抗真菌药物组合物及其用图
【专利摘要】本发明提供了冬凌草甲素联合三唑类化合物在制备抗真菌药物中的用途以及包含冬凌草甲素和三唑类化合物的抗真菌药物组合物。通过将用作药物的三唑类化合物如氟康唑、伊曲康唑和/或伏立康唑与冬凌草甲素联用，其对于对现有三唑类药物耐药的真菌如耐药白色念珠菌(C.albicans)具有强大的协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对三唑类药物的耐药性。
【专利说明】
抗真菌药物组合物及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及抗真菌药物组合物及其用途，更具体地设及冬凌草甲素联合Ξ挫类化 合物在制备抗真菌药物中的用途W及包含冬凌草甲素和Ξ挫类化合物的抗真菌药物组合 物。
【背景技术】
[0002] 随着肿瘤及艾滋病患者的不断增加，器官移植、导管插管及内窥镜技术的普遍开 展，高效广谱抗生素、免疫抑制剂及激素的广泛用途，深部真菌感染的发病率逐年增加，其 中白色念珠菌是导致临床真菌感染的主要病原菌。然而，近年来，白色念珠菌(C.a化icans) 的耐药性不断增加，白色念珠菌深部感染引起的死亡率高，给临床成功治疗由白色念珠菌 引起的感染带来了挑战。
[0003] Ξ挫类化合物是临床上最常用的一类抗真菌药物。在作为药物的Ξ挫类化合物 中，例如氣康挫（Fluconazole，FLC)、伊曲康挫（ItrconazoleJTR)和伏立康挫 (Vorconazole，V0R)由于价格低且副作用小，在临床上用途最广泛。随着Ξ挫类化合物的广 泛应用，白色念珠菌对Ξ挫类化合物的耐药性不断增大。。虽然已用于临床的两性霉素 B和 棘白菌素类药物如卡泊芬净（caspo化ngin)对耐药白色念珠菌有效，但其昂贵的价格和较 大的毒副作用限制了它们的临床应用。目前在中国已用于临床的抗真菌药物品种有限，而 开发一种全新化学结构的抗真菌药物耗时耗资巨大，所W药物联用是克服真菌耐药性的一 个有效途径。
[0004] 冬凌草甲素(0ridonin，0RI)是从唇形科香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一 种贝壳杉締二祗类天然有机化合物。冬凌草甲素具有抗肿瘤、抗细菌、杀虫清热解毒、消炎 止痛、健胃活血等作用。冬凌草甲素可有效地抑制溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等细菌， 从而提高机体抵抗力，迅速缓解炎症症状，如已用于临床的复方冬凌草含片。冬凌草甲素单 用对多种癌细胞具有很强的杀灭抑制作用;与其它化疗药配伍使用，能明显地增加它们的 抗癌作用。国内外研究者对冬凌草甲素的研究主要集中在其抗肿瘤的作用及机制研究方 面，所W目前尚无冬凌草甲素和Ξ挫类药物联合对耐药白色念珠菌的抗真菌作用研究报 道。
【发明内容】
[0005] 为了克服真菌对现有Ξ挫类药物的耐药性并寻找可W对Ξ挫类药物增敏的药物， 经过广泛深入的研究，本发明的发明人发现，作为非抗真菌药物，冬凌草甲素(Oridonine， 0RI)单用时对真菌的作用效果很弱或甚至没有，但是当冬当凌草甲素与Ξ挫类化合物联合 使用时，冬凌草甲素对Ξ挫类药物具有增敏作用，并且能够成功地逆转真菌如白色念珠菌 对Ξ挫类药物的耐药性，它们的联用呈现出强大的协同抗真菌作用。基于此发现，完成了本 发明。
[0006] 本发明的目的是提供冬凌草甲素联合Ξ挫类化合物在制备抗真菌药物中的用途， W及包含冬凌草甲素和Ξ挫类化合物的抗真菌药物组合物。
[0007] 在一方面，本发明提供了冬凌草甲素联合Ξ挫类化合物在制备抗真菌药物中的用 途。
[0008] 在一个优选实施方案中，所述抗真菌药物用于对于所述Ξ挫类化合物耐药的白色 念珠菌（C.a化icans)。
[0009] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是选自氣康挫、伊曲康挫和伏立康挫 中的一种或多种。
