、DDA、MPL和PLGA均具备安全性。利用毕赤酵母GS115表达的 M.tb的许多蛋白的免疫原性弱，因而需要免疫刺激佐剂来辅助蛋白诱导的免疫反应。无标 签蛋白HBHA不含有除蛋白HBHA本身序列外的其他序列，配合佐剂PTM和DTM疫苗佐剂诱导较 好的免疫反应效果和抗感染保护效果。疫苗组诱导最高水平的HBHA特异的IgG，IgGl和 IgG2a抗体和IgG2a/IgGl比值(P〈0.05)，而BCG组的这些指标高于佐剂组(P〈0.05)。疫苗组 诱导的免疫反应倾向于TH1型免疫反应。PBS组，DTM和PTM疫苗佐剂组蛋白HBHA特异的IFN-γ水平最低。所有疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于BCG组(P〈0.05)。两种无标签 疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于对应的有标签疫苗组(P〈0.05) 1TM疫苗佐剂 辅助的疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组(P〈0.05)。 PTM/HBHA-无标签疫苗组诱导最高水平的蛋白HBHA特异的IFN-γ WBS组，DTM和PTM疫苗佐 剂组小鼠肺脏荷菌量最高，而BCG组肺脏荷菌量最低(P〈0.05) ATM疫苗佐剂辅助的疫苗组 肺脏荷菌量相当。PTM/HBHA-无标签疫苗组肺脏荷菌量显著高于PTM/HBHA-有标签疫苗组(P 〈0.05) WTM疫苗佐剂辅助的疫苗组肺脏荷菌量显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组（P〈 0.05)〇
[0029]以下为实施例：
[0030]实施例1有标签蛋白HBHA毕赤酵母表达载体的构建 [0031] 1、目的基因获取：
[0032]根据HBHA基因的全序列及表达载体pPIC9K质粒上的多克隆位点设计引物，引物序 列由上海生工生物公司合成，并按照说明将引物稀释成100pmolAiL，-20°C保存备用，其中， HBHA-Re引物加入了 18个his-Tag碱基。
[0033] HBHA-Fwd：(SnaB I)-CTACGTAATGGCTGAAAACTCGAAC
[0034] HBHA-Re: (EcoR I)-GGAATTCTTACACCACCACCACCACCACCTTCTGGGTGAC以合成基因为 模板，建立PCR反应体系，并进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
[0037] 94°C5min，然后 94°C50s，60°C40s，72°C50s，30 个循环，然后 72°C10min。1 % 琼脂糖 凝胶电泳观察结果并回收PCR产物，-20°C保存。
[0038] 2、重组质粒pPIC9K-HBHA的构建：
[0039]将回收的PCR产物和载体pPIC9K质粒分别进行双酶切，酶切体系为：
[0041 ]将回收的HBHA基因（大小约为600bp)与载体pPIC9K质粒按照如下条件进行连接反 应：
[0043] 室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coli ToplO菌株，经抗性筛选， 双酶切鉴定后获取阳性克隆。
[0044] 实施例2无标签HBHA基因的基因突变
[0045] 对获得的H37Rv HBHA基因 （SEQ ID N0:2)的序列进行遗传分析，将第267碱基由原 先的G突变为A，突变后的基因，其在毕赤酵母中的表达效率明显提高，以保证后续实验设计 的正常进行。基因突变由上海英俊生物公司完成并构建于pET30b( + )质粒。
[0046]实施例3无标签蛋白HBHA毕赤酵母表达载体的构建 [0047] 1、目的基因获取：
[0048]根据HBHA基因的全序列及原核表达载体pPIC9质粒上的多克隆位点设计引物，弓丨 物序列由上海生工生物公司合成，并按照说明将引物稀释成100pmolAiL，-20°C保存备用。
[0049] HBHA-Fwd：(Xho I)-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGGCTGAAAACTCGAAC
