用于减弱牲畜体内牛支原体肺炎的猪肺炎支原体疫苗和方法

专利名称：用于减弱牲畜体内牛支原体肺炎的猪肺炎支原体疫苗和方法
技术领域：
本发明涉及通过给药动物有效量的猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)疫苗来治疗或预防动物体内由牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)感染所致的疾病或病症的方法。所述猪肺炎支原体疫苗可以是灭活后的完整细胞或该细胞的一部分，或者是经过修饰的活的制品，亚单位疫苗，或者核酸或DNA疫苗。依照本发明给药的猪肺炎支原体疫苗可以是合成的或重组制备的。
背景技术：
牛支原体是一种圈养的或集中饲养(intensively reared)的产肉牲畜(cattle)或产奶牲畜体内的牛病原体。报道最多的临床表现是小牛(calves)的肺炎，其常伴有关节炎，又称肺炎-关节炎综合征。其病原学作用还与乳腺炎，耳炎以及母牛(cow)和公牛(bull)的生殖疾病或病症有关。牛呼吸疾病所导致的死亡率中高达36％与牛支原体有关，所以牛支原体诱导的呼吸疾病与重大经济损失相关联。为了降低死亡率，常使用抗生素治疗，因为目前尚无完全得到许可的疫苗。对牛支原体疾病的预防也可以降低动物对其它呼吸疾病的易感性。所以，有必要开发有效且安全的抗牛支原体的疫苗。猪肺炎支原体是一种细菌性病原体，可导致猪的地方性动物病性肺炎。大多数已知的抗猪肺炎支原体的疫苗是基于灭活的完整猪肺炎支原体细胞制品。其它的抗猪肺炎支原体疫苗包括亚单位疫苗(其由猪肺炎支原体衍生的蛋白，多肽或这些蛋白或多肽的免疫原性片段组成)和DNA疫苗(其由编码一种或多种猪肺炎支原体衍生蛋白或多肽及其免疫原性片段的DNA组成)。
灭活的完整细胞形式的猪肺炎支原体疫苗的实例包括RESPISURE和STELLAMUNE，它们可从Pfizer Inc.，USA购置。
已报道过多种猪肺炎支原体蛋白。国际专利申请WO 96/28472描述了6种猪肺炎支原体蛋白抗原，它们的分子量是46-48，52-54，60-64，72-75，90-94和110-114千道尔顿，该文献还公开了52-54，60-64和72-75千道尔顿抗原的部分蛋白序列和46-48千道尔顿抗原的全长核苷酸和氨基酸序列。
对编码猪肺炎支原体蛋白P46的基因，即p46进行的克隆可参见Futo等，J.Bacteriol 1771915-1917(1995)和欧洲专利申请0 475 185 A1。
Wise和Kim(1987，J.Bacteriol.1695546-5555)报道了猪肺炎支原体中的四种完整(integral)膜蛋白，命名为p70，p65(P65，出处同上)，p50和p44，后三种有脂质共价附着，能诱导很强的体液免疫应答。但对这种免疫应答的保护性效果没作研究。编码P65蛋白的基因已经克隆出，其序列以及在疫苗和诊断试剂中的用途可参见美国专利5,788,962。
国际专利申请WO 91/15593描述了猪肺炎支原体的5种蛋白，它们的表观分子量为105，90，85，70和43千道尔顿。编码85千道尔顿蛋白(蛋白C)的基因的全长序列，以及编码其它四种蛋白的部分核苷酸序列也已公开。
Faulds的美国专利5,252,328公开了多种免疫反应性猪肺炎支原体蛋白的氨基末端序列，其分子量是36，41，44，48，64，68，74.5，79，88.5，96和121千道尔顿。基于电泳迁移率鉴定的但没有公开其蛋白序列的其它蛋白的表观分子量是22.5，34和52千道尔顿。美国专利5,252,328建议在抗猪肺炎支原体感染的疫苗制剂中使用这些蛋白，但没有报道疫苗试验的结果。
国际专利申请WO 95/09870公开了纯化猪肺炎支原体粘附素的生物化学方法，所述粘附素是支原体的完整膜蛋白，负责粘附到宿主上呼吸道上皮的纤毛上。WO 95/09870也建议了针对这些蛋白进行的检测和应用，例如在疫苗和诊断试剂中的应用。
King等的研究报告(1997；Vaccine 1525-35)公开了Mhp1，这是一种124千道尔顿的粘附素，是P97的一种株变体。
P97的94千道尔顿变体由Wilton等鉴定(1998，Microbiology 1441931-1943)。另外，有证据表明p97基因是一种操纵子的一部分，该操纵子也编码预计分子量为102千道尔顿、命名为P102的第二种蛋白(Hsu et al.，1998，Gene 21413-23)。Minion和Hsu在国际专利申请WO 99/26664中提示了P102在抗猪肺炎支原体感染的疫苗中的应用，但没有报告疫苗试验。
