一种猪肺炎支原体的融合基因及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及对动物细菌性传染病基因疫苗的研究，具体 地说是一种猪肺炎支原体的融合基因及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)可以引起猪的支气管肺炎，俗称 猪气喘病。该病的危害在于Mhp能与猪呼吸道上皮细胞的纤毛发生特异性黏附，从而破坏 动物机体呼吸道黏膜一纤毛屏障，引发其他病原体的感染，使呼吸道疾病加重，继而引起猪 呼吸道疾病综合征（Porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC) 〇
[0003] Mhp对培养条件要求很高，较难培养，目前所研究报道的只是来自4种致病型支原 体的基因，分别是168株、J株、7448型和232型。猪气喘病为慢性病，流传广泛，死亡率不 高但携带率很高，难以彻底根治，且常为季节性发生。由于国内目前对于猪肺炎支原体的 培养以及分离技术并不十分完善，这就更加大了对猪肺炎支原体研究的难度。当前我国对 该病的防治主要以预防为主，但由于针对该细菌疫苗的开发几乎完全基于佐剂化的全细胞 制剂或膜制剂，尚无一证明是完全有效的。研究表明，黏附蛋白与呼吸道黏膜纤毛的特异 性结合是引起猪支原体肺炎的必不可少的致病因素。有研究报道Mhp的黏附蛋白与猪呼吸 道黏膜纤毛的结合，是引起猪支原体肺炎的必不可少的致病因素。Mhp中黏附蛋白主要是 细胞质蛋白P36,膜蛋白P46、P65 和P74,黏附因子P97、P102、P216、P159、P116、Mhp271、 1%)107、]\%)684以及热休克蛋白〇1^1(。根据文献报道，？97、？102、？216、？159、？116是肝磷 脂结合蛋白，主要通过胞外基质中的肝磷脂蛋白结合到呼吸道粘膜纤毛上，引发免疫反应； P36有乳酸脱氢酶的活性的胞质蛋白，引发晚期免疫反应，免疫原性略低；P46蛋白为细胞 膜表面抗原，可以引起早期免疫反应；P65是热休克蛋白HSP70家族成员之一，具有免疫刺 激作用，同时具有酯酶活性；Dnak为热休克蛋白具有免疫佐剂的功能，其N端结构有分子伴 侣的功能，C端具有主要的免疫原性。由于目前我国缺乏预防猪肺炎支原体感染的有效疫 苗，为了更有效的控制和减少Mhp对畜牧业的危害，本实验着力于研究猪肺炎支原体融合 蛋白P65-DnaKc的免疫原性。实验所选取的黏附蛋白P65免疫原性级高，可以引发早期免 疫反应，其种间保守性和特异性极高，目前常被作为免疫优势蛋白用于Mhp基因工程疫苗 和亚单位疫苗的开发；黏附蛋白DnaKc是热休克蛋白DnaK的C末端片段，免疫原性良好，并 且具有免疫佐剂的功能，诱导机体产生强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应；本实验分别 构建了p65、dnaKc和p65-dnaKc基因的表达载体，通过原核表达、纯化，将获得的蛋白作为 基因工程疫苗免疫小鼠，利用ELISA检测血清中的抗体效价，发现P65、DnaKc和P65-DnaKc 蛋白均具有较好的免疫原性，其中融合蛋白P65-DnaKc的免疫原性明显优于单蛋白P65和 DnaKc。攻毒试验发现融合蛋白P65-DnaKc在小鼠体内可以引发较强的免疫应答反应，保护 率较高。因此，利用该融合基因研制、开发安全高效的防治猪肺炎支原体感染的基因工程疫 苗，将大有潜力可为。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现在猪肺炎支原体市场有效疫苗少，以及疫苗制备过程的缺陷， 设计了一种猪肺炎支原体的融合基因及其制备方法，将猪肺炎支原体的基因P46和P65基 因串联连接，从而获得免疫原性更好的融合基因P46-P65。
[0005] 本发明采用的技术方案为：一种猪肺炎支原体的融合基因，其融合基因为 P46-P65,其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1所示。
[0006] 所述融合基因通过如下方法制备：
[0007] 1)将P46基因的PCR产物和原核表达质粒pET_28a分别双酶切，并过夜连接，构建 重组表达载体pET28a-P46 ;
[0008] 2)将P65基因的PCR产物和重组表达载体pET28a-P46双酶切，并过夜连接，构建 含有融合基因的重组表达载体pET28a-P46-P65;
[0009] 3)通过体外突变技术，将P46基因中的三个TGA密码子转变为TGG密码子，从而构 建可以在原核细胞中进行表达的重组表达载体pET28a-P46-P65;
[0010] 4)通过跑1 %琼脂糖凝胶电泳切胶回收去除重组表达载体pET28a-P46-P65中的 pET28a从而获得可以在原核细胞中进行表达的融合基因P46-P65 ;
[0011] 其中，P46基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
[0012] P65基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0013] 步骤1)中所述的双酶切分别使用的是是限制性内切酶BamH I和Sal I，于37°C 双酶切3h。
[0014] 步骤1)与步骤2)中所述的过夜连接使用的是T4DNA连接酶进行的过夜连接。
[0015] 步骤2)中所述的双酶切分别使用的是限制性内切酶SalI和Hind III，于37°C双 酶切3h。
[0016] 步骤4)所述的跑电泳切胶用的是质量浓度为1%~5%的琼脂糖凝胶。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 1、利用本发明制备方法制备的融合基因P46-P65的免疫原性明显高于单个基因 的免疫原性，为研制新型猪肺炎支原体基因疫苗垫下了坚实的基础；
