一株猪鼻支原体菌株、疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一株支原体属猪鼻支原体LYH株，以及由该猪鼻支原体LYH株制备的疫苗组合物，尤其是一种包括猪鼻支原体、猪肺炎支原体的疫苗组合物。该疫苗组合物可以有效防治猪鼻支原体、猪肺炎支原体单独感染或混合感染引起的猪地方流行性肺炎（SEP），尤其在混合感染情况下，该疫苗组合物的免疫效果明显超过各单苗的免疫效果。CCTCC NO：V 2013342013.08.20CCTCC NO：M 20122302012.06.13
【专利说明】一株猪鼻支原体菌株、疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新的猪鼻支原体菌株、疫苗组合物，以及其制备方法和应用，属于 兽用疫苗领域。
【背景技术】
[0002] 猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis，Mhr)是小猪上呼吸道中的常见寄生病原 (Ross and Young于1993年检测），在猪群中检出率高，单独并不致病。Switzer于1953、 1954U955年先后分离到该支原体，并对其正式命名为猪鼻支原体（Mhr)。猪鼻支原体 (Mhr)的感染主要通过呼吸道传播，通常是由母猪或大猪传给小猪。和猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) -样，猪鼻支原体能够粘附到呼吸道的纤毛上皮细胞， 破坏纤毛屏障造成其他细菌继发感染引起猪肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、咽鼓管炎、耳炎、 结膜炎等。目前对该病原的预防还未有疫苗产品上市，加之不同地方分离的菌株致病性差 异明显，筛选合适的疫苗株变得极其困难。
[0003] 猪喘气病又称猪支原体肺炎或猪地方流行性肺炎（SEP)，是由猪肺炎支原体引起 的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生 长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶、尖叶、膈叶 和中间叶出现"胰样变"和"肉样变"为其特征。本病发病率高，死亡率低，主要危害是使猪 群生长受阻和饲料转化率大幅下降，并能引起继发感染，是造成养猪经济损失最重要的疾 病之一。在国内养殖场中猪肺炎支原体、猪鼻支原体往往混合感染，某些猪鼻支原体菌株会 促进猪地方流行性肺炎的发生。此外，有研究者在一起免疫猪肺炎支原体疫苗后感染猪地 方流行性肺炎的病理解剖中仅分离到了猪鼻支原体，通过进一步的人工感染试验证实，意 外地发现猪鼻支原体可以单独引发猪地方流行性肺炎。
[0004] 临床发现，猪鼻支原体的感染率在呈逐年增加趋势。为此，急需开发一种猪鼻支原 体疫苗，用来预防猪鼻支原体病原，尤其是预防猪鼻支原体引起的猪地方流行性肺炎。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种支原体属猪鼻支原体分离株，名称为 支原体属猪鼻支原体LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH)，其保藏编号为CCTCC No. V201334,保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日 期：2013年8月20日。
[0006] 本发明中所用术语"支原体属猪鼻支原体"也简称为"猪鼻支原体"。
[0007] 类似的，本发明中所用术语"支原体属猪鼻支原体LYH株"也简称为"猪鼻支原体 LYH 株"。
[0008] 本发明还提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪鼻支原体抗原以 及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂。
[0009] 优选地，所述猪鼻支原体抗原为含有猪鼻支原体LYH株或其培养物的减毒全菌抗 原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。所述疫苗组合物为含有猪鼻 支原体LYH株或其培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗或基因工程疫 苗。
[0010] 优选地，所述疫苗组合物包含佐剂，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、 GelOl、蜂胶、ISA206、ISA760VG。更优选地，所述佐剂为卡波姆、GelOl、ISA206、ISA760VG。 进一步优选地，所述佐剂为卡波姆、GelOl。最优选地，所述佐剂为GelOl。
[0011] 优选地，所述佐剂在疫苗组合物中为10?60% (v/v)。
[0012] 优选地，在所述疫苗组合物中，所述猪鼻支原体含量为1〇8?KTCXU/ml。更优选 地，在所述疫苗组合物中，所述猪鼻支原体含量为4. 5X 108(XU/ml。
[0013] 本发明所用的术语"培养物"是猪鼻支原体的不同代次传代培养物，本领域技术人 员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
[0014] 本发明所用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"可互换使用，其是指包含至少一种在 动物中诱导免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。
[0015] 本发明所用的术语"活疫苗"指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上 复制的病原体制备的疫苗。本发明所用的术语"减毒"用于指以使病原丧失致病性、但保持 免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或 体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失 以使毒力减弱。