[0010] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是氣康挫，并且所述冬凌草甲素和氣 康挫的重量比为1:0.0625~4,优选为1:0.125~0.5。
[0011] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是伊曲康挫，并且所述冬凌草甲素和 伊曲康挫的重量比为1:0.001~0.016,优选为1:0.004~0.016。
[0012] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是伏立康挫，并且所述冬凌草甲素和 伏立康挫的重量比为1:0.001~0.031，优选为1:0.004~0.008。
[0013] 在一个优选实施方案中，对于所述白色念珠菌，使用的氣康挫为2至祉g/ml，伊曲 康挫为0.032至0.扣g/ml或伏立康挫为0.032至0.扣g/ml，并且使用的冬凌草甲素为4至32μ g/mlo
[0014] 在另一方面，本发明提供了一种抗真菌药物组合物，其特征在于，所述抗真菌药物 组合物包含冬凌草甲素和Ξ挫类化合物。
[0015] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物至少选自氣康挫、伊曲康挫和伏立康 挫中的一种或多种。
[0016] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是氣康挫，并且所述冬凌草甲素和氣 康挫的重量比为1:0.0625~4,优选为1:0.125~0.5。
[0017] 在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是伊曲康挫，并且所述冬凌草甲素和 伊曲康挫的重量比为1:0.001~0.016,优选为1:0.004~0.016。
[001引在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是伏立康挫，并且所述冬凌草甲素和 伏立康挫的重量比为1:0.001~0.031，优选为1:0.004~0.008。
[0019] 本发明通过将冬凌草甲素与Ξ挫类药物联合使用，可W增强Ξ挫类药物对真菌如 白色念珠菌的抗菌活性，产生协同的抗真菌作用，并且能够逆转真菌如白色念珠菌对Ξ挫 类药物的耐药性，为抗真菌新药的开发提供了方向。
【附图说明】
[0020] 图1示出了根据本发明一个实施方案的冬凌草甲素（0RI)和氣康挫(FLC)联用抗 CA173(-种对Ξ挫类化合物耐药的白色念珠菌)作用的Ξ维效果图，其中X轴表述化C浓度； Y轴表示0RI浓度;Z轴表示各种浓度组合下的真菌生长百分数差值（ΔΕ)值。
[0021] 图2示出了根据本发明另一个实施方案的冬凌草甲素(0RI)和伊曲康挫（ITR)联用 抗CA173作用的Ξ维效果图，其中X轴表示ITR浓度;Y轴表示0RI浓度;Z轴表示各种浓度组合 下的A E值。
[0022] 图3示出了根据本发明另一个实施方案的冬凌草甲素(0RI)和伏立康挫(V0R)联用 抗CA173作用的Ξ维效果图，其中X轴表示V0R浓度;Y轴表示0RI浓度;Z轴表示各种浓度组合 下的ae值）。
[0023] 图4示出了根据本发明另一个实施方案的冬凌草甲素(0RI)和化C联用对CA173的 时间-杀菌曲线，其中使用的化切农度为8mg/L，0RI的浓度分别为8、16和32mg/L，并且使用不 加药组作为生长对照。
[0024] 图5示出了根据本发明另一个实施方案的冬凌草甲素 (0RI)和ITR联用对CA173的 时间-杀菌曲线，其中使用的口R浓度为0.125mg/L，0RI的浓度分别为8、16和32mg/L，并且使 用不加药组作为生长对照。
[0025] 图6示出了根据本发明另一个实施方案的冬凌草甲素(0RI)和V0R联用对CA173的 时间-杀菌曲线，其中使用的V0R浓度为0.125mg/L，0RI的浓度分别为8、16和32mg/L，并且使 用不加药组作为生长对照。
[0026] 图7是示出了根据本发明另一个实施方案的使用流式细胞仪检测在吸收平衡时的 冬凌草甲素(0RI)增效作用的相对巧光强度值的柱形图，其中W只加入浓度为ΙΟμΜ的罗丹 明6G(化6G)组作为对照。
