一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒特异抗体IgM的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒的特异抗体IgM的检测方法和应用。该方法以具有多条管道的微流控芯片作为反应平台，利用化学发光信号进行检测，实现了对肺炎支原体和流感病毒血清特异抗体IgM的单独或同时检测。该检测方法将微流控芯片和化学发光相结合，兼具了微流控芯片的快速、高效和样品用量小，化学发光高特异性、操作简单、成本低、快速等优点，是一种同时多目标，实时，灵敏度高的检测方法，可应用于肺炎和流感的快速诊断。
【专利说明】一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒特异抗体 IgM的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物分析【技术领域】，具体涉及一种肺炎支原体和流感病毒的检测方 法，尤其涉及一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒的特异抗体IgM的检测方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体(Mycoplasma Pneumonia)是人类支原体肺炎的病原体，突出表现为阵 发性刺激性咳嗽，除呼吸系统的表现外，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。支原体肺 炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎，主要经 飞沫传染，潜伏期2?3周，发病率以青少年最高。有的临床症状较轻，甚至根本无症状，若 有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状。支原体肺炎的临床表现和胸部X线 检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。
[0003] 流感病毒，主要是引起人的流行性感冒，是一种传染性极强的急性呼吸道传染病。 流感流行伴随着死亡率的增加，增加的死亡率不仅仅由流感和肺炎引起，也与流感引起的 心肺疾病和其他慢性病恶化有关。特点是起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至24小时内 升达高峰，通常有肌炎及胃肠道症状。以冬春季节流行为主，在流行初期，散发或轻型的病 例诊断比较困难，确诊往往需实验室检查。
[0004] 免疫球蛋白M(Ig M)和免疫球蛋白G(Ig G)是人类或者动物体内最重要的两种抗 体。当机体感染肺炎支原体或流感病毒后，在体内，最早出现的是肺炎支原体或流感病毒的 特异性的IgM抗体，之后再出现肺炎支原体或流感病毒的特异性的IgG抗体。因此，通过检 测机体内肺炎支原体或流感病毒特异性IgM和IgG抗体的存在与否，可以诊断人或者动物 对病原体的免疫反应状态。
[0005] 目前主要通过酶联免疫试剂盒检测样品中的肺炎支原体或流感病毒的特异性 IgM。该检测产品基本分为三类：一类是传统的微孔板产品，其缺点在于检测过程耗时较长 (一般有几个小时），使用的试剂和样品量也较大，不能满足少量样品或临床及时检测的需 求；一类是荧光标记检测玻片产品，该类产品试剂用量较少，但检测时间仍较长，并且大部 分此类产品的结果还需借助昂贵的荧光显微镜来观察判读，这种直观判断需要技术人员的 丰富经验，而且耗费时间，因此不适合临场快速检测；另一类是胶体金试纸条，比较快速，简 便，但其应用有一定局限性，无法实现量化，并且不能满足多指标、多样本同时检测。
[0006] 另外，虽然目前检测病原体血清类的产品较为成熟，但是市场上提供的产品，最常 见的是微孔板及试纸条产品，多为某一种病原体血清特异性IgM的检测产品，很少有多种 病原体联合检测的产品。
[0007] CN201804009U公开了基于微流控芯片病原体的检测方法，其采用将微通道和检测 芯片设于本体，各个检测芯片与微通道连通，每个芯片结合有1种抗体，各种抗体均不同。 该方法的缺点在于，如果检测多个指标需要使用多个检测芯片，其是分区的，不可避免地增 加了实验步骤，造成操作繁琐，另外其涉及的制备方法是包被抗体检测抗原，不能完成检测 血清特异性抗体的目的。
[0008] CN102854304A公开了一种以集成微磁场的微流控芯片作为反应的容器，磁球作为 固相载体，链酶亲和素修饰的量子点（SA-QDs)作为荧光标记物，在微磁场的作用下，在芯 片通道中特定部位捕获磁球，形成了微反应区，通过夹心免疫反应捕获病原体，通过生物素 与链酶亲和素的相互作用，实现对病原体的荧光免疫定量分析。该检测方法由于涉及到生 物素，可能会因为人体样本成分含有生物素而有一定的干扰，另外荧光定量分析中使用的 试剂和设备费用较高。