在本发明之前，尚无人认识到猪肺炎支原体疫苗能对牛提供抗御牛支原体所导致的疾病的保护性作用。
发明概述本发明提供一种治疗或预防动物体内由牛支原体感染所导致的疾病或病症的方法，该方法包括给药动物有效量的猪肺炎支原体疫苗。
本发明进一步提供了一种能抗御动物(如产奶的牲畜，尤其是牛)的肺炎的保护方法，例如预防和降低肺损伤。
本发明进一步提供了一种使用猪肺炎支原体疫苗进行免疫接种的方法，该方法增加小牛的免疫能力，从而增加对其它BRD病原体的抗性，例如降低对下列病原体所导致的感染和疾病的易感性，所述病原体包括但不限于牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus type 1(BHV-1))，牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrhea virus(BVDV))，牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncitialvirus(BRSV))，副流感病毒(parainfluenza virus(P13))，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)，蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)，无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)，加利福尼亚支原体(Mycoplasma californicum)，牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)，殊异支原体(Mycoplasma dispar)，犬支原体(Mycoplasma canis)以及Manheimiahaemolytica。本发明也涉及猪肺炎支原体疫苗，以及涉及给药动物有效量的猪肺炎支原体疫苗和可药用载体、以便从感染的牛群(herds)中去除牲畜支原体的方法。
本发明方法中所用的猪肺炎支原体疫苗可以是完整或部分细胞的制品(例如菌苗或经过修饰的活制品)，亚单位疫苗(例如，由猪肺炎支原体衍生的蛋白，多肽或其免疫原性片段组成的亚单位疫苗)，DNA疫苗(例如编码猪肺炎支原体衍生的蛋白，多肽或其免疫原性片段的DNA)。猪肺炎支原体多肽，蛋白，其免疫原性片段，以及提供在猪肺炎支原体疫苗中的基因或核酸可使用本领域已知技术进行人工合成或重组制备。
依照本发明给药的猪肺炎支原体疫苗还可包括另外的成分，如佐剂，还可以有第二种或更多种在组合疫苗中用到的抗原。所述第二种抗原可选自如下，包括但不限于这些牛疱疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多杀巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈状支原体，无乳支原体，加利福尼亚支原体，牛鼻支原体，殊异支原体，犬支原体以及Manheimia haemolytica。


图1描述在即将进行实验性牛支原体攻击之前和刚刚攻击之后小牛的平均体温。在攻击之前A组小牛接种了两剂猪肺炎支原体菌苗。B组小牛在攻击之前接种的是安慰剂。
发明详述本发明提供了一种治疗或预防动物体内由牛支原体感染所导致的疾病或病症的方法，该方法是给药所述动物有效量的猪肺炎支原体疫苗。
在一些实施方案中，本发明方法中所用的疫苗包含灭活的部分或完整猪肺炎支原体细胞的制品(菌苗)或经过修饰的活疫苗以及可药用载体，或者是灭活的部分或完整猪肺炎支原体细胞的制品(菌苗)或经过修饰的活疫苗以及佐剂。
在其它具体实施方案中，本发明所用的疫苗包含免疫原性蛋白或多肽或其片段以及可药用载体，或者免疫原性蛋白或多肽或其片段以及佐剂。
为清楚地公开，而非旨在限制，将本发明的详细描述分为以下多个部分，以描述或举例说明本发明的一些特征，实施方案或应用。
定义或缩写本文所用的针对牛支原体感染而言的术语“治疗或预防”是指抑制牛支原体细菌的繁殖，抑制牛支原体的排出或传播，或防止牛支原体在其宿主中定居下来，以及减轻由牛支原体感染所导致的疾病或病症的症状，或加速牛支原体从所述动物宿主中清除。如果细菌量下降，肺感染减弱，直肠温度下降和/或摄食量增加和/或有所长大，那就可认为治疗是有效果的。本发明的方法在，例如以下方面有效预防或降低肺损伤，降低直肠温度，以及使肺中通常可见于牛支原体感染的牛支原体水平降低。
本发明通过给药猪肺炎支原体疫苗来治疗或预防牛支原体感染的方法在本文中也称为免疫接种方法。