【具体实施方式】
[0027] 本发明的发明人采用多种方法，研究氣康挫、伊曲康挫和伏立康挫分别与冬凌草 甲素联用对耐药白色念珠菌的静态与动态联合抗真菌作用。研究发现，冬凌草甲素联合Ξ 挫类药物(氣康挫、伊曲康挫或伏立康挫)对耐药白色念珠菌的生长具有明显的抑制作用， 能够逆转白色念珠菌对Ξ挫类药物的耐药性，可W预见，冬凌草甲素联合Ξ挫类药物可W 用于制备抗真菌药物。
[0028] 为此，本发明提供了冬凌草甲素联合Ξ挫类化合物在制备抗真菌药物中的用途， 并且提供了一种抗真菌药物组合物，所述药物组合物包含冬凌草甲素和Ξ挫类化合物。更 具体地，本发明提供了冬凌草甲素与Ξ挫类化合物联合在制备用于对于所述Ξ挫类化合物 耐药的白色念珠菌的抗真菌药物中的用途，其中冬凌草甲素作为耐药白色念珠菌的逆转剂 和Ξ挫类化合物的增效剂，可W增加真菌对Ξ挫类化合物的敏感性，从而逆转白色念珠菌 对Ξ挫类化合物的耐药性。
[0029] 在本发明中，所述真菌为对Ξ挫类药物耐药的白色念珠菌(C.a化icans)。
[0030] 在本发明中，Ξ挫类化合物与Ξ挫类药物可互换使用，其意指可用作药物的任何 Ξ挫类药物，特别是真菌对其具有耐药性的Ξ挫类化合物，其实例包括但不限于氣康挫、伊 曲康挫和伏立康挫中的一种或几种。
[0031 ]在一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是氣康挫，并且所述冬凌草甲素和氣 康挫的重量比为1:0.0625~4,优选为1:0.125~0.5。在另一个优选实施方案中，所述Ξ挫 类化合物是伊曲康挫，并且所述冬凌草甲素和伊曲康挫的重量比为1:0.001~0.016,优选 为1:0.004~0.016。在另一个优选实施方案中，所述Ξ挫类化合物是伏立康挫，并且所述冬 凌草甲素和伏立康挫的重量比为1:0.001~0.031，优选为1:0.004~0.008。
[0032]在另一个优选实施方案中，使用的Ξ挫类化合物和冬凌草甲素 W其溶解在合适溶 剂如蒸馈水或二甲亚讽(DMS0)中的溶液形式使用。因此，针对对于Ξ挫类药物耐药的白色 念珠菌，使用的氣康挫浓度为2~祉g/ml;使用的伊曲康挫浓度为0.032~0.化g/ml;使用的 伏立康挫浓度为0.032~0.化g/ml，并且联合使用的冬凌草甲素浓度为4~32μg/ml。
[00削实施例
[0034] 下面将结合实施例对本发明作进一步的说明，但应理解，运些实施例绝不W任何 方式限制本发明的范围。
[0035] 实施例1:冬凌草甲素与Ξ挫类药物联合抗白色念珠菌静态作用测定
[0036] 1.材料
[0037] 1.1实验菌株
[003引质控标准菌株：白色念珠菌(C.a化icans，CA)标准菌株CA(W保藏号ATCC 10231获 自美国菌种保藏中屯、(American Type Qilture Collection))。
[0039] 实验菌株：临床分离的白色念珠菌，实验所用白色念珠菌均为山东省肿瘤医院检 验科临床患者送检的样本，经科玛嘉显色鉴别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养 并保存，得到的白色念珠菌菌株分别编号为CA173、CA195、CA2489与CA3208，并且根据药敏 试验结果，其中的CA173和CA195为对Ξ挫类耐药的白色念珠菌，而CA2489与CA3208为对Ξ 挫类敏感的白色念珠菌。
[0040] 1.2药品与试剂
[0041] 氣康挫(FLC)、伊曲康挫（ITR)和伏立康挫（V0R)，山东诚创医药技术开发有限公 司。
[0042] 冬凌草甲素(0RI)，西安吴轩生物科技有限公司，纯度98%。
[0043] PBS(憐酸盐缓冲液)粉末，北京索莱宝科技有限公司。
[0044] PBS溶液:称取PBS粉末24g，溶于化双蒸水中即得到pH 7.2的PBS缓冲溶液。在121 °C高压（103.4kpa)湿热灭菌20min，冷却分装备用。
[0045] 二甲亚讽(DMS0)，天津市化学试剂一厂。
