。
[0113] 在本筛选系统中，由于尚无 MTB的IspD抑制剂问世，W失活的IspD作为阳性对照 组，其给出的吸收值最小，酶抑制率为最大；W完全正常的酶促反应体系为阴性对照，该组 给出的吸收值最大，抑制率最小。通过计算得出待筛样品的酶抑制率，当抑制率大于20%即 被认为是阳性结果。
[0114] 筛选结果:从实施例1中得到的147个化合物中筛选得到2个阳性化合物，阳性率为 1.4%，其中，IMB-NY1的化学式如（I)所示：
[0115]
[0116] 其中2〇4邑/1111的加8-爪1对13口0的抑制率为51%。
[0117] IMB-NY2的化合物如（II)所示：
[011 引
[0119] 实施例5:评价MTB IspD抑制剂（IMB-NY1和IMB-NY2)的抗MTB活性
[0120] MTB IspD抑制剂在体外对敏感和耐药结核杆菌抑制活性测定方法如下：
[0121] 1)抗结核活性测定在无菌的96孔培养板中进行，每个孔的终体积为l(K)yL。
[0122] 2)测试孔中分别加入含5X105c化的结核分枝杆菌H37Rv(ATCC 25618)、临床分离 的对异烟阱和利福平敏感的菌株(960)、对异烟阱和利福平耐药的MDR菌株(330)和广泛耐 药的XDR菌株(926)(后Ξ株菌是南京市胸科医院检验科临床标本经过改罗法和分枝杆菌微 量直观快速药敏试验多次验证的菌株，括号内的数字为菌株编号）的培养液，同时加入不同 浓度的阳性对照药异烟阱（INH，Sigma公司）和利福平(RFP，Sigma公司）（药物浓度的选择 是：异烟阱和利福平在用MTB化37RV)菌株中进行试验时从终浓度为32μg/ml开始进行二倍 稀释到62.5ng/ml，当使用临床分离菌株进行试验时药物的终浓度从12祉g/ml开始二倍稀 释到0.12扣g/ml)或DMSO配制的不同浓度的待测化合物，待测样品在试验测定体系中通过 二倍稀释法获得终浓度从初始的128.0μg/ml到0.0625μg/ml;
[0123] 3)培养板的四周为等体积的无菌7朋培养基，同时设置3个生长阳性对照孔(等体 积的不含样品的DMS0溶剂)和3个生长阴性对照孔(等体积的不含任何结核杆菌的7H9培养 基）；
[0124] 4)盖上96孔板后，四周用封口膜密封，置于37°C溫箱中解育；
[0125] 5)培养至第7天显微镜下放大40倍观察阳性生长对照孔和阴性生长对照孔，当观 察到两者有明显差别时，对各个试验孔细菌生长的状态进行观察，并判定和记录抑制或耐 药结果；
[01%] 6)第14天再重复观察一次确认记录结果。
[0127]结果表明：化合物IMB-NY1对结核分枝杆菌标准菌株H37RV的最低抑菌浓度(MIC) 为化g/ml;对临床分离的敏感菌株(960)、MDR菌株(330)和XDR菌株(926)具有相似的抑制活 性，MIC均为2~4μg/ml。化合物IMB-NY2对结核分枝杆菌标准菌株H37RV的最低抑菌浓度 (MIC)为祉g/ml;对临床分离的敏感菌株(960)、MDR菌株(330)和XDR菌株(926)具有相似的 抑制活性，MIC均为8~16μg/ml(见表1)。
[012引表1化合物对各类MTB的MIC(μg/ml)
[0129]
[0130] 注:括号内为反应终浓度。
[0131] 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改 和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行 改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。
【主权项】
1. MB-NY类化合物在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用，其特征在于，所述IMB-NY类 化合物包括頂B-NYl和頂B-NY2，所述頂B-NYl的化学式如（I)所示：7 所述頂B-NY2的化合物如（I I)所示：2. -种含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 菌种种子液的准备； 2) 阳性化合物样品的初筛； 3) 阳性化合物样品的复筛； 4) 验证阳性化合物对CG的MIC，确定MTB I spD抑制剂。3. 根据权利要求2所述的含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，其特征在于， 所述步骤1)中的菌种种子液的准备具体为:在已倒好的固体平板BHI培养基上划线接种CG， 复苏并培养新鲜的CG，培养条件37°C，倒置培养12h，然后挑取单菌落接种到20mL液体BHI培 养基中37°C，200rpm过夜培养;后测定600nm处可见波长下的光吸收(0D600)为4.0~5.5;将 菌液用液体BHI培养基稀释至0D600 = 3.0，分装到1.5mL的无菌离心管中，每支ImL，4°C保存 10管。4. 