一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种可用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋 白，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)又称猪喘气病或猪气喘 病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种慢性、接触性传染病， 通过呼吸道在猪只和猪群之间传播，是猪场最常见的疫病之一。该病通常不引起猪的死亡， 但会使其出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞、饲料转化率降低、上 市时间延迟。本病一旦传入猪群，很难彻底清除，且该病通常与其他病毒或细菌引起猪呼吸 系统疾病综合征（Porcine respiration disease complex，PRDC)。根据流行病学资料，该 病广泛分布于包括发达国家在内的世界各地。在我国有超过95%的猪场均为Mhp血清阳性 [He Y，Xu MJ，Zhou DH，et al.Seroprevalence of Mycoplasma hyopneumoniae in pigs in subtropical southern China[J].Trop Anim Health Prod，2011，43(3):695-698.]〇 因此，Mhp是一种在我国广泛存在，长期危害养猪业并造成巨大损失的病原菌之一。
[0003] 该病用抗菌药物防控必须长期给药，不仅增加了饲养成本也易使感染菌株产生耐 药性。目前上市的Mhp疫苗包括灭活苗和弱毒苗。灭活苗能够降低肺部病理损伤，提高日增 重，激发机体的体液免疫，但几乎不产生细胞免疫，也不能阻止Mhp感染[Sibila Μ，Bernal R,Torrents D，et al.Effect of sow vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae on sow and piglet colonization and seroconversion,and pig lung lesions at slaughter[J] .Vet Microbiol，2008，127( 1-2) :165-170·]和在猪群间的传播[Meyns T， Dewulf J，de Kruif A，et al. Comparison of transmission of Mycoplasma hyopneumoniae in vaccinated and non-vaccinated populations[J].Vaccine，2006,24 (49-50)：7081-7186./Vi 1larreal I,Meyns T,Dewulf J,et al.The effect of vaccination on the transmission of Mycoplasma hyopneumoniae in pigs under field conditions[J]·Vet J，2011,188(1):48-52.]。我国江苏省农科院研发了猪支原体 肺炎弱毒活疫苗（168株）。该疫苗能有效激发机体的细胞免疫和局部粘膜免疫[周勇岐，赵 永前.猪支原体肺炎（168株）活疫苗的作用机理与应用[J].中国牧业通讯，2008，10 :49-52]。但需要采用肺内注射的方式，操作难度大，因此这种疫苗推广难度大。Mhp苛刻的培养 条件和培养时容易被其他细菌和支原体污染也使得上述两种疫苗成本较高。因此，研发新 型、有效、低成本的基因工程亚单位Mhp疫苗就成为防治猪支原体肺炎的重要手段。
[0004] Mhp进入猪呼吸道后通过和呼吸道上皮细胞纤毛的相互作用导致纤毛结构的破坏 和功能丧失，最终导致上皮细胞死亡。Mhp和纤毛相互作用的第一步是对宿主上皮细胞纤毛 的黏附。因此，黏附因子在Mhp的致病过程中有决定性作用。Mhpl07是Mhp的一个保守蛋白， 存在于已测序的所有Mhp中。mhpl07基因在168菌株中全长3102bp，编码1033个氨基酸，在第 219-222、1663-1665和2887-2889位处有编码色氨酸(Trp)的密码子TGAJhplO?蛋白分子量 为120kDa，能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合肝磷脂。肝磷脂能抑制Mhp对猪呼 吸道上皮细胞的黏附。Mhpl07与肝磷脂的结合进一步促进了 Mhp对纤毛的黏附。Mhpl07蛋白 C端还能与上皮细胞的纤连蛋白结合，纤连蛋白的主要作用是促进伤口的愈合。Mhpl07蛋白 C端与纤连蛋白的结合促进了Mhp对宿主细胞的损伤[Seymour LM，Falconer L，Deutscher AT，et al.Mhpl07is a member of the multifunctional adhesin family of Mycoplasma hyopneumoniae[J].J Biol 〇16111，2011，286(12):10097-10104.]。因此， Mhpl07-C片段在Mhp的致病中扮演重要角色，阻断Mhpl07-C的功能可能会有效降低Mhp对猪 的致病。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于预防猪支原体肺炎的疫苗。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0007] -种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID Ν0:1〇
[0008] 在根据本发明的一个实施方案中，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO: 8〇
[0009 ]本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
[0010] 1)通过PCR扩增Mhpl68菌株mhpl07基因的第1666~3099位的核苷酸序列；
[0011] 2)将步骤1)得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhpl07-C 的编码序列；
[0012] 3)将步骤2)得到的重组蛋白Mhpl07-c的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载 体；
[0013] 4)将步骤3)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组 蛋白 Mhpl07-C。
[0014]在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述的PCR扩增的引物为SEQ ID N0:4 和SEQ ID NO: 5;优选地，所述PCR的反应条件为:98°C预变性5min; 98°C变性lmin，50°C退火 lmin，72°C延伸 lmin 40s，30cycles ;72°C延伸6min。
[0015]在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的： [0016] a)将步骤1)得到的核苷酸序列连接到PMD?19-T载体，得到pMDTM19-mhpl07-C重组 质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5a，培养并诱导表达；
[0017] b)提取pMD?19-mhpl07-C重组质粒，并以所述pMD?19-mhpl07-C重组质粒为模板， 以SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhpl07-C的编码序 列mhpl07-CM;优选地，所述PCR的反应条件为:98°C预变性5min;98°C变性lmin 30s，60°C退 火lmin30s，72°C延伸4min 30s，20cycles ;72°C延伸 lOmin;
[0018] c)将上述PCR产物经Dpn I消化、胶回收后，转化宿主菌培养，提取质粒，选取经鉴 定序列正确的载体即为pMD?l 9-Mhp 107-CM载体；
[0019] d)将步骤c)得到的pMD?19-Mhpl07-CM载体以BamHI和Notl双酶切得到重组蛋白 Mhpl07-C的编码序列。
[0020]在根据本发明的一个实施方案中，在步骤a)中，所述步骤1)得到的核苷酸序列与 pMDl9?-T载体的摩尔比为3:1，连接反应体系如下:mhp 107-C 4.5yL，pMD?l9-T载体0.5yL， Solution I 5μΙ^16°〇连接lh。
[0021 ]在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒为PGEX-6P-2。
[0022] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和 PreScission Protease酶实现的。
[0023] 进一步地，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地 连接编码如上所述的重组蛋白的核苷酸序列形成;优选地，所述骨架质粒为PGEX-6P-2。
[0024] 本发明还提供了上述重组蛋白在制备用于预防猪支原体肺炎的药物中的应用;更 优选地，所述药物为用于预防猪支原体肺炎的亚单位疫苗。
[0025] 由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
[0026] 本发明的猪肺炎支原体的重组蛋白具