[0046] 3-(N-吗嘟代)丙横酸(MOPS)粉末，Sigma-Al 化 ich。
[0047] 酵母膏，0xoid。
[004引蛋白腺，北京奥博星生物技术有限责任公司。
[0049] 葡萄糖，天津市大茂化学试剂厂。
[0050] 琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司。
[0051 ] RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含心谷氨酷胺，不含碳酸氨钢）粉末（美国 GIBC0公司）4.16g，葡萄糖8g，M0PS粉末13.812g，加蒸馈水至约为400ml，混合均匀后在22°C 用Imol/L的化OH溶液调节pH为7.0,临用前用0.22皿纤维滤膜(济南安贝卡商贸有限公司） 过滤灭菌。
[0052] 酵母膏-蛋白腺-葡萄糖(YPD)琼脂培养基:葡萄糖20g，蛋白腺20g，酵母膏lOg，琼 脂粉20g，用1000ml蒸馈水溶解，充分揽拌均匀后在12rC灭菌20min，冷却后4°C冰箱保存备 用；
[0053] XTT-甲糞酿溶液:取XTT粉末(北京康为试剂有限公司）0.0500g，溶解于100m旧灭 菌的林格氏液(北京康为试剂有限公司）配成〇.5mg/ml的溶液，用0.22皿纤维滤膜(济南安 贝卡商贸有限公司)滤过灭菌;加入1〇μ1的lOOmmol/L的甲糞酿丙酬溶液(取甲糞酿(北京康 为试剂有限公司）〇.〇860g溶解于5ml丙酬），使其终浓度为10皿ol/L，摇匀，4°C避光保存。 [0化4] 1.3仪器 生物安全柜 SPEC AIR TECH公n:j; 电子天平 瑞 ?; Mettler Toledo 公 n:j;
[00 巧] 高温高压灭菌器， 英N Astell Scientific公叫'； 恒温培养箱 德国MMM錢司； 不诱钢过滤器(2000ml) 江戴天和化器厂； 96孔培养板 美国COST.AR公司； 可调式移液器 Thermo Electron公词；
[0化6] M% Minisliaker渦旋振荡器 Ι??Α勞司； 酶标仪 美国Bio-及ad公司； 常温冰錐 中国海尔公司；
[0化7] 2.内容与方法
[0058] 2.1实验菌液与实验药液的配制
[0059] 2.1.1菌液的配制
[0060] 受试菌株在YTO培养基上转种2次，挑取单个较大菌落用PBS缓冲液配成菌悬液，W 中国细菌标准浊度管（济南安贝卡商贸有限公司）比浊，调整浓度约为5X106CFU/mL，W RPMI 1640液体培养基将其稀释使96孔平板内工作菌液浓度为2 X 103CFU/mL。在显微镜（日 本OLYMPUS公司）下用血球计数板(济南格利特科技有限公司)验证工作菌液浓度。
[OOW] 2.1.2药液的配制
[0062] 作为药物母液，化CW灭菌蒸馈水配成2560μg/mlJTR和V0R分别WDMS0配成6400μ g/ml，0RlWDMS0配成102400μg/ml。将各药物母液用3?111640液体培养基进行对倍稀释^ 达到系列工作浓度。
[0063] 2.2药敏测定试验
[0064] 根据美国临床实验室标准委员会(NCCLS)颁布的抗真菌药敏试验M27-A3方案，采 用96孔板模型测定冬凌草甲素与Ξ挫类药物联用时的最低抑菌浓度(MIC)(抑制80%的真 菌生长)值。各菌株工作菌液浓度为2 X 10化即/mLJLC的浓度设计为0.5-51化g/ml，ITR和 V0R的浓度设计为0.004-祉g/ml，0RI的浓度设计为体内能够达到的药物浓度2-12祉g/ml。 第12列作为空白对照，即不加菌液;其余各孔加入10化1菌液;A1孔为生长对照孔，不加任何 药液。。其余不足20化1的孔WRPMI1640液体培养基补齐。在37 °C恒溫培养2地和4她后，加入 XTT-甲糞酿溶液避光培养化，用酶标仪在490nm处测光密度(0D)值。得到0D值后，按W下公 式计算真菌生长百分数:真菌生长百分数=(各孔0D值-空白对照孔0D值)/生长对照孔0D值 X 100%，W抑制80% W上真菌生长的最低药物浓度为MIC值。所有实验重复Ξ次。
[0065] 2.3评价方法与结果判定