本发明所用的术语“猪肺炎支原体疫苗”可包括，例如，灭活的完整或部分猪肺炎支原体细胞的制品，经过修饰的活疫苗，具有一种或多种猪肺炎支原体衍生蛋白、多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的亚单位疫苗，或者一种或多种编码一种或多种猪肺炎支原体衍生的蛋白、多肽或其免疫原性片段的猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能够在所述动物体内表达。所述猪肺炎支原体多肽、蛋白、这些多肽和蛋白的免疫原性片段，或者猪肺炎支原体的基因或核酸，可利用本领域已知技术合成或重组制备。优选，本发明方法中所用的猪肺炎支原体疫苗是菌苗。
本文所用的术语“免疫原性片段”是指来自猪肺炎支原体的蛋白的片段，该片段在宿主动物中能诱导免疫应答。所述免疫应答可包含，但不限于诱导细胞免疫和/或体液免疫。
本文所用术语“动物”是指所有的非人动物，包括哺乳动物。
本文所用术语“牲畜”是指牛类，包括但不限于菜牛(steer)、公牛、母牛以及小牛。优选，本发明的方法应用于非人哺乳动物，最优选小牛。
本文所用术语“菌苗”是指适合用作疫苗的灭活的猪肺炎支原体完整细胞或细胞的一部分的制品。
术语“免疫有效量”是指猪肺炎支原体疫苗的量足以引发所给药动物体内的免疫应答。所述免疫应答可包括，但不限于，诱导细胞免疫和/或体液免疫。猪肺炎支原体疫苗的有效量是指，例如，该菌苗预防支原体肺炎或降低其严重程度。
本文所用术语“佐剂”是指免疫应答的增效剂。
术语“可药用载体”是指这样的载体介质，其不干扰活性成分的生物活性的有效性，本身是化学惰性的且对所给药个体而言是没有毒性的。
灭活的(部分或完整的细胞)和经过修饰的活疫苗用于本发明方法中的猪肺炎支原体灭活疫苗或经过修饰的猪肺炎支原体活疫苗可利用本领域已知的多种方法制备。
例如，猪肺炎支原体菌苗可从猪肺炎支原体分离物制备。多种猪肺炎支原体分离物对本领域技术人员而言是已知的，且可从，例如美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209获得。这些菌株包括，例如ATCC保藏号为25095，25617，25934，27714，和27715的菌株。
猪肺炎支原体分离物也可以用已知技术直接从已感染的猪(porcine)的肺部损伤处获得。
猪肺炎支原体分离物可用各种已知技术灭活，例如，用美国专利5,565,205所述的二元吖丙啶(binary ehtyleneimine，BEI)处理细菌分离物，或用福尔马林，戊二醛，加热，辐射，BPL，或本领域已知的其它灭活剂来灭活。
除了灭活的细菌分离物外，菌苗产品也可以包含适量的一或多种常用佐剂。适当的佐剂包括，但不限于，无机胶，例如，氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂；糖苷类物质，例如，皂角苷和皂角苷衍生物如Quil A或GPI-0100；阳离子表面活性剂，如DDA(四烃卤化铵、pluronic多元醇；聚阴离子(polyanions)和多原子离子(polyatomic ions)；聚丙烯酸，非离子型封闭聚合物，例如，Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；阿夫立定(Avridine)和雷尼替丁(Rantidine)；肽；不稳定毒素的重组突变体，例如，淋巴毒素(LT)或霍乱毒素(CT)；化学结合的或紧密接近的分子运输体；矿物油，例如MontanideISA-50(Seppic，Paris，法国)，聚羰乙烯(carbopol)，Amphigen(Hydronics，USA)，Omaha，NE.USA，Alhydrogel，(Superfbs Biosector，Frederikssund，丹麦)油性乳剂，例如，矿物油乳剂如BayolF/Arlacel A和水，或植物油乳剂，水和乳化剂如卵磷脂；明矾，胆固醇细胞因子以及上述佐剂的组合。多原子离子也可起分散剂，增稠剂和抗结块剂(anticaking agents)的作用，使所述疫苗在较长时间放置后可重新悬浮成为一种单分散(mondisperse)悬浮液。所述佐剂的组合可以呈水性，胶囊形式(控释或缓释)或微胶囊形式。适合用于本发明方法中的猪肺炎支原体菌苗也可以通过多种商业途径获得。这样的商业途径包括但不限于RESPIFEND(Fort Dodge，American Home Products)，HYORESP(Merial Ltd)，M+PAC(Schering Plough)，PROSYSTEM M(Intervet)，INGLEVAC M(Boehringer)，RESPISURE(Pfizer Inc)和STELLAMUNE MYCOPLASMA(Pfizer Inc)。