[0016] 本发明所用的术语"灭活疫苗"，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力 的灭活病原体的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可 以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解 型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
[0017] 本发明所用的术语"亚单位疫苗"指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗 原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起 副反应的可能性小。
[0018] 本发明所用的术语"合成肽疫苗"指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽，即用 人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫 苗。
[0019] 本发明的另一个目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪鼻支原体相 关疾病的药物中的应用。
[0020] 本发明所用术语"猪鼻支原体相关疾病"用于指由猪鼻支原体感染引起的疾病。它 的例子包括隐性感染、继发感染猪鼻支原体引起的相关症状，包括猪地方流行性肺炎等，但 不限于此。
[0021] 本发明所用术语"预防"指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪鼻支原体感 染或推迟疾病发作的所有行为。术语"治疗"指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪鼻 支原体感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
[0022] 此外，本发明的疫苗组合物可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括 猪鼻支原体感染在内的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
[0023] 本发明所用术语"联合疫苗"用于指从本发明的猪鼻支原体与至少一种不同支原 体的支原体混合物制备的疫苗。术语"复合疫苗"指的是由本发明的猪鼻支原体与病毒或 /和细菌混合或组合制备的疫苗。
[0024] 本发明的又一主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免 疫量的猪鼻支原体抗原、免疫量的猪肺炎支原体抗原和药学上可接受的载体。所述药学上 可接受的载体包括防腐剂、稀释剂、佐剂。
[0025] 优选地，所述猪鼻支原体抗原为猪鼻支原体或其培养物的减毒全菌抗原、灭活全 菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体 其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0026] 本发明所用术语"猪鼻支原体抗原"是指由猪鼻支原体分离株制备的抗原，所述抗 原接种猪可诱导、刺激或增强抗猪鼻支原体感染的免疫应答。优选地，所述猪鼻支原体抗原 包括减毒的活的猪鼻支原体抗原、灭活的猪鼻支原体抗原、含猪鼻支原体的免疫原性氨基 酸序列的亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0027] 本发明所用术语"猪肺炎支原体抗原"是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺 激或增强抗猪支原体肺炎的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗 原为灭活的猪肺炎支原体抗原、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体抗原，含猪肺炎支原体 的免疫原性氨基酸序列的亚单位抗原，或含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽或 基因工程抗原。
[0028] 优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体为支原体属猪鼻支原体LYH株；猪肺炎支 原体为猪肺炎支原体HN0613。
[0029] 本发明所述支原体属猪鼻支原体LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH)， 保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO : V201334,保藏日期为2013年08月20日。
[0030] 本发明所述猪肺炎支原体 HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)， 系本实验室分尚，保存于中国典型培养物保减中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保 藏号为CCTCC NO :M2012230,保藏日期为2012年6月13日。
[0031] 本发明所述猪肺炎支原体还可以用以下猪肺炎支原体中的一种或几种：如勃林 格殷格翰公司的lngelvaC?M.hy〇 (J株）；哈药集团公司的Respisure和RespisureOne (p-5722-3株）；美国先灵葆雅的Myco Silencer? (J株）；西班牙海博莱生物大药厂的 MYPRAVAC sns (J株）；美国普泰克公司的MycoGard (P株）；美国辉瑞公司的RespiFend ΜΗ (P-5722-3株）；梅里亚动物保健公司的猪克喘（BQ14株)。
[0032] 优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体抗原和猪肺炎支原体抗原的比例为l:l(v/ V)。
[0033] 优选地，所述疫苗组合物中猪鼻支原体抗原含量为灭活前108?K^CXU/ml ;猪肺 炎支原体抗原含量为灭活前1〇8?KTCXU/ml。
