一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法
【专利摘要】一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品【技术领域】。其包括以下工艺步骤：1）种细胞的培养；2）制苗用细胞的悬浮培养；3）病毒的培养与收获；4）将上述收获的全悬病毒液与鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体进行混合吸附；5）将吸附后的抗原抗体复合物加入含免疫增强剂冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗。本发明制备疫苗，其特点是可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，所制备的病毒滴度高，所制备的疫苗批间差异小，产品质量稳定高效，副反应小，可全面提高疫苗质量。
【专利说明】一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬细胞为靶细胞，具有抗体依赖性增强作用(ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，免疫接种是目前控制该病的最主要措施。
[0003]灭活苗以其不会返强，不散毒而普遍用于免疫猪只，但是灭活疫苗采用全病毒包被，不可避免存在的异体蛋白，易引起变态反应，另外免疫需要剂量大，次数多，家畜免疫注射后应激反应较大，免疫抗体产生需要的时间长，免疫效果不是很明显。研究者对国产灭活疫苗进行了比较，发现部分国产灭活疫苗副反应较大，抗体最早产生时间不稳定，且维持时间短，国产灭活疫苗还不能提供稳定有效的保护。
[0004]与灭活疫苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫反应持续时间长且更有效，且弱毒苗产生抗体快速，能激活细胞免疫和体液免疫。弱毒疫苗可在猪体内复制，能引发更好的免疫效果，可以持续刺激猪体的免疫应答，以抵御病毒入侵，所以保护时间长，同时弱毒疫苗的免疫量要比灭活疫苗低，在减少副反应的同时也降低了生产成本。研究证明弱毒疫苗的交叉保护能力要优于灭活疫苗。因此 ，目前在暂时没有更好替代方法防控PRRS的情况下，PRRS弱毒疫苗对于防控PRRS爆发有积极的作用。但是普遍认为弱毒疫苗在安全方面存在不足，究其原因主要是因为蓝耳病病毒易发生变异，故选择优异的弱毒疫苗毒株显得尤为重要。目前，PRRSV在我国的流行特点总体上来说是以美洲型毒株为主，PRRSV经典毒株在我国各地依然流行，其造成的危害仍然存在。然而近年来我国高致病性蓝耳病频发，同时也混合着经典蓝耳病给蓝耳病的防制工作带来了困难。研究者通过系统进化树分析得知我国高致病性变异株与CH-1a具有较近的亲缘关系，有学者认为CH-1a在蓝耳病病毒从经典毒株演变到高致病性毒株的过程中充当了过度的角色。弱毒疫苗株CH-1R正是由CH-1a株驯化而来的，因此采用CH-1R制备的弱毒疫苗针对我国现流行的蓝耳病具有更强的交叉保护能力。
[0005]目前为止，蓝耳病疫苗生产主要还是通过转瓶培养单层细胞，接种蓝耳病病毒后获得病毒悬液，进而制备成蓝耳病疫苗。因转瓶培养法劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制等很大程度上影响了蓝耳病疫苗的产量，同时也导致了疫苗批次之间的不稳定性。为了克服现有PRRS弱毒疫苗生产技术所存在的缺陷，寻找简便、高效的病毒株以及其合适的生长培养条件对提高疫苗质量、降低生产成本具有重大意义。[0006]近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势:首先单位体积内有效工作细胞数量增加；其次全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；再者生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；最后生产疫苗所用的成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术的在国内的发展非常快。目前国内已有部分发明专利采用不同生物反应器系统和不同类型微载体进行蓝耳病疫苗的研制，但应用激流灌注式生物反应器-聚酯纤维纸片载体生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)，尚未见报道。
[0007]抗原抗体复合物疫苗是上世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照适当比例与抗原混合而成。抗原抗体复合物疫苗中抗体主要起着延缓病毒释放的作用，疫苗注射后，免疫复合物会被存在于脾脏的一种称为树突状淋巴细胞所捕获，继而抗原会缓慢释放。当母源抗体下降到疫苗可以出破的水平时，此时释放的疫苗抗原即可在靶器官定植，从而诱导免疫力。其优点在于安全性高，免疫效果比常规疫苗好；可突破母源抗体干扰，仔猪使用该类疫苗对其他疫苗免疫无干扰作用。
[0008]传统的抗原抗体复合物疫苗制作方法是将高免血清与法氏囊病毒结合，该方法制备疫苗所需大量高免血清抗体，需通过屠杀大量动物获得，费时费力，同时生产成本较高，导致疫苗价格较昂贵。
[0009]卵黄抗体的研究始于19世纪末20世纪初。1889年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年，Jukes的实验证明了母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。
[0010]卵黄抗体(IgY)分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含IOOmg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4°C条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集到一定量时再进行大规模地提纯IgY。
[0011]多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。
[0012]维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。
[0013]黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
[0014]法氏囊素(bursin,BS)是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa offabricius)中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。
[0015]本发明基于上述技术背景，提出一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗(CH-1R株)及其制备方法，该疫苗主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒与鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体按适当比例组合，加适量含免疫增强剂的冻干保护剂经真空冷冻干燥制成。通过该方法制备抗原抗体复合物疫苗，抗体获得途径简单，可提高动物福利，节省人力物力，大幅度降低生产成本，可大大提高活疫苗的体液免疫，产生较高的中和抗体。该疫苗可以用于仔猪免疫，能够突破母源抗体干扰，并且仔猪使用该疫苗后对其他疫苗无干扰，特别是猪肺炎支原体疫苗等，同时可诱导产生较强的粘膜免疫应答，提高保护率。