用于本发明方法中的猪肺炎支原体菌苗的优选来源是RESPISURE，RESPISURE ONE和STELLAMUNE MYCOPLASMA。
用于本发明方法中的猪肺炎支原体菌苗的尤其优选来源是RESPISURE(PFIZER INC.)，包含菌株NL1042。
优选，菌株NL1042用BEI灭活，并用可商购的佐剂，优选AMPHIGEN(Hydronics，USA)辅佐。优选剂量是约2.0ml。常规应用的保存剂包括硫柳汞/EDTA。疫苗可配制成液体剂型，或者可出现在由可溶性成分或微粒组成的固体剂型中，在使用前将其重悬在可药用稀释剂中。制备可溶性成分或微粒的方法包括，但不限于，biacervation，congelgation，喷雾干燥(spray drying)，注射发泡(bubble syringes)，沉淀，超临界溶剂化(supercritical sovlation)/胶囊化(encapsulation)以及冷冻干燥。可以添加载体，优选是PBS。经过修饰的活疫苗的制备是本领域已知的，如通过进行传代培养使毒力株减毒来制备。
灭活的猪肺炎支原体分离物也可与包括但不限于以下的细菌和病毒组合牛疱疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多杀巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈状支原体，无乳支原体，加利福尼亚支原体，牛鼻支原体，殊异支原体，犬支原体以及Manheimia haemolytica。
亚单位疫苗本发明的方法可用亚单位疫苗来进行，所述亚单位疫苗由纯化的猪肺炎支原体免疫原性蛋白，多肽，或这些蛋白和多肽的免疫原性片段组成。所述蛋白和多肽可用本领域已知的技术制备，例如用表面作用剂制备的提取物，或热、化学和机械的提取物。蛋白的纯度或均一性可用本领域熟知的方法来确定，所述方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳及之后的适当凝胶染色，HPLC或本领域已知的其它类似方法。
在一个实施方案中，本发明所用的亚单位疫苗包括至少一种猪肺炎支原体蛋白或多肽。该疫苗中所用的优选的猪肺炎支原体蛋白或多肽包括但不限于P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44。这些以及其它的猪肺炎支原体蛋白已在国际专利申请WO96/28472和WO95/09870，欧洲专利申请0 475185 A1，美国专利5,788,962，国际专利申请WO91/15593，美国专利5,252,328，King等(1997；Vaccine 1525-35)，Wilton等(1998，Microbiology 1441931-1943)，以及Hsu等(1998，Gene 21413-23)中描述。
在另一实施方案中，本发明方法中所用疫苗包括至少一种猪肺炎支原体蛋白或多肽的免疫原性片段。根据本发明，包括在所述疫苗中的免疫原性片段具有猪肺炎支原体蛋白或多肽的至少约10至20，优选至少约30至40，或更优选至少50至约100个连续氨基酸的序列。优选，所述免疫原性片段是猪肺炎支原体蛋白或多肽的片段，所述蛋白或多肽包括但不限于P46，P65，P85，P97，P102.P70，P50和P44。
优选，用于疫苗中的猪肺炎支原体蛋白是基本纯或均一的。例如，所需的猪肺炎支原体蛋白或多肽可在用编码该蛋白或多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞中表达，然后用各种本领域已知的方法纯化。参见，例如″酶学方法″，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，″蛋白的纯化原理与实践″，1982，Springer-Verlag，New York中所述。纯化的猪肺炎支原体多肽和蛋白以及它们的免疫原性片段也可用本领域已知的合成方法来制备。
在另一实施方案中，本发明方法中所用的疫苗包括猪肺炎支原体蛋白、多肽或它们的免疫原性片段，以及至少一种其它的免疫原性或抗原性多肽，该多肽不是猪肺炎支原体蛋白、多肽或它们的免疫原性片段，优选是病毒的、细菌的或寄生虫的多肽。在优选实施方案中，所述抗原是牛疱疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多杀巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈状支原体，无乳支原体，加利福尼亚支原体，牛鼻支原体，殊异支原体，犬支原体或Manheimia haemolytica。这样的组合物作为组合疫苗是有利的。本发明的亚单位疫苗和组合疫苗可应用在本发明的方法中，以治疗或预防由牛支原体感染所导致的疾病或病症。