[0034] 更优选地，所述疫苗组合物中所述猪鼻支原体抗原为灭活前4. 5 X108(XU/ml的灭 活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前4. 5X108CCU/ml的灭活猪 肺炎支原体HN0613全菌抗原；或
[0035] 所述猪鼻支原体抗原为灭活前KTCCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所 述猪肺炎支原体抗原为灭活前l〇lclCCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原。
[0036] 优选地，所述疫苗组合物包括佐剂，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、 GelOl、蜂胶、ISA206、ISA760VG。更优选地，所述佐剂为卡波姆、GelOl、ISA206、ISA760VG。 进一步优选地，所述佐剂为卡波姆、GelOl。最优选地，所述佐剂为GelOl。
[0037] 优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中为10?60%(v/v)。
[0038] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：
[0039] 1)培养增殖所述猪鼻支原体菌液，浓缩、灭活；
[0040] 2)培养增殖猪肺炎支原体菌液，浓缩、灭活；
[0041] 3)按比例混合所述两种抗原液，添加药学上可接受的载体，混匀。
[0042] 本发明又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪地方流行性肺炎 (SEP)的药物中的应用。
[0043] 本发明提供了一种猪鼻支原体分离株以及由其制备的疫苗组合物。该猪鼻支原体 分离株制得的疫苗组合物对引起猪地方流行性肺炎的猪鼻支原体显示出显著的免疫特性。 [0044] 此外，本发明还提供了一种含猪鼻支原体、猪肺炎支原体的疫苗组合物及其制备 方法和应用。该疫苗组合物具有以下优点：
[0045] 1)本发明研究过程中意外发现猪鼻支原体单独感染可引发猪地方流行性肺炎 (SEP)，而猪鼻支原体、猪肺炎支原体往往混合感染，具有明显的协同作用，本发明的含有猪 鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物可以有效防治猪鼻支原体、猪肺炎支原体 单独感染或混合感染引起的猪地方流行性肺炎；在发生混合感染时，该疫苗组合物的免疫 效果明显超过注射猪鼻支原体疫苗单苗或猪肺炎支原体疫苗单苗的免疫效果，可以显著提 升SEP的防控效果，更适合于临床应用。
[0046] 2)本发明的含猪鼻支原体抗原、猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物，在对猪注射免 疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，且为一针剂注射，因此，本发明的疫苗组合物副 反应小、安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应；同时具有简化免疫程序、降 低免疫成本、更加经济可靠、生产工艺简单等优点。
[0047] 3)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方 便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，本发明提供的含猪鼻支原 体抗原、猪肺炎支原体抗原的联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到 全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下 进行，即所谓的"冷链"，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用 联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0049] 本发明中的术语"头份"是指每头猪注射的疫苗量。
[0050]本发明中所述的 "TCID5(I"（50%tissue culture infective dose)是指半数细胞 培养物感染量，是表不病毒感染力的一种表不方式。
[0051] 实施例1、猪鼻支原体疫苗组合物的制备
[0052] 1.菌(毒）株的来源
[0053] 支原体属猪鼻支原体LYH株，系本实验室分离，保存于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO :V201334,保藏日期为2013年08月 20臼。
[0054] 2.猪鼻支原体疫苗半成品的制备及检验
[0055] 2. 1生产用种子的制备
[0056] 将猪鼻支原体LYH株冻干菌种按10%接种液体培养基，置37°C培养1?3日，待培 养基颜色变黄，pH值下降至6. 8?7. 0时收获菌液作为一级种子。
[0057] 将一级种子按5%接种液体培养基，置37°C培养1?3日，待培养基颜色变黄，pH 值下降至6. 8?7. 0时收获菌液作为二级种子。
[0058] 液体培养基的配方（按1065ml计）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值到 7. 4, 121°C灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank' s平衡盐溶液（10X)40ml， 0. 25%酚红10ml马血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青 霉素10ml，1%醋酸铊溶液25ml。
[0059] 固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar (纯化琼脂，终浓度为 1. 4%)即可。
[0060] 2. 2制苗用菌液的制备
[0061] 将猪鼻支原体二级种子液按5%?10%(v/v)接种于液体培养基中。37°C下培养 1?3日，待液体培养基颜色变黄，pH值下降至6. 8?7. 0时收获菌液。
[0062] 2. 3含量测定