[0066] Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用， 因此基于该理论，将各药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点）进行比较。其分析 方法为分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitoiT concentration index，FICI)，表述 如下：
[0067] FICI = Ca/MICa+Cb/MICb;MICa和MICb分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，Ca与 Cb为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。联合作用效果评价标准是Odds在论文 '^Synergy,antagonism,and what the chequerboard puts between them，J Antimicrob 化emother,2003,52(1) :r中提出的建议:FICI《0.5为协同（作用），FICI>4为括抗（作 用），在0.5与4之间为相加或无关。
[0068] 3.结果
[0069] 药敏测定试验2地和4她作用的评价结果总结如下表1和表2所示。
[0070] 表1:冬凌草甲素与Ξ挫类药物单用及联用24h的MIC值及作用判定结果
[0071]
[0072] 注:0RI表示冬凌草甲素;FLC表示氣康挫；ITR表示伊曲康挫;V0R表示伏立康挫。
[0073] 表2:冬凌草甲素与Ξ挫类药物单用及联用4她的MIC值及作用判定结果
[0074]
[00巧]注:0RI表示冬凌草甲素;FLC表示氣康挫；ITR表示伊曲康挫;VOR表示伏立康挫。
[0076] 从上表1和2可W看出，在联合用药中，对于耐药白色念珠菌，冬凌草甲素(单独使 用时的MI051化g/ml)和氣康挫（单独使用时的MI051化g/ml)联合，所述冬凌草甲素的 MIC为祉g/ml并且氣康挫的MIC为化g/ml;冬凌草甲素（单独使用时的MI051化g/ml)和伊 曲康挫（单独使用时的MIC>祉g/ml)联合使用时，所述冬凌草甲素的MIC为祉g/ml并且伊曲 康挫的MIC为0.03化g/ml;冬凌草甲素(单独使用时的MIC>51化g/ml)和伏立康挫（单独使 用时的MIC>如g/ml)联合使用时，所述冬凌草甲素的MIC为4μg/ml并且伏立康挫的MIC为 0.032μg/ml。
[0077] 此外，上述试验结果还表明，冬凌草甲素对耐药白色念珠菌的抗真菌作用效果极 其显著，而对敏感白色念珠菌的作用显示不明显。
[0078] 因为联合用药的浓度为一系列不同的配比，平面的数据展示较为繁琐，为更直观 地表现0RI和Ξ挫类药物联用对耐药的白色念珠菌的作用程度，W0RI和化C联用针对CA173 为例，将联合药敏测定数据用基于Blics ind邱endence(BI)理论的ΔΕ(真菌生长百分数差 值)模型分析。E为真菌生长百分数，ΔΕ = Ε狸仑-E剪示，其中E狸仑=EaXEb，E狸仑为药物A与B联用 时在无相互作用的假设下理论上的真菌生长百分数，Ea与Eb分别为两种药物单独用途时实 际的真菌生长百分数;E弈示为每一组药物联用浓度下测得的实际生长百分数。药物相互作用 效果W药物各浓度下真菌生长百分数的理论值与实验值之差A E评价，每一药物联用组合 均可得到一个A E值。用Matlab数据分析软件作图，W联合用途的两种药物浓度分别为X轴 和Y轴，δε值为Z轴，可W形成一个Ξ维图像，0平面上方或下方的峰分别表示协同或括抗，0 平面表示无统计学显著区别。
[0079] 0RI与FLC、ITR和V0R分别联用对CA173 24h结果判定时，联用药物组合对应的ΔΕ 值形成的Ξ维图像分别如图1~3所示。由图1~3可W看出0RI与化C、口R和V0R分别联用对 高耐药的CA173呈现出较强的协同作用，在多数药物浓度下有较高的Δ E值，图中高度越高， 协同作用效果越好。根据图1~3所示的结果可w看出，冬凌草甲素与氣康挫的重量比为1: 0.0625~4;冬凌草甲素与伊曲康挫的重量比为1:0.001~0.016;冬凌草甲素和伏立康挫的 重量比为1:0.001~0.031。