根据权利要求3所述的含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，其特征在于， 所述步骤2)中的阳性化合物样品的初筛具体为：以0.3 %的接菌量将CG接入预先计算好的 培养基中对化合物库中化合物进行筛选，除空白对照外的每孔用8通道移液器加198yL菌 液，通过观察该模式菌的生长情况，筛选阳性样品；将化合物库的化合物进行100倍稀释，至 终浓度为20yg/mL，在该浓度下肉眼观察其结果为浑浊则是不能抑制CG生长的样品，判定为 初筛阴性样品；在该浓度下肉眼观察其结果为澄清则是能够抑制该菌生长的样品，判定为 初筛阳性样品。5. 根据权利要求4所述的含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，其特征在于， 所述步骤3)中的阳性化合物样品的复筛具体为： (1) 准备好要用于初筛得到的阳性化合物、CG菌种（同初筛中菌种种子液的准备）、无菌 的96孔板、8通道移液器、V型槽和无菌的8通道移液器枪头； (2) 将96孔板、8通道移液器、V型槽放于超净台中紫外照射15min，后通风3~5min; (3) 取初筛阳性化合物2yL加入96孔板中，取两份编号1、2，分别加入198yL以0.3%的接 菌量的CG的BHI和BHIS-I的稀释菌液于已准备好的有初筛阳性化合物的96孔板中； (4) 96孔板具体为:8(A~H)行*12(1~12)列，右面最后一列留四孔为乙胺丁醇阳性药 物对照;每板的左面第一列中设置4孔空白对照和4孔生长对照，其中，空白对照组不加菌， 生长对照组不加药物，在96孔板种剩余的84孔样品的化合物终浓度为20yg/mL，反应体系总 体积为200yL;在BHI和BHIS-I两种方法上做法相同； (5) 将所有加好样的96孔板至于37°C恒温培养箱中培养12~16h，用酶标仪测定可见光 波长600nm处的吸收； 按照公式（1)计算ΜΠ 或者MHS-I培养基中样品对于CG生长的抑制率；(1) 其中及指的是CG菌正常生长对照组所有孔600nm下的吸收值的平均值;否指的是无 CG菌 生长的培养基空白对照组所有孔600nm下的吸收值的平均值;T指的是加入化合物后影响CG 菌生长的试验测试孔600nm下的吸收值； 抑制率差（Δ I)为将BHI培养基中的抑制率减去BHIS-I培养基中的抑制率，再利用阳性 药的A I来确定阳性标准； Δ I = Ibhi-Ibhis-i Ibhi :样品或对照化合物对CG在BHI培养基中的抑制率； Ibhis-i :样品或对照化合物对CG在MHS-I培养基中的抑制率； 挑选出在两种培养基上抑制率都大于70%的样品进行拆分筛选，并对BHI和BHIS-I培 养基中抑制率差大于20 %的进行拆分筛选;对每一种化合物进行筛选，具体确定到底是某 一种化合物起的作用还是某两种或两种以上的协同作用； 挑出抑制率仍大于或等于70%以上的复筛阳性化合物样品，根据样品的编号，查找样 品所对应的每一个化合物的编号，并取出每个单一的化合物样品；对每个化合物进行同复 筛一样的验证;仍然具有大于或等于70%以上抑制作用的化合物，进行对CG的纸片法验证； 每个纸片加50此浓度为lOOyg/mL的待测样品，记录抑菌圈直径;将复筛验证的化合物命名 为活性化合物，即为先导化合物，含有IMB-NY类化合物。6. 根据权利要求5所述的含有MTB IspD抑制剂的先导化合物的筛选方法，其特征在于， 所述步骤4)中验证阳性化合物对CG的MIC，确定MTB IspD抑制剂具体为： (1)将96孔板、V型槽、移液器等在紫外灯下照射30min; (2) 将种子液以0.3 %的接种量接种于新鲜的BHI/BHIS-I液体培养基中； (3) 用排式微量移液器将新鲜菌液加入到96孔板中，第一横排198yL，2~8横排每孔100 yL； (4) 于第1排每孔加入浓度为lOyg/mL的抗菌药物2yL混匀，使混合液中药物终浓度为 0.05yg/mL； (5) 从第1排吸取I OOyL液体加入到第2排中混匀，使混合液中药物终浓度为0.025yg/ mL； (6) 2~12排按步骤(5)方法抗菌药物浓度依次2倍稀释，第12排浓度为0.1yg/mL; (7) 将96孔板放置在37 °C恒温培养箱中培养16h; (8) 观察结果：以细菌生长完全受抑制的浓度记为最低抑菌浓度;从化合物库中获得对 模式替代菌CG的细胞壁有影响的先导化合物。7. -种用于MTB IspD抑制剂表达的ZYM-5052液体培养基，其特征在于，每升的ZYM-5052的培养基中含有试剂为：1 %的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、25mM的Na2HP〇4、25mM的 KH2PO4、50mM的NH4CI、5mM的Na2S〇4、0.5% 的甘油、0.05% 的葡萄糖、0.2% 的α-乳糖、2mM的 MgSO4o
【文档编号】C12R1/32GK105998013SQ201610343082
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】杨延辉, 肖春玲, 刘河涛, 刘忆霜, 蒙建州, 鲁众阳, 田静, 杨志伟, 杨玉荣, 王浩, 王大军, 摆茹, 梁锦屏
【申请人】宁夏医科大学