【发明内容】
[0016]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法的技术方案，采`用本方法制备疫苗，其特点是可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，所制备的病毒滴度高，所制备的疫苗批间差异小，产品质量稳定闻效，副反应小，可全面提闻疫苗质量。
[0017]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
1)种细胞的培养:用细胞生长液培养种子细胞；
2)制苗用细胞的悬浮培养:将步骤I)中培养好的种子细胞悬液接种至已验证的灌注袋中，吸附后在激流灌注式生物反应器中加入细胞生长液进行培养；
3)病毒的培养与收获:当细胞培养4~6天，将蓝耳病病毒CH-1R株悬液接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近O时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，测定毒价；
4)将上述收获的全悬病毒液与鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体进行混合吸
附；
5)将吸附后的抗原抗体复合物加入含免疫增强剂冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗。
[0018]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中种细胞为细胞MA104或细胞Marcl45。
[0019]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤
2)中培养条件为温度36~37°C，pH7.2~7.4，DO 30%~60%，循环转速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高，种子细胞接种量为3 X IO9个细胞。
[0020]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤
3)培养条件为温度36~37°C，pH7.5~7.6，DO 30%~50%，循环速度100~150rpm，蓝耳病病毒CH-1R株接种量为0.5~1.0MOI。
[0021]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2~7.4、DO为30%~60%,含糖4.0g/L,维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4~7.6、DO为30%~50%,含糖4.0g/L。
[0022]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4冲抗原抗体比例为1: 1，其中每毫升抗原含病毒TCID5tl为108_°，每毫升鸡抗猪呼吸与繁殖综合征病毒卵黄抗体效价为1:1024。
[0023]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤
4)中抗原抗体复合物孵育温度为4°C混合孵育16小时。
[0024]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤
5)中含免疫增强剂冻干保护剂为每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30~100g、中药黄酮20~60g、维生素组合6~10g 、法氏囊素2~16mg、明胶4~6g、鹿糖40~70g,所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到:生地、怀牛膝、桑白皮、茯苓、芦根、淫羊藿、生甘草和问荆，所述的维生素组合含有维生素B1、维生素C和维生素E。
[0025]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮的提取步骤为:
a、按生地10~30份、怀牛膝20~40份、桑白皮10~20份、获茶10~30份、芦根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、问荆10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时,熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清液经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；
g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
[0026]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合含有维生素BI 15~35%、维生素C 40~70%和维生素E 10~30%。[0027]所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得:取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，PH7.2灭菌冷PBS洗净；按1:1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入占重量2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。
[0028]本发明具有以下有益效果:
1.本发明中种细胞培养采用微型反应器，减少操作程序，缩短了种细胞培养时间。
[0029]2.本发明在接种细胞时采用梯度升高循环转速法，提高了细胞在微载体上的贴壁率。
[0030]3.本发明在培养细胞和病毒时根据糖耗情况随时补加营养，确保细胞的密度和病毒的滴度。
[0031]4.本发明采用了先进的悬浮培养设备与技术:(1)激流灌注式生物反应器，聚酯纤维纸片为微载体；(2)以糖耗为技术指标以及先进的控制系统；(3)在细胞培养方面增加了细胞密度；(4)在培养病毒时提高了病毒滴度；(5)使疫苗的效价大大提高，同时降低了疫苗的副反应。(6)采用了连续、完全封闭的细胞与病毒培养方式，完善了生产过程中的可控性，确保疫苗质量的稳定性，同时降低了疫苗生产的安全隐患。
[0032]5.本发明制备的抗原抗体复合物疫苗，可大大提高活疫苗的体液免疫，产生较高的中和抗体。该疫苗可以用于仔猪免疫，能够突破母源抗体干扰，并且仔猪使用该疫苗后对其他疫苗无干扰，特别是猪肺炎支原体疫苗等，同时可诱导产生较强的粘膜免疫应答，提高保护率。
[0033]6.卵黄抗体替代了`血清抗体制备抗原抗体复合物疫苗，抗体获得途径简单，可提高动物福利，节省人力物力，大幅度降低生产成本。
[0034]7.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。
【具体实施方式】
[0035]为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
[0036]实施例1用激流灌注式反应器AP20C型生产猪繁殖与呼吸综合征病病毒(CH-1R株)，包括如下步骤:
Cl)生物反应器的选择:激流式反应器AP-20C型，体积为10L。