牛支原体多肽和蛋白以及它们的免疫原性片段也可以用活的重组病毒和细菌载体，如腺病毒或沙门氏菌来表达并释放。真正的载体在本领域内也是已知的，且很容易得到，或者可以用熟知的方法由本领域技术人员构建。
核酸疫苗本发明的接种方法可以用猪肺炎支原体基因或核酸分子来操作，所述基因或核酸分子编码猪肺炎支原体蛋白、多肽或这些蛋白和多肽的免疫原性片段。这样的基因和核酸可用本领域已知的的技术制备，并向动物给药以在体内表达所编码的蛋白、多肽或它们的片段。
在一个实施方案中，本发明中所用的疫苗包括至少一种基因或核酸分子，所述基因或核酸分子编码猪肺炎支原体蛋白如P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44，但不限于这些。
在另一实施方案中，本发明所用疫苗包括至少一种编码猪肺炎支原体蛋白或多肽的免疫原性片段的基因或核酸分子。将要包括在所述疫苗中的免疫原性片段由猪肺炎支原体蛋白或多肽的至少约10至20，或优选至少约30至40，或更优选至少约100个连续的氨基酸组成，所述蛋白或多肽包括但不限于，P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44。
所述基因或核酸分子可以通过已知方法，如通过使用基因枪来向动物给药。另外，所述基因或核酸也可以与脂质体或本领域已知的其它转染促进剂一并存在。
表达系统多种宿主表达载体系统都可以用来表达猪肺炎支原体蛋白或多肽。这样的宿主表达系统可用来制备和纯化目的编码序列，以及表达和纯化用于本发明接种方法中的猪肺炎支原体蛋白、多肽或其免疫原性片段。典型的宿主表达系统包括但不限于微生物，如用包含mhp3编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis))；用包含猪肺炎支原体基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母属，毕赤氏酵母属)；用包含猪肺炎支原体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含猪肺炎支原体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞或用包含猪肺炎支原体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述的表达构建体含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)，或含有衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子)。
在优选实施方案中，所述表达载体是细菌系统。
剂量和给药方式根据本发明，给药小牛猪肺炎支原体疫苗的有效量可提供抗御随后的牛支原体攻击的有效免疫力。在一个实施方案中，在小牛约7-28天龄时给药所述猪肺炎支原体疫苗，更优选，在约21天龄时给药。
在优选实施方案中，向小牛给药所述猪肺炎支原体疫苗二次。第一次给药是在动物约7-28天龄时，优选是在21天龄时。第二次是在动物约35-49天龄时，优选是在约42天龄时。
猪肺炎支原体疫苗达到有效的量取决于疫苗中的成分及给药的时间安排。通常，疫苗中使用灭活的猪肺炎支原体完整细胞制品时，在约3周期间向动物给药二次的情况中，每剂含有约1×106至约5×1010集落形成单位(CFU)的疫苗的量是有效的。优选，在约3周期间向动物给药二次时，提供有效免疫力的猪肺炎支原体疫苗，每剂包含约1×108至5×1010CFU，更优选每剂包含约5×108至5×1010CFU。第一次给药是在动物约7-28天龄时，优选是在21天龄时。第二次是在动物约35-49天龄时，优选是在约42天龄时。
根据本发明，当给药的是优选的菌苗制品RESPISURE时，给药RESPISURE优选二次，每次给药的量约0.5至约5.0ml，优选约1.5至约2.5ml，更优选约2ml。首次给药是在动物约7-28天龄时，优选在21天龄时。第二次给药是在动物约35-49天龄时，优选是在约42天龄时。
