一种结核分枝杆菌蛋白hbha及其表达方法和亚单位疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌蛋白HBHA及其表达方 法和亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002] 肝素结合血凝素(HBHA)是M. tb、BCG、麻风分枝杆菌(M. leprae)等表面表达和分泌 的一种糖蛋白，可同时出现在菌体和培养液中。HBHA能够粘附到上皮细胞和其他非吞噬细 胞，有利于M. tb从初次感染部位的体内扩散。
[0003] 翻译后修饰对HBHA蛋白的免疫原性有重要影响。天然HBHA免疫小鼠后，不但能诱 导小鼠产生高水平IFN- γ和抗体，并且能够有效减少感染小鼠的脾、肺脏荷菌量和病理改 变，其产生的免疫效果甚可达到BCG的相应水平。鉴于天然HBHA在预防结核病方面的重要作 用，需要对其进行大规模的纯化制备以备进一步的进行临床研究应用。但是大规模的纯化 制备受表达系统的制约，如大肠杆菌表达系统表达的蛋白HBHA不能进行翻译后修饰，耻垢 分枝杆菌表达的蛋白HBHA不适宜大规模生产等。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种毕赤酵母GS115表达的 结核分枝杆菌蛋白HBHA及亚单位疫苗，其目的在于获取不含有除蛋白HBHA本身氨基酸序列 外的其他氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白HBHA，并对其进行大规模的纯化制备以备进一步 的进行临床研究应用，配合本发明提供的疫苗佐剂，用于预防结核病，由此解决了大规模的 纯化制备受表达系统的制约的问题。
[0005] 本发明首先提供一种肝素结合血凝素蛋白（HBHA)，包含有：
[0006] 1)氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质；
[0007] 2)与序列SEQ ID NO: 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%编码相同功能蛋 白质的氨基酸序列。
[0008] 上述蛋白质的表达方法，是将核苷酸序列为SEQ ID N0:2的基因的的第267碱基由 原先的G突变为A;再将突变后的基因片段插入到毕赤酵母表达载体中，构成的重组质粒转 入毕赤酵母中进行表达，纯化后获得目的蛋白。
[0009] 本发明另一个方面提供一种结核病亚单位疫苗，含有所述的HBHA蛋白和疫苗佐 剂；其中HBHA蛋白的浓度为0.25~0.75mg/mL:
[00?0]所述的亚单位疫苗中脂质体开$式的DTM疫苗佐剂的使用浓度如下:0.5~2mg/ml二 甲基双十八烷基铵、含有〇. 25~0.75mg/mL的海藻糖，0.25~0.75mg/mL的单磷酰脂质A;
[0011] 所述的亚单位疫苗中溶液形式的PTM疫苗佐剂的使用浓度如下:0.25~0.75mg/mL 的海藻糖，〇. 25~0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5~37.5mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)〇
[0012] 本发明选利用毕赤酵母GS115菌株能够表达出的蛋白HBHA无标签且不含有除HBHA 本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列，配合相应疫苗佐剂能够取得下列较好的免疫反应效 果，免疫保护效果和高安全性。
【附图说明】
[0013] 图1:实施例4的PCR鉴定HBHA基因整合于毕赤酵母GS115染色体基因组和蛋白HBHA 的表达纯化图；
[0014]图2 :实施例9的各组小鼠血清蛋白HBHA特异的IgG抗体、亚类及IgG2a/IgGl比值 图；
[0015]图3:实施例9的蛋白HBHA特异的小鼠脾细胞上清中细胞因子IFN- 丫水平图。
[0016] 图4为实施例10的气溶胶攻击感染免疫C57BL/6小鼠四周后各组的肺脏荷菌量图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼 此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0018] 本发明提供的毕赤酵母GS115表达的蛋白HBHA无标签且不含有除HBHA本身氨基酸 序列外的其他氨基酸序列。本发明提供的结核病亚单位疫苗，含有所述的蛋白HBHA，其浓度 为0.25至0.75mg/mL，还含有以下两组成分中的一组的：