[0050] HBHA-Re: (EcoR I)-GGAATTCTTACTTCTGGGTGACCTTCTTGGC以合成基因为模板，建立 PCR反应体系，并进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
[0051]
[0052] 94°C5min，然后 94°C50s，60°C40s，72°C50s，30 个循环，然后 72°C10min。1 % 琼脂糖 凝胶电泳观察结果并回收PCR产物，-20°C保存。
[0053] 2、重组质粒pPIC9-HBHA的构建：
[0054]将回收的PCR产物和载体pPIC9质粒分别进行双酶切，酶切体系为：
[0056]将回收的HBHA基因（大小为600bp)与载体pPIC9质粒按照如下条件进行连接反应：
[0058] 室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coli ToplO菌株，经抗性筛选， 双酶切鉴定后获取阳性克隆。
[0059] 3、重组质粒pPIC9K-HBHA的构建：
[0060] 将PPIC9-HBHA和载体pPIC9K质粒分别进行双酶切，酶切体系为
[0062]将回收的HBHA基因（大小为850bp)与载体pPIC9K质粒按照如下条件进行连接反 应：
[0064] 室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coli ToplO菌株，经抗性筛选， 双酶切鉴定后获取阳性克隆。
[0065] 实施例4有标签和无标签蛋白HBHA的表达纯化
[0066] l、Sac I线性化有标签和无标签pPIC9K-HBHA
[0067]
[0068] 37°C孵育lh，加1/10体积3M醋酸钠，2倍体积无水乙醇，-20°C醇沉过夜。12000rpm 离心收集沉淀，加入10yL灭菌ddH20，-20°C保存。
[0069] 2、制备毕赤酵母GS115感受态细胞
[0070] 挑取酵母单菌落，接种于5mL Yro培养基（30°C250rpm/min孵育过夜）；取100yL菌 液接种于50mL YH)培养基（30°C，250rpm/min孵育，至0D600达到1.3~1.5);将菌液收集到 5 OmL无菌冰预冷的离心管（4°C 4 5 0 Or pm离心2 0m i η); 20mL冰预冷的无菌水重悬菌体（4°C 4500rpm离心20min);20mL冰预冷的无菌水重悬菌体(4°C4500rpm离心20min);2.5mL冰预冷 的lmol/L山梨醇重悬菌体(4°C4500rpm离心20min);将菌体转移到冰预冷的1.5mL的EP管， 0 · lmL冰预冷的lmo 1/L山梨醇重悬菌体;80yL/EP管(冰预冷的），-80°C保存。
[0071] 3、有标签和无标签PPIC9K-HBHA线性化质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞
[0072] 取80yL感受态细胞加入到10yL(约8yg)线性化有标签或无标签pPIC9K-HBHA质粒， 均匀混合，转至0.2cm电转化杯中，预冷1 Omin。电击：电压1.5kV，电容25yF，电阻200 Ω，电击 时间4.81118。电击后立即加入11111^11]1〇1/1山梨醇。相同条件下以口？1091(质粒转化感受态细胞 作阴性对照。转移电击杯中菌液到1.5mL离心管，30°C温育lh。将菌液涂布MD平板(30°C孵育 至单克隆出现），其余-40°C冻存。
[0073] 4、1 -5mg/mLG418筛选高拷贝转化子
[0074] lmL无菌水涂布MD平板，用涂布棒小心将菌落重悬于无菌水中，将重悬液转移到 50mL离心管中（震摇10s)，使用722分光光度计0D = 600测0D值（10D = 5*107/mL);将105个细 胞涂布含G418的YEPD平板，浓度为1，2，3，4，5mg/mL(30°C孵育至单克隆出现），剩余重悬液 15%甘油-80°(3冻存。
[0075] 5、PCR鉴定HBHA基因整合于毕赤酵母GS115染色体基因组 [0076] 1)提取毕赤酵母菌GS115总DNA基因组
[0077] 使用Takara公司酵母基因组DNA提取试剂盒提取毕赤酵母菌GS115总DNA基因组。
[0078] 2)PCR 反应
[0080] 94°C5min，然后 94°C50s，60°C40s，72°C