[0037](2)疫苗毒株的选择:选用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株，微生物保藏号:CGMCC N0.1883，保藏时间为2006年12月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其为现有毒株。
[0038](3)种细胞的培养:利用T175方瓶繁殖Marc-145或MA104细胞，一般按1:3~1:5传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞约3X IO7个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为37°C，转速设置为42rpm。[0039](4)制苗用细胞的悬浮培养:首先准备生物反应器:检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入培养液，循环24小时进行系统的无菌检验。验证合格后，将步骤(3)中培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下按3 X IO9个细胞接种至灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，然后开始150rpm循环，培养条件为温度36~37°C，pH7.2~7.4，DO 30%~60%。培养过程中适时测定糖耗，当残糖量至2g/L时，进行补糖或补加培养液。
[0040](5)所述步骤(3)和步骤(4)细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，细胞生长液的pH 为 7.2 ~7.4，DO 为 30% ~60%,含糖约 4.0g/L。
[0041](6)病毒的培养与收获:当细胞培养4~6天，当糖耗达到最大时，将蓝耳病病毒(CH-1R株CGMCC N0.1883)悬液按0.5~1.0MOI的接种量接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养，培养条件为温度36~37°C，pH7.5~7.6，D030%~50%，循环速度100~150rpm。接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近O时，即开始收获病毒。收获病毒后，反复冻融灌注袋内细胞，收获全悬病毒液。
[0042](7)所述步骤(6)中的细胞维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，维持液的pH为7.4~7.6，DO 为 30% ~50%,含糖约 4.0g/L。
[0043](8)病毒液的检测
无菌检验:按《中国兽药典》进行，应无细菌生长。
[0044]病毒含量测定:用2%胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10' I O—8、10_9三个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长良好的Marc-145细胞单层8孔，每孔0.1ml。同时设病毒对照和细胞对照孔，置37°C、5%C02培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID5tl，病毒含量应≥108 °TCID50/0.1ml。
[0045]实施例2中药多糖的制备，包括以下步骤:
a、按生地10~30份、怀牛膝20~40份、桑白皮10~20份、获茶10~30份、芦根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、问荆10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时,熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清液经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复合中药多糖冻干粉。
[0046]实施例3中药黄酮的制备，包括以下步骤:
a、按生地10~30份、怀牛膝20~40份、桑白皮10~20份、获茶10~30份、芦根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、问荆10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制.2小时,熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，上清即得粗体中药黄酮；
d、将c中上清进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
[0047]实施例4鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体的制备，包括以下步骤:
a、用猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫健康蛋鸡。免疫程序为首次胸部肌肉免疫
.0.5ml/只；首免一周后进行二次免疫,胸部肌肉免疫1.0ml/只；二次免疫后两周进行三次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只。
[0048]b、三次免疫后两周开始监测高免蛋抗体效价，当高免蛋中抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体琼脂扩散效价达1:32时，采集合格高免蛋。
[0049]C、卵黄分离:将b中采集的无破损高免蛋用0.1%新洁尔灭清洗消毒，破壳分离卵黄，收集卵黄于卵黄储罐中，搅拌混匀。
[0050]d、酸化水提:按1:11将纯化水加至酸化提取罐中，将c中卵黄注入酸化提取罐中，搅拌均匀，测定卵黄稀释液pH，用IM稀盐酸或IM氢氧化钠调节pH至6.0，4°C静止孵育24小时。
[0051]e、浓缩超滤:吸取d中上清，经连续流离心机1000Orpm离心，离心后上清经30kd
密理博超滤浓缩装置进行60-80倍浓缩。
[0052]f、将e中卵黄抗体浓缩液经冷冻真空干燥制成卵黄抗体冻干粉。
[0053]实施例5法氏囊素的制备，包括以下步骤:
a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，PH7.2灭菌冷PBS洗净。
[0054]b、称量法氏囊重量，按1:1 (ff:V)比例加入PH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。
[0055]C、匀衆液中加入2.5%的胰蛋白酶,反复冻融3次，12000rpm离心20min,弃沉淀。
[0056]d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。
[0057]e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥制成法氏囊素冻干粉。
[0058]实施例6含免疫增强剂的冻干保护剂，每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分:中药多糖50g、中药黄酮50g、维生素组合8g (其中维生素BI 1.8g，维生素C 4.6g，维生素E
.1.6g)、法氏囊素15mg、5g明胶、50g鹿糖。磷酸缓冲液由氯化钠6~IOg,氯化钾0.05~.0.5g，磷酸氢二钠I~1.2g，磷酸二氢钾0.05~0.5g，氯化钙0.05~0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05~0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟得到。