[0019] 〇 · 5mg/ml至2mg/ml二甲基双十八:院基铵、含有0 · 25至0 · 75mg/mL的海藻糖，0 · 25至 0.75mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式；
[0020] 含有0.25至0.75mg/mL的海藻糖，0.25至0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5至 37.5mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，为溶液形式。
[0021] 所述蛋白HBHA(氨基酸序列为SEQ ID N0:1)，其编码基因是对结核分枝杆菌标准 毒株H37Rv的HBHA基因 （SEQ ID N0:2)的第267碱基由原先的G突变为A获得的，突变后的基 因，其在毕赤酵母中的显著提高。
[0022]本发明提供的两种疫苗佐剂，分别命名为DTM和PTM。
[0023] DTM疫苗佐剂含有lmg/ml至4mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.5至1.5mg/mL的海 藻糖(Trehalose)，0.5至1.5mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式。
[0024] PTM疫苗佐剂含有0.5至1.5mg/mL的海藻糖，0.5至1.5mg/mL的单磷酰脂质A，25至 75mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，为溶液形式。
[0025]全球有三分之一的人群感染结核分枝杆菌(M.tb)，其中5%_10%发展为活动性结 核病(ATB)。而卡介苗(BCG)作为目前全球范围唯一预防结核病的疫苗能够有效的预防婴幼 儿重症结核病如粟粒样TB及结核性脑膜炎，但对预防成人肺TB的发生、发展的效果差异很 大。因而迫切需要发展新的结核疫苗，以提高对成人TB的预防效果。
[0026]结核病亚单位疫苗，可用来替代BCG或作为增强疫苗增强BCG免疫后的效应，是新 发展的控制TB的主要疫苗类型之一。而且，亚单位疫苗应用于免疫缺陷人群相对于BCG更为 安全。广泛接受机体抗M. tb的感染主要是依靠细胞免疫应答，尤其是CD4+Th 1型应答在抗原 发感染上起重要作用，CD8+T细胞在阻止潜伏感染后的再激活，即成人肺TB的发生具有重要 作用。BCG免疫主要是诱导机体产生强的CD4+Thl型应答，因此，其在预防儿童的原发感染后 所致的原发重症TB较为有效。但是，BCG免疫机体产生CD8+T细胞反应能力较弱，所以对预防 潜伏感染和成人肺TB的价值不大。HBHA是M. tb的黏附素，与M. tb感染后在体内的播散密切 相关，同时也是一个重要的T细胞抗原。业也证实，单独利用天然HBHA免疫，可以增强BCG的 免疫保护效果。拟以该抗原为基础，建立亚单位疫苗，利用其在诱导CD8+T细胞反应上应具 有较强的潜力，以补充BCG免疫的不足。M. tb许多蛋白的免疫原性弱，因而需要免疫刺激佐 剂来辅助蛋白诱导的免疫反应，如二甲基双十八烷基铵，海藻糖等。二甲基双十八烷基铵与 抗原联合在不同类型动物模型均可诱导细胞和体液免疫反应。海藻糖是人工合成的分枝杆 菌细胞壁的免疫刺激成分。
[0027]巴斯德毕赤酵母表达系统不但具有原核细胞和真核细胞表达系统的特点，还具有 高表达、高稳定和高分泌的优点，适合工业化大规模生产。该菌能以甲醇作为唯一碳源时， 其醇氧化酶(Α0Χ)高表达。Α0Χ的合成是在转录水平调控的，基因启动子ΡΑ0Χ具有明显的调 控功能，可用于调控外源基因的表达。当A0X1基因的启动子PA0X1受甲醇强烈诱导时其催化 活性很强。外源蛋白的高水平表达依赖于多拷贝基因的插入整合，引入Tn903Kan基因（抗 G418)后，有助于筛选高拷贝转化子，酵母菌抵抗G418的能力与其整合质粒的拷贝数成正 比。因此，用含不同浓度G418的YEH)平板可筛选高拷贝转化子。近几年来，已经有许多M. tb 的外源蛋白在此系统中得到表达，包括培养滤液蛋白32(CFP32);热休克蛋白70 (HSP70); MPT64;M.tb Rv0577基因；ESAT6等。
[0028] 本发明中佐剂成分TDB