包含至少一种猪肺炎支原体蛋白，多肽或它们的免疫原性片段的猪肺炎支原体亚单位疫苗，在给药二次且每次给药约0.1μg至约200μg时，所述疫苗的量是有效的。首次给药是在动物约7-28天龄时，优选在21天龄时。第二次给药是在动物约35-49天龄时，优选是在约42天龄时。
包含基因或核酸分子(编码至少一种猪肺炎支原体蛋白，多肽或它们的免疫原性片段，优选DNA)的猪肺炎支原体亚单位疫苗，在给药二次且每次给药约0.1μg至约200mg时，所述疫苗的量是有效的。首次给药是在动物约7-28天龄时，优选在21天龄时。第二次给药是在动物约35-49天龄时，优选是在约42天龄时。
根据本发明，可以通过已知的途径给药，包括口腔途径，鼻内途径，粘膜局部途径，经皮途径以及肠胃外途径(例如，静脉内，腹腔，皮内，皮下或肌肉内)。也可以用无针的传输设备给药(needle-free delivery devices)。给药也可以通过多种途径的组合来实现，例如，首次给药使用肠胃外途径，之后给药利用粘膜途径。优选的给药途径是皮下或肌肉内给药。
本发明也涉及单剂疫苗接种的方法，该方法不再需要给药小牛额外的剂量便可以产生和/或维持抗御牛支原体的免疫力。
依照本发明给药的猪肺炎支原体疫苗可以包括额外的成分，如佐剂(例如无机胶，例如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂；糖苷，例如，皂角苷衍生物如Quil A或GPI-0100；胆固醇，pluronic多元醇；聚阴离子；非离子型封闭聚合物，例如Pluronic F-127；肽；矿物油，例如Montanide ISA-50，聚羰乙烯，Amphigen，Alhydrogel，油性乳剂，例如矿物油乳剂如BayolF/Arlacel A和水，或植物油乳剂，水和乳化剂如卵磷脂；明矾，细胞因子，以及佐剂组合)。
依照本发明，向大约3和6周龄的小牛给药有效量的猪肺炎支原体菌苗可提供抗御呼吸道感染(包括肺炎)的免疫力，降低肺脏中的牛支原体水平。
本发明提供了一种免疫小牛，使其抗御牛支原体感染的方法，该方法包括给药所述小牛至少一剂，优选二剂猪肺炎支原体菌苗以免疫小牛，来抗御牛支原体的感染。在优选实施方案中，所述菌苗通过皮下给药。而且，优选所述菌苗的剂量包含约2ml的菌苗，每毫升包含约2.5×108CFU的猪肺炎支原体。优选向小牛给药所述菌苗二次；一次在小牛出生后约3周时，另一次在小牛出生后约6周时。
本发明也包含向动物，优选向牲畜，给药有效量的猪肺炎支原体菌苗以治疗或预防所述动物的疾病，包括肺炎，关节炎，乳腺炎，耳炎和生殖疾病。
本发明通过以下实施例进行进一步描述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1材料与方法动物健康的杂种产奶小牛在约14天龄时进行疫苗接种。在开始研究之前使这些小牛适应7天。所有小牛每日接受浓缩的没有加入药物的饮食，没有任何已知的污染物或杀虫剂，但可自由摄水。
疫苗用来免疫接种小牛的菌苗，每剂包含适当浓度的经BEI灭活的猪肺炎支原体完整细胞。另外，所述疫苗制品包含磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)和水包油佐剂。安慰剂包含PBS。
攻击方法每只小牛鼻内途径连续3天接受12ml的新鲜的牛支原体培养物(大约1×108至1×1010集落形成单位(CFU/ml))。在每次实验性攻击完成后，即刻确定所述攻击接种物的存活数(CFU/ml)。
实验步骤每只小牛由独特的耳部标签号来鉴别。所有的动物根据年龄被随机分配到对照(pens)和治疗组。
在第0天(左侧颈部)和第21天(右侧颈部)给动物皮下接种2.0ml疫苗或2.0ml安慰剂。
在攻击前1天早晨，立即攻击前，以及攻击后20天的每天早晨测量直肠温度。
实验性牛支原体攻击的约3周后对所有动物进行尸检。使小牛安乐死，并对除中枢神经系统外的所有主要器官进行总体检查。
取出肺脏，总体评估那些可以由牛支原体感染导致的特征性损伤。将损伤绘制到标准的肺脏图上。用以下每个肺叶与总肺重之比来加权(weight)每个肺叶的总体受累百分数。

然后将肺叶加权值汇总，以便确定整个肺脏总体损伤的百分比(Pointon等1992)。另外，下式可用来计算下降百分数。
100-治疗组的肺损伤百分比均值＝下降的百分数对照组的肺损伤百分比均值另外，各肺用50ml PBS灌洗。努力从支气管灌洗液中分离出有活力的牛支原体，并确定其数量。有活力的牛支原体的数量(CFU/ml)通过制备支气管灌洗液的适当的连续稀释液，并将该样品在适当的琼脂培养基上铺板培养来确定。
实施例2在该实施例中，在年幼的小牛体内评估猪肺炎支原体菌苗的效力。将30个健康的杂种小牛根据年龄随机分组。