[0080] 同时，从上表1和2中还可W看出，FICI远小于0.5，因此0RI和Ξ挫类药物联用对耐 药的白色念珠菌呈现出强的协同作用。在0RI和化C联用对CA173的24h药敏实验测定中，0RI 的加入可W使FLC对CA173的MIC从>512μg/ml降至Ij2μg/ml，至少将FLC的MIC下降为原来的 1/256。。由上表1和2中的数据可W看出，冬凌草甲素与氣康挫的重量比更优选为1:0.125~ 0.5;冬凌草甲素与伊曲康挫的重量比更优选为1:0.004~0.016;冬凌草甲素和伏立康挫的 重量比更优选为1:0.004~0.008。
[00川 4.结论
[0082] 面对临床用途中抗真菌药物较少且出现耐药现象的现状，本发明发现通过联合用 药的方式来增加耐药白色念珠菌对Ξ挫类药物的敏感性是一种较好的选择。0RI和Ξ挫类 药物联用对耐药的白色念珠菌呈现出强大的协同作用，而且要达到此协同作用，所需的各 药物浓度都是体内可W达到的药物浓度，0RI和Ξ挫类药物联合治疗白色念珠菌感染在临 床有很好的前景。
[0083] 实施例2:冬凌草甲素与Ξ挫类药物联合抗白色念珠菌动态作用测定
[0084] 1.材料
[0085] 1.1 菌株
[0086] 实验所用菌株为临床分离的Ξ挫类耐药的白色念珠菌CA173,经科玛嘉酵母菌鉴 别培养基鉴别确认，在固体培养基上传代培养。
[0087] 1.2药品与试剂
[008引 0RI、化C、ITR和V0R的原料药；二甲基亚讽DMS0; PBS缓冲液;0.1mol/L化0H溶液； RPMI 1640;酵母浸膏-蛋白腺-葡萄糖(YPD)琼脂培养基均与上述实施例1相同。
[0089] 1.3 仪器
[0090] MMM恒溫培养箱、高溫高压灭菌器、生物安全柜(均与上述实施例1相同）；恒溫振荡 器(德国Gi^L公司）。
[0091] 2.内容与方法
[0092] 本实验建立了药物单用与药物联用作用体系，在35Γ振荡培养4她。采用XTT法分 别在化、6}1、12}1、2姑、4她从各个作用体系中吸取10化1样品，测定药物的动态抗菌活性大 小。本实验采用的各药物浓度在体内均可达到。
[0093] 2.1体系的建立
[0094] 2.1.1实验菌液与实验药液的制备
[00M]取于YH)培养基上传代两次的CA173,挑取单个较大菌落，WPBS缓冲液制成菌悬 液，采用中国浊度标准进行比浊，初浓度为5 X 10化即/mL，WRPMI 1640液体培养基适当稀 释至IX 104C即/mL的工作浓度。用血球计数板(与上述实施例1相同）在显微镜(与上述实施 例1相同）下计数验证工作菌液浓度。
[0096] 取与实施例1同法配制的药物母液，WRPMI 1640进行倍比稀释，参照药物在人体 内的可获得浓度W及实施例1中的静态药敏实验结果，配制工作药液，使药物在时间-杀菌 曲线工作体系内的浓度分别为:FLC为祉g/mL，UR为0.12扣g/mL，V0R为0.12扣g/mL，而0RI 为8、16和32yg/mL。
[0097] 2.1.2体系的制备与培养
[009引实验建立8个作用体系:①生长对照组（只加菌液，不加药液）；②化CATR/VOR单用 组；③OR I (如g/mL)单用组；④0RI (16yg/mL)单用组；⑤OR I (3 2yg/mL)单用组；⑥化C/1TR/ V0R+0RI (祉g/mL)联用组；⑦化 C/1TR/V0R+0RI (16yg/mL)联用组；⑧化 C/1TR/V0R+0RI (32μ g/mL)联用组。各体系均为5mL，每组加0.5mL菌液，0.5mL各浓度的药液，不足5mL的用RPMI 1640液体培养基补齐。将制备完毕的体系于35 °C振荡培养4她。
[0099] 2.2药物联用时的动态抗菌活性测定