[0009] 因此，寻找一种多目标，实时，灵敏度高的检测肺炎支原体和流感病毒的方法是目 前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种肺炎支原体和流感病毒的检测方法，尤其涉及一种基 于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒的特异抗体IgM的检测方法。
[0011] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0012] 第一方面，本发明提供了一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒的特异抗 体IgM的检测方法，包括以下步骤：
[0013] (1)检测芯片的制作：将芯片与固相反应基底贴合后形成封闭的微流管道，向所 述微流管道中通入肺炎支原体和/或流感病毒的特异性重组蛋白抗原，所述特异性重组蛋 白抗原包被在基底上；包被好后，抽出包被液，揭去所述芯片，并贴上另一芯片，使两块芯片 上的管道相互交叉，将其与基底密封后，向微流管道通入封闭液，封闭后抽出封闭液；
[0014] (2)向步骤（1)所述检测芯片中的微流管道加样孔中加入被检测样品，孵育，洗 涤；
[0015] (3)向步骤（2)所述微流管道中加入酶标记的检测抗体，洗涤；
[0016] (4)向步骤（3)所述微流管道中加入化学发光液，通过化学发光检测仪进行检测。
[0017] 本发明所采用经过优化的肺炎支原体或流感病毒等病原体的特异性重组蛋白抗 原，能避免非特异性反应，可特异性的识别血清中的肺支或流感IgM抗体，并与之发生免疫 反应将血清中特异性IgM抗体留在固相基底上，其余的血清成分被冲洗走。
[0018] 本发明步骤（1)所述芯片为经手工翻模或注塑而成的带有并行微流管道的芯片。
[0019] 优选地，所述芯片带有7条并行微流管道；所述微流管道长度为3-5cm，所述微流 管道直径500-600 ii m，高度500-600 ii m，所述微流管道的间距为l-3mm。
[0020] 在本发明中，每个微流管道只需通入20 i! L甚至更少的检测样本即可满足检测需 求。
[0021] 本发明步骤（1)所述固相反应基底为聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸 甲酯，优选为聚苯乙烯。
[0022] 本发明步骤（1)所述两块芯片上的管道相互垂直，交叉角度为90°。
[0023] 本发明步骤（2)所述被检测样品为血清。
[0024] 本发明采用血清样本进行检测，能够快速、准确地诊断出人或者动物机体是否有 近期肺炎支原体或流感病毒感染的发生。
[0025] 本发明步骤（2)所述孵育时间为10-20min，优选为15min。
[0026] 本发明步骤（3)所述酶标记的检测抗体为经过优化的HRP标记的羊抗人IgM抗 体。
[0027] 本发明步骤（4)所述化学发光液为鲁米诺化学发光底物，该底物可被HRP酶催化。
[0028] 本发明所述洗涤用的洗涤液为经过优化的含有0. 05%吐温的洗涤液，采用该洗涤 液可以降低微管道非特异性吸附造成的干扰背景。
[0029] 作为优选技术方案，本发明的检测方法包括以下步骤：
[0030] (1)检测芯片的制作：将芯片与固相反应基底贴合后形成封闭的微流管道，向所 述微流管道中分别通入肺炎支原体和流感病毒的特异性重组蛋白抗原，所述特异性重组蛋 白抗原包被在基底上；包被好后，抽出包被液，揭去所述芯片，并贴上另一芯片，使两块芯片 上的管道相互垂直，交叉角度为90°，将其与基底密封后，向微流管道通入BSA封闭液，封 闭后抽出封闭液；
[0031] (2)向步骤⑴所述检测芯片中的微流管道加样孔中加入血清，孵育15min，用经 过优化的含有〇. 05 %吐温的洗涤液进行洗涤；
[0032] (3)向步骤⑵所述微流管道中加入经过优化的HRP标记的羊抗人IgM抗体，用经 过优化的含有〇. 05 %吐温的洗涤液进行洗涤；
[0033] (4)向步骤（3)所述微流管道中加入鲁米诺化学发光底物，通过化学发光检测仪 进行检测。
[0034] 本发明的检测原理在于：
[0035] 在制备好的检测芯片中，向微管道加样孔中加入被检测样品后，充满微流管道的 血清样品中的IgM抗体会和预先包被在基底上的特异性病原体的抗原结合，孵育15min后 洗涤，如果被检测样品中含有针对肺炎支原体或流感病毒的特异性抗原的IgM，那么样品中 的特异性IgM就会和包被在反应区域上的抗原结合，并发生免疫反应形成抗原-IgM复合 物；然后向所有管道中加入酶标检测抗体，如果检测样品中含有针对肺炎支原体或流感病 毒的特异性IgM，那么酶标检测抗体就会与反应区域上被结合的特异性IgM抗体发生免疫 反应，形成抗原-IgM抗体-酶标抗体结合物；最后通入发光液与酶发生催化反应并产生发 光信号，信号就会被化学发光分析仪检测到并给出数值。如果检测样本里没有针对这两种 病原体特异性的IgM，也就没有酶标检测抗体与抗原结合在基底上，最后就不会检测到化学 发光信号。