[0063] 将待检猪鼻支原体菌液用Friis培养基进行10倍系列稀释，即0. 2ml待检菌液加 入装有1. 8mlFriis培养基的西林瓶中混匀，然后连续稀释成ΚΓ1至10_12,并设Friis培养 基作为对照。待检样品设2个重复。置37°C培养7日，每日观察Friis培养基颜色变化，在 空白对照颜色不变的情况下，稀释培养物颜色变黄并呈轻度均一浑浊的最高稀释度为待测 菌液的C⑶滴度。取2个重复的平均值。
[0064] 2. 4浓缩和含量测定
[0065] 将制苗用猪鼻支原体菌液用密理博（Millipore公司）膜包(分子截留量为lOOKda 道尔顿）进行浓缩，活菌计数。制备的猪鼻支原体浓缩抗原灭活前含量为l〇nCCU/ml。
[0066] 2. 5 灭活
[0067] 取合格的猪鼻支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0. 2% (v/v)的甲醛 溶液，置37°C灭活24小时，每隔3?4小时搅拌一次。
[0068] 3疫苗的配制
[0069] 3. 1防腐剂的配制
[0070] 1% (w/v)的硫柳汞（国药集团化学试剂有限公司20130508)水溶液
[0071] 3. 2稀释剂的配制
[0072] 无菌的PBS (0· 01Μ，ρΗ=0· 02)缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0· 25g 氯化钾、3. 63g磷酸氢二钠、0. 24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121°C高压灭菌30min备用。
[0073] 3. 3佐剂的配制
[0074] GelOl (法国 SEPPIC 公司 20130302)，121°C高压灭菌 30min 备用。
[0075] 3· 4 配苗
[0076] 取上述制备的猪鼻支原体浓缩灭活抗原，用无菌PBS(0. 01mol/L，pH值7· 2?7· 4) 稀释至所需体积，然后将抗原液与GelOl佐剂按90:10 (ν/ν)混合，以500r/min搅拌30分 钟，结束前加入终浓度为〇. 01%的硫柳汞即可。
[0077] 各猪鼻支原体疫苗的配比如表1所示。
[0078] 表1各猪鼻支原体疫苗的配比
[0079]
【权利要求】
1. 一种猪鼻支原体，所述猪鼻支原体为保藏号为CCTCC NO.V201334的支原体属猪鼻 支原体LYH株，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日 期：2013年8月20日。
2. -种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的猪鼻支原体抗原以及 药学上可接受的载体。
3. 根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原为含有猪鼻 支原体LYH株或其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因 工程抗原。
4. 一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的猪鼻支原体抗原、免疫 量的猪肺炎支原体抗原和药学上可接受的载体。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原为猪鼻支原 体或其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原； 所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体其培养物的减毒全菌抗原、灭活全菌抗原、亚单位 抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
6. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体为猪鼻支原体LYH 株，所述猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613。
7. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原和猪肺炎支 原体抗原的比例为1:1 (v/v)。
8. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原含量为灭活 前108?K^CXU/ml ;所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前108?K^CXU/ml。
9. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪鼻支原体抗原为灭活前 4.5X108CCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前 4. 5X 108CCU/ml的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原；或所述猪鼻支原体抗原为灭活前 KTCCU/ml的灭活猪鼻支原体LYH株全菌抗原，所述猪肺炎支原体抗原为灭活前KTCCU/ml 的灭活猪肺炎支原体HN0613全菌抗原。
10. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括佐剂，所述 佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GelOl、蜂胶、ISA206、ISA760VG。
11. 一种制备权利要求4?10任一项所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： 1) 培养增殖所述猪肺炎支原体菌液，灭活； 2) 培养增殖所述猪鼻支原体菌液，灭活； 3) 按比例混合所述两种抗原液，添加药学上可接受的载体，混匀。
12. 如权利要求4?10任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪地方流行性肺炎 (SEP)的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/116GK104250623SQ201310706685
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司