[0100] 作用体系制备完毕后，分别在体系建立后的化、6h、12h、24h和4她分别从各作用体 系中吸取100μΙ菌液置于一个新的96孔板中，然后加入100μΙ XTT-甲糞酿溶液（包含有 0.5mg/ml的ΧΤΤ和ΙΟμΜ的甲糞酿），在35°C下避光培养化。之后，用酶标仪在490nm处测定各 孔0D值。各个实验重复3次取平均值。
[0101] 3.结果
[0102] 依据不同时间点0D值测定结果，绘制化C、UR和V0R分别与0RI联用4她内对CA17 3 的时间-杀菌曲线，如图4~6所示。从图4~6可W看出，0RI单用几乎不能抑制CA173的生长； 随着0RI浓度的增加，对CA173的抗菌作用几乎没有增强，各个浓度的0RI单用组与生长对照 组的时间-杀菌曲线几乎没有分开。Ξ挫类药物对CA173呈现出一定的抑菌作用，Ξ挫类药 物作用24h后与生长对照组的时间-杀菌曲线有明显分开。加入OR I作用12h后，0RI OR I与 FLC、ITR和V0R分别联用抗CA173的增效作用开始显现，在加入0RI作用24h后，各个药物联用 组与化C、ITR和V0R单用组的时间-杀菌曲线有明显分开。0RI对Ξ挫类药物的增效作用随着 0RI浓度的增加而逐渐增强。当0RI的浓度为3化g/mL时，0RI与化C、ITR和V0R分别联用抗 CA173的增敏作用最强，所述药物联用几乎完全抑制了 CA173的生长，时间-杀菌曲线接近 一条直线。
[0103] 4.结论
[0104] 图4~6所示的时间-杀菌曲线法可提供药物单用或联用时对受试菌株影响的动态 作用结果，其包括:①药物的速度和抗菌活性程度;②药效学参数(如浓度-效应关系及后效 应）；③抗菌药物联用时的药效关系（协同、括抗、相加或无关）。由于可提供的信息丰富，时 间-杀菌曲线法被广泛用途于评价抗菌药物单用及联用时的抗菌效果。动态抗菌实验结果 表明0RI和Ξ挫类药物联用对白色念珠菌CA173呈现出协同作用，运与静态实验结果是一致 的，而且0RI和Ξ挫类药物的浓度在体内是能够达到的。
[0105] 实施例3:冬凌草甲素与Ξ挫类药物联合抗白色念珠菌的作用机制研究
[0106] 1.材料与仪器
[0107] 实验菌株:临床分离的白色念珠菌CA173,从-20°C冰箱解冻后，置YH)固体培养基 上至少传代培养3次复苏后再使用。
[0108] 培养基:YPD液体培养基配制方法如下：分别称取4g酵母膏、地蛋白腺W及8g葡萄 糖，加入适量蒸馈水揽拌使其尽量溶解，再加蒸馈水至400ml，充分揽拌均匀。最后在12rC 下高压灭菌20min，冷却后放至4°C冰箱保存。YPD固体培养基是日常接种培养的培养基，其 配制方法同上所述。
[0109] 药液:冬凌草甲素母液用RPMI 1640培养基(与上述实施例1相同）稀释成32μg/ml， 备用。
[0110] 试剂与耗材:罗丹明6G(化6G)母液:称取0.0096g化6G(北京康为试剂有限公司） 溶于lOmL双蒸水中，配成2000μΜ的浓度，用0.22皿的微孔滤膜(与上述实施例1相同）过滤除 菌，避光低溫保存;PBS-葡萄糖(5 % )缓冲液:称取1.2g PBS粉末(与上述实施例1相同），加 入蒸馈水揽拌使其溶解;再称取5g葡萄糖(与上述实施例1相同），加入蒸馈水揽拌使溶解； 最后加蒸馈水至lOOmL。配制完毕后用0.22皿的微孔滤膜过滤除菌，冷却后放4°C冰箱保存。 PBS缓冲液配制方法同上所述。其他常规设备如流式小管、lOmL EP管、试管等来自济南安贝 卡商贸有限公司。
[0111] 仪器:流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司），低溫离屯、机（美国贝克曼库尔特公 司），恒溫振荡培养箱(与上述实施例2相同），高压灭菌器(与上述实施例1相同），等。
[0112] 2.实验方法
[0113] 挑取处于对数生长期的单克隆CA173菌落，WPBS配置成5X106CFU/mL的菌悬液，1 :1〇〇倍稀释后，在YTO液体培养基中37°C培养至对数生长期。然后W3000巧m离屯、5分钟收集 菌细胞，用PBS缓冲液清洗3次，重悬至5X106CFU/mL。加入化6G，使其终浓度为ΙΟμΜ。将化6G 染色后的菌悬液在12化pm、在37°C下避光振荡培养约90分钟，至胞内巧光浓度达到平衡。