在第0天(左侧颈部)和第21天(右侧颈部)，给动物皮下接种2ml所述疫苗或安慰剂。所用的实验性治疗组和疫苗如表1中所示。
表1 试验治疗组

在第二次接种的3周后如上所述攻击小牛。每只小牛通过鼻内途径连续3天接受12ml新鲜的牛支原体培养物。
在完成牛支原体实验性攻击后的1小时内，确定每份攻击接种物的存活数(CFU/ml)。结果示于表2。
表2牛支原体攻击接种物的存活数(CFU/ml)

在实验性牛支原体攻击的前一天，即将开始攻击之前和攻击的20天后，每天早晨测定直肠温度。结果总结于图1中。接种猪肺炎支原体菌苗的小牛(治疗组A)，在第7天，第9-18天和第20天，体温平均值较接种安慰剂的动物(治疗组B)低。
对所有动物在实验性牛支原体攻击的大约3周后进行尸检。取出肺脏，总体评估那些可以由牛支原体感染导致的特征性损伤。肺损伤分值的百分数和肺损伤的下降百分数总结于表3中。治疗组A(猪肺炎支原体菌苗)中动物的总体肺损伤比安慰剂组(治疗组B)的下降45.1％。
表3肺损伤分值百分数的总结平均加权百分数±标准差

每个肺脏用50ml PBS灌洗。在实验性牛支原体攻击的约21天后，从支气管灌洗液样品中分离牛支原体，结果总结于表4中。猪肺炎支原体菌苗接种组(治疗组A)的小牛与安慰剂组(治疗组B)比较，分离自肺灌洗液样品中的有活力牛支原体的水平下降。
表4从肺灌洗液分离牛支原体的总体情况

总而言之，与安慰剂接种组(治疗组B)比较，用猪肺炎支原体接种二次的小牛(治疗组A)的总体肺损伤下降，直肠温度下降，分离自肺灌洗液样品中的有活力牛支原体的水平下降。这些结果提示，用猪肺炎支原体菌苗进行接种，可赋于牲畜对实验性牛支原体攻击的交叉保护。
权利要求
1.一种治疗或预防动物体内由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法，其包含向动物给药有效量的猪肺炎支原体疫苗。
2.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗制剂是灭活的猪肺炎支原体完整细胞或细胞一部分的制剂。
3.权利要求2的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗每剂包含约1×106至约5×1010个集落形成单位(CFU)。
4.权利要求2的方法，其中所述疫苗的给药量是约0.5ml至约5.0ml。
5.权利要求2的方法，其中所述猪肺炎支原体细胞制剂是RESPISURE。
6.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗包含至少一种来自猪肺炎支原体的蛋白或其免疫原性片段。
7.权利要求6的方法，其中所述蛋白选自P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50或P44。
8.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗包含编码来自猪肺炎支原体的至少一种蛋白或多肽，或该蛋白的免疫原性片段的核苷酸序列。
9.权利要求6的方法，其中所述蛋白选自P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50或P44。
10.权利要求6的方法，其中将约0.5ml至5.0ml的所述猪肺炎支原体疫苗给药至所述动物。
11.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗进一步包含佐剂。
12.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗进一步包含可药用载体。
13.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗给药至约21日龄的动物。
14.权利要求1的方法，其中所述猪肺炎支原体疫苗以单剂形式给药至所述动物。
全文摘要
本发明涉及通过给药动物有效量的猪肺炎支原体疫苗来治疗或预防动物体内由牛支原体感染所致的疾病或病症的方法。所述猪肺炎支原体疫苗可以是灭活后的完整或部分的细胞，或者是经过修饰的活的制品，亚单位疫苗，或核酸，或DNA疫苗。依照本发明给药的猪肺炎支原体疫苗可以是合成的或重组制备的。
文档编号A61K39/04GK1612749SQ02813431
公开日2005年5月4日 申请日期2002年5月30日 优先权日2001年7月2日
发明者亚历山大·C·古迪, 安德鲁·R·彼得斯, 罗宾·L·凯奇 申请人:辉瑞产品公司