一种十六肽qtddnhsnvlwagfsr及其应用
【技术领域】
[00011本发明属于生物制药领域，具体涉及一种合成十六肽QTDDNHSNVLWAGFSR及其应 用。
【背景技术】
[0002]生物活性肽(Bioactivity peptides)又称功能肽(Functional peptides)，顾名 思义它是一类具有一定生理活性功能的肽，能抑制肿瘤细胞生长，破坏、杀伤肿瘤细胞或者 抗菌、抗病毒、降血压、降血糖等重要作用。由于其分子量小、易于吸收，可以广泛的应用于 保健品和药物的开发，因此，生物活性肽已成为蛋白质研究的热点之一。
[0003] 肿瘤是21世纪的健康杀手，其发病率和死亡率仍在攀升。目前对肿瘤患者的治疗 方法主要是化疗和放疗手段，对人体造成极大损害，肿瘤发生恶性转移后无论用何种方式 都很难彻底治愈。所以寻找一种能彻底清除癌细胞而不损害到其他细胞的治疗方法成为全 球肿瘤医学领域的研究热点。多种生物活性肽陆陆续续被发现具有抗肿瘤活性，这成为抗 肿瘤药物研究开发的新方向。日本学者Yamaguchi等曾以酪蛋白和玉米肽共同喂食经7，12-二甲基苯并[a]蒽诱导的患有乳腺肿瘤的大鼠。结果显示玉米肽具有一定的抗乳腺癌作用， 且随着玉米肽剂量的增加，其抗肿瘤效果愈明显。杨永芳等研究了紫贻贝酶解多肽的体外 抗肿瘤活性，发现该肽具有抗肿瘤活性，可以下调肿瘤细胞中Bcl-2的表达。
[0004] 本发明提供一种具有体外抗肿瘤活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。
【发明内容】
[0005] 本发明选取两种肿瘤细胞MCF-7和HepG-2以及一种正常肝细胞L02为研究对象，使 用MTT法测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外抗肿瘤活性的合 成多肽，可应用于生物制药领域。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 一种十六肽QTDDNHSNVLWAGFSR，该十六肽的分子量为1846.8613，氨基酸序列为Gln-Thr-Asp-Asp-Asn-His-Ser-Asn-Val-Leu-Trp-Ala-Gly-Phe-Ser-Arg，其中， Gin表示英文名称为Glutamine，中文名称为谷氨酰胺的氨基酸的相应残基； Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基； Asp表示英文名称为Aspartic，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基； Asp表示英文名称为Aspartic，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基； Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基； His表示英文名称为Histidine，中文名称为组氨酸的氨基酸的相应残基； Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基； Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基； Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基； Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基； Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基； Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基； Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基； Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基； Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基； Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。
[0007] 进一步地，所述十六肽在浓度为lOO-SOOug/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞 Η印G-2的体外增殖抑制率分别为28.96%-54.52%和35.33%-61.36%。
[0008] 进一步地，所述十六肽在浓度为SOOug/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞 Η印G-2的体外增殖抑制率分别为54.52%和61.36%。
[0009] 进一步地，所述十六肽在浓度为lOO-SOOng/mL时，对人正常肝细胞L02的体外增殖 抑制率为5.78%-22.8%。
[0010]进一步地，所述十六肽在浓度为SOOpg/mL时，对人正常肝细胞L02的体外增殖抑制 率为22.8%。
[0011]本发明十六肽的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽 合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以 这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程， 即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标 产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
[0012] 本发明将终浓度为100-500 yg/rnL的合成多肽与两种肿瘤细胞MCF-7和HepG-2混 匀，孵育48 h后，经MTT法检测，对肿瘤细胞抑制率分别达到28.96%~54.52%和35.33%~ 61.36%。用100~500 ug/mL的合成多肽处理正常肝细胞L02后抑制率为5.78%~22.8%，表明 对正常肝细胞L02有较小的杀伤作用，能在生物医药领域中应用。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果： 本发明首次合成了该肽，并且采用MTT方法检测了合成多肽的体外抗肿瘤活性，所述合 成多肽具有一定的肿瘤细胞抑制能力，同时，合成多肽对正常肝细胞有较小的杀伤作用。
【附图说明】
[0014] 图 1 为合成十六肽 QTDDNHSNVLWAGFSR 的 HPLC 图。
[0015] 图 2 为合成十六肽 QTDDNHSNVLWAGFSR 的 ESI-MS 图。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于 此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0017] 多肽固相合成 选用高分子树脂(上海杰肽生物科技有限公司），按照十六肽的氨基酸序列6111-11^-Asp-Asp-Asn-His-Ser-Asn-Val-Leu-Trp-Ala-Gly-Phe-Ser-Arg 的特征，先将 Arg 的駿基以 共价键的形式与一个树脂相连，然后Arg的氨基和Ser的羧基缩水反应，处理后，再添加 Phe， Ser的氨基和Phe的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Gin氨基酸后，再切 除树脂即得到目标十六肽QTDDNHSNVLWAGFSR。采用高效液相色谱纯化得到最后的产品，纯 化过程使用kromasil Ci8_5(4.6*250mm)色谱柱，流速为1.0 mL/min。液相系统使用两个通 道，溶剂A:含有0.1% (体积)三氟乙酸的水;溶剂B:含有0.1% (体积)三氟乙酸的乙腈。 梯度洗脱如下：溶剂B的初始比例是2%(体积，下同），在0.0 lmin到30min内，溶剂B的比例上 升到65%，在30min到33min内，溶剂B的比例上升为100%，保持100%运行至40min停止，检测波 长214nm。收集多肽溶液，液氮速冷，然后冻干。得到纯度95%以上的产品，并经ESI-MS鉴定 结构(如图1、图2所示）。
[0018] 合成多肽的体外抑制活性 通过MTT比色法分析各多肽组分对乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞 L02的生长抑制作用。具体操作步骤如下： 1) 取对数生长期的细胞，经0.25%(体积）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的 完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5 X104个/mL， 加至96孔板中，每孔100 uL，于37 °C恒温C02培养箱中培养； 2) 培养24 h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200 uL的含有不同浓度待测 样品的DMEM基础培养基，并以DMEM为阴性对照，于