[0114] 白色念珠菌CA173胞内巧光浓度达到平衡后，W冰水浴终止吸收;然后离屯、，用PBS 重悬、清洗3次，洗去多余的化6G。最后加入含5%葡萄糖的PBS溶液重悬菌细胞。外排实验分 2组进行测定:正常生长组和加药组。加药组加入的是终浓度为32μg/ml的冬凌草甲素。将W 上各组在12化pm、37°C下避光振荡培养约90分钟。然后在流式细胞仪激发波长488nm、发射 波长525nm下检测胞内剩余巧光浓度。外排实验重复测定2次。
[0115] 3.流式细胞术测定结果
[0116] W相对于吸收平衡时巧光强度的相对值作为对照组和加药组的纵坐标，借助t检 验（显著性水平为0.05)对实验结果进行统计分析，结果如图7所示。从图7所示的结果可W 表明，两次实验所测得的加冬凌草甲素组相对巧光强度的平均值是对照组的1.59倍，且P值 为0.0216,其差异具有统计学意义。
[0117] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可W对那些细节进行各种修改和替换，运些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 冬凌草甲素联合三唑类化合物在制备抗真菌药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗真菌药物用于对于所述三唑类化合物 耐药的白色念珠菌(C.albicans)。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述三唑类化合物是选自氟康唑、伊曲康唑 和伏立康唑中的一种或多种。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述三唑类化合物是氟康唑，并且所述冬凌 草甲素和氟康唑的重量比为1:0.0625~4,优选为1:0.125~0.5。5. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述三唑类化合物是伊曲康唑，并且所述冬 凌草甲素和伊曲康唑的重量比为1:0.001~0.016,优选为1:0.004~0.016。6. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述三唑类化合物是伏立康唑，并且所述冬 凌草甲素和伏立康唑的重量比为1: 〇. 001~〇. 031，优选为1:0.004~0.008。7. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，对于所述白色念珠菌，使用的氟康唑为2至8μ g/ml，伊曲康唑为0.032至0.5μg/ml或伏立康唑为0.032至0.5μg/ml，并且使用的冬凌草甲 素为4至32μg/ml。8. -种抗真菌药物组合物，其特征在于，所述抗真菌药物组合物包含冬凌草甲素和三 唑类化合物。9. 根据权利要求8所述的抗真菌药物组合物，其特征在于，所述三唑类化合物至少选自 氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑中的一种或多种。10. 如权利要求9所述的抗真菌药物组合物，其特征在于，所述三唑类化合物是氟康唑， 并且所述冬凌草甲素和氟康唑的重量比为1:0.0625~4，优选为1:0.125~0.5。11. 如权利要求9所述的抗真菌药物组合物，其特征在于，所述三唑类化合物是伊曲康 唑，并且所述冬凌草甲素和伊曲康唑的重量比为1:0.001~0.016,优选为1:0.004~0.016。12. 如权利要求9所述的抗真菌药物组合物，其特征在于，所述三唑类化合物是伏立康 唑，并且所述冬凌草甲素和伏立康唑的重量比为1:0.001~0.031，优选为1:0.004~0.008。
【文档编号】A61K31/506GK105998011SQ201610343488
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】史文娜, 刘玉国, 李辉, 陈海生
【申请人】山东省肿瘤防治研究院