[0059]实施例7含免疫增强剂的冻干保护剂，每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分:中药多糖100g、中药黄酮60g、维生素组合IOg (其中维生素BI 2g，维生素C 6g，维生素E 2g)、法氏囊素16mg、6g明胶、70g鹿糖。磷酸缓冲液由氯化钠6~IOg,氯化钾0.05~0.5g,磷酸氢二钠I~1.2g，磷酸二氢钾0.05~0.5g，氯化钙0.05~0.2g，含6个结晶水的氯化镁
.0.05~0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟得到。[0060]实施例8 —种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗(CH-1R株)的制备方法，包括以下步骤:
a、将猪繁殖与呼吸综合征病毒悬液(CH-1R株)用灭菌PBS调至病毒含量为108 0TCID50/lmL.[0061]b、将鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体用灭菌PBS调至每毫升抗体效价为1:1024。
[0062]C、将a中猪繁殖与呼吸综合征病毒悬液与b中的鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体按1:1在4°c下进行混合吸附16小时。
[0063]d、将吸附后的抗原抗体复合物按1:1 (V:V)比例加入实施例6或7制得的含免疫增强剂的冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗(CH-1R株)。
[0064]e、成品检验
(1)成品检验结果
按照“猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗(CH-1R株)制造及检验试行规程”和《中华人民共和国兽药典》(2010版)相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表1:
表1成品检验结果
【权利要求】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤: 1)种细胞的培养:用细胞生长液培养种子细胞； 2)制苗用细胞的悬浮培养:将步骤I)中培养好的种子细胞悬液接种至已验证的灌注袋中，吸附后在激流灌注式生物反应器中加入细胞生长液进行培养； 3)病毒的培养与收获:当细胞培养4~6天，将蓝耳病病毒CH-1R株悬液接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近O时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，测定毒价； 4)将上述收获的全悬病毒液与鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体进行混合吸附； 5)将吸附后的抗原抗体复合物加入含免疫增强剂冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗。
2.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤I)中种细胞为细胞MA104或细胞Marcl45。
3.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中培养条件为温度36~37°C，pH7.2~7.4，DO 30%~60%，循环转速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高,种子细胞接种量为3 X IO9个细胞。
4.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤3)培养条件为温度36~37°C，pH7.5~7.6，DO 30%~50%，循环速度100~150rpm,蓝耳病病毒CH-1R株接种量为0.5~1.0MOI。
5.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2~7.4、DO为30%~60%，含糖4.0g/L,维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4~7.6、DO为30%~50%,含糖4.0g/L0
6.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中抗原抗体比例为1:1，其中每毫升抗原含病毒TCID5tl为108_°，每毫升鸡抗猪呼吸与繁殖综合征病毒卵黄抗体效价为1:1024。
7.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中抗原抗体复合物孵育温度为4°C混合孵育16小时。
8.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤5)中含免疫增强剂冻干保护剂为每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30~100g、中药黄酮20~60g、维生素组合6~10g、法氏囊素2~16mg、明胶4~6g、鹿糖40~70g，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到:生地、怀牛膝、桑白皮、茯苓、芦根、淫羊藿、生甘草和问荆，所述的维生素组合含有维生素B1、维生素C和维生素E。
9.如权利要求8所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮的提取步骤为: a、按生地10~30份、怀牛膝20~40份、桑白皮10~20份、获茶10~30份、芦根10~30份、淫羊藿10~30份、生甘草10~20份、问荆10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时,熬制过程中每10分钟搅拌一次；b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮； d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖； g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
10.如权利要求8所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合含有维生素BI 15~35%、维生素C 40~70%和维生素E 10~30%。
11.如权利要求8所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得:取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1:1比例`加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入占重量2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。
【文档编号】A61K39/12GK103495166SQ201310426660
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】李阳, 闫艳丽, 刘雪, 王二先, 徐晓艳, 盛璐丝 申请人:浙江美保龙生物技术有限公司