[0019] 2、融合基因P46-P65是成本较低的基因资源，基于P46-P65融合基因的亚单位疫 苗表达量较高，易于纯化和制备，与常规的灭活疫苗和弱毒疫苗相比制备成本较低；
[0020]3、本发明中所使用的P46和P65基因，直接根据NCBIGeneBank中发布的编 码区序列，设计含有相应酶切位点的特异性引物。P46基因的PCR产物和原核表达载体 pET-28a双酶切并连接，构建重组表达载体pET-28a-P46;再令重组表达载体pET-28a-P46 和P65基因的PCR产物双酶切并连接，直接构建重组表达载体pET-28a-P46-P65。优势 是不需要使用Linker连接P46和P65基因，直接经过双酶切连接就可得到重组表达载体 pET-28a-P46-P65。重组载体构建过程相较于，使用Linker连接基因再与原核表达载体连 接，过程简单并且易于得到，耗费时间明显减少；
[0021] 4、P46-P65融合基因的纯化过程使用His-Ni2+进行纯化，杂蛋白的冲洗以及目的 蛋白的获得，只需要加入不同溶度的咪唑溶液进行冲洗，原理是根据离子交换层析技术。相 较于AKTA FPLC (Amersham Biosciences UPC-900)过程操作步骤和原理更简单易懂，并且 耗费财力较少，时间耗费较少，只需要4h左右；
[0022] 5、通过间接ELISA实验，结果证明，经过本发明表达并纯化的融合蛋白P46-P65的 免疫原性要高于于P97R1-Linker-P36-Linker-P46融合蛋白100-1000倍；
[0023] 6、并且本发明还进行了攻毒试验证明了，P46-P65融合基因的亚单位疫苗的保护 率较高。对小鼠有肺部组织明显的保护作用。
【附图说明】
[0024] 图1是P65基因PCR产物示意图；
[0025] 图2是P46基因PCR产物示意图；
[0026] 图3是pET-28a-P46-P65双酶切验证示意图；
[0027] 图4是诱导大肠埃希菌P46-P65蛋白表达的上清液和沉淀跑胶示意图；
[0028] 图 5 是Western-blotting和SDS-PAGE检测图；
[0029] 图6是攻毒实验无疫苗保护组小鼠肺部透射电镜图片；
[0030] 图7是攻毒实验疫苗保护组小鼠肺部透射电镜图片。
[0031] 其中，附图中，M代表蛋白分子质量标准，1代表空载表达沉淀，2代表空载表达上 清，3代表诱导6h重组表达载体沉淀，4代表诱导6h重组表达载体上清，5代表P65蛋白，6 代表P46蛋白，7代表P46-P65蛋白，A代表重组蛋白的Western-blotting分析图，B代表 重组蛋白的SDS-PAGE分析图。
【具体实施方式】
[0032] 本发明的融合基因是通过如下步骤得到的：首先根据Genebank上公布的P46和 P65基因，设计引物并进行PCR扩增。并将P46基因的PCR产物和原核表达质粒pET-28a分 别使用限制性内切酶BamHI和SalI，于37°C双酶切3h，并使用T4DNA连接酶过夜连接。 构建重组表达载体pET28a-P46。将P65基因的PCR产物和重组表达载体pET28a-P46分别 使用限制性内切酶SalI和HindIII，，于37°C双酶切3h，并使用T4DNA连接酶过夜连接，构 建含有融合基因的重组表达载体pET28a-P46-P65,并通过体外突变技术，将P46基因中的 三个TGA密码子转变为TGG密码子，从而构建可以在原核细胞中进行表达的重组表达载体。 本发明还包括该融基因在制备猪肺炎支原体基因工程疫苗中的应用。
[0033] -、下面对P46-P65融合基因的构建进行详细说明：
[0034] 1、引物的设计，如表1所示：
[0035] 表 1
[0036]
[0037] 表1中引物序列中有下划线部分为酶切位点，引物是有上海生物工程技术有限公 司合成。
[0038] 2、P46和P65基因的扩增
[0039] 以猪肺炎支原体168弱毒株为模板，利用表1中特异性引物，进行P46(ID: 16186839)和P65(ID:16186824)基因的特异性扩增。PCR体系如表2所示，PCR产物如图 1和图2所示。
[0040]表2 [0041 ]
[0042]P46 的扩增程序为：94°C4min;94°C30s，64. 1°C30s，70minlmin，25 个循环；72°C 延伸lOmin。经过1%的琼脂糖凝胶检测，得到1260bp长度的片段。P65的扩增程序为： 94°C4min;94°C30s，65°C30s，70minlmin，25 个循环；72°C延伸lOmin。经过 1 % 的琼脂糖 凝胶检测，得到963bp长度的片段。
[0043] 3、重组表达载体pET-28a-P46-P65的构建
[0044] 根据Genebank上公布的P46和P65基因，设计引物并进行PCR扩增。并将P46 基因的PCR产物和原核表达质粒pET-28a分别使用限制性内切酶BamHI和SalI双酶 切，并过夜连接。构建重组表达载体pET28a-P46。将P65基因的PCR产物和重组表达载体 pET-28a-P46分别使用限制性内切酶SalI和HindIII双酶切，并过夜连接。构建含有融合 基因的重组表达载体pET-28a-P46-P65,并通过体外突变技术，将P46基因中的三个TGA密 码子转变为TGG密码子，从而构建可以在原核细胞中进行表达的重组表达载体。从而获得 可以在原核细胞中进行表达的融合基因P46-P65。经过PCR验证、双酶切和测序分析验证， 证明重组表达载体pET-28a-P46-P65构建成功，参见图3,pET-28a-P46-P65双酶切验证示 意图。