[0036] 本发明可以在步骤（1)中向所述芯片的左侧两列管道中通入肺炎支原体特异性 重组蛋白抗原，向所述芯片的右侧两列管道中通入流感病毒的特异性重组蛋白抗原，可实 现对肺炎支原体和流感病毒的同时检测。
[0037] 若通入的样本在芯片左侧两列产生发光信号，经化学发光分析仪读取发光信号的 数值大于根据阴性对照设定的cutoff值，说明样品中含有特异性肺炎支原体IgM ;若通入 的样本在右侧两列产生发光信号，仪器读取数值大于设定的cutoff值，说明样品中含有特 异性流感病毒IgM，若通入的样本在芯片左右共四列的对应位置都产生发光信号，仪器读 取数值大于设定的cutoff值，则说明同时含有肺炎支原体和流感病毒特异性的IgM ;若通 入的样本在芯片左右对应位置均不产生发光信号，说明不含有肺炎支原体和流感特异性的 IgM ;无论阴性处情况如何，只要上方第一行的阳性质控处未显示发光信号，则该芯片判定 为无效，需要重新进行检测。
[0038] 第二方面，本发明还提供了如第一方面所述的方法在肺炎和流感检测中的应用。
[0039] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0040] 1、本发明借助微流控芯片并选择血清作为样品通过一次性操作即可联合检测出 多个样本的肺炎支原体和/或流感病毒特异性IgM，具有样本量少、多样本、多指标可同时 检测，特异性强，灵敏度高，价格低廉，读取结果量化和直观等优点；
[0041] 2、本发明将抗原固定时间，抗原抗体反应时间分别缩短，在一些实施方案中，能将 反应时间缩短到15min以内；并将整个免疫反应，包括抗原固定、抗体反应、二抗反应，缩短 到30min以内，实现了快速检测；
[0042] 3、本发明不需要复杂的仪器设备，也不需要实验人员的经验判断，避免了不同操 作人员的主观因素，检测结果的总体符合率较高，适合于现场检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1为本发明的检测芯片制作和检测流程示意图；
[0044] 其中，步骤①-②为检测芯片制作示意图；步骤③-④为检测流程示意图；
[0045] 图2为本发明的检测结果判定原理的组合图；
[0046] 其中，图2a为未加入样品时特异性病原体抗原包被在基底上的示意图；图2b_e为 同时加入肺炎支原体和流感病毒样品后的检测结果判定原理图，图2b为肺炎支原体阳性， 流感病毒阴性，图2c为肺炎支原体阴性，流感病毒阳性，图2d为肺炎支原体阳性，流感病毒 阳性，图2e为肺炎支原体阴性，流感阴性；
[0047] 图3为本发明同时检测肺炎支原体和流感样本的结果示意图；
[0048] 图4为本发明肺支、流感同时检测的结果图；
[0049] 图5为本发明肺支单独检测的结果图；
[0050] 图6为本发明流感单独检测的结果图；
[0051] 其中：1-进液孔，2-基底，3-管道腔，4-出液孔。
【具体实施方式】
[0052] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0053] 实施例中所用的试剂仪器设备来源：
[0054] (1)肺炎支原体重组蛋白：厦门万科隆生物科技有限公司；
[0055] (2)流感病毒重组蛋白：义翘神州生物技术有限公司；
[0056] (3)鼠/羊抗人IgM-HRP抗体，牛血清白蛋白，鼠/羊抗人IgG抗体：北京索莱宝 生物技术有限公司；
[0057] (4) PS 基底：corning ;
[0058] (5) PDMS芯片基质、固化剂：道康宁；
[0059] (6)高温干燥箱：上海一恒科技有限公司；
[0060] (7)PBS :北京化工有限公司；
[0061] (8)化学发光液：mi Iipore ;
[0062] (9)化学发光仪：国家纳米科学中心研制
[0063] 实施例1肺炎支原体和流感病毒特异性抗体IgM的同时检测
[0064] (1)检测芯片的制备
[0065] 取一张多通道芯片与基底密封，然后取IuL肺炎支原体重组蛋白原液加入 PBS (PH7. 2-7. 4)缓冲溶液中，稀释至最佳包被浓度20 ii g/mL，混匀；将稀释后的蛋白溶液 通入左侧两条管道中；取I U L流感病毒重组蛋白原液加入PBS(PH7. 2-7. 4)缓冲溶液中，稀 释至最佳包被浓度15u g/mL，混匀；将稀释后的蛋白溶液通入右侧两条管道中；室温，包被 30min〇
[0066] 用PBS缓冲液配置3%的BSA封闭液。揭去第一片芯片，风干后，贴上第二片芯片， 使第二片芯片上的管道与第一片芯片的管道放置方向垂直，密封；然后用移液器向管道均 通入20 ii L BSA封闭液，室温30min ;抽出封闭液，干燥后，放入密封袋，4 °C保存，S卩制得检 测芯片，如图1中①-②步所示。
[0067] (2)利用上述检测芯片同时对肺炎支原体和流感病毒的血清样品进行检测
[0068] ①实际血清样品收集（注：血清需要澄清，若出现浑浊，需要高速离心，除去浑浊 的杂质）；
[0069] ②血清样本的处理：取I U L血清，使用购买的IgG吸附剂样本稀释液将血清按1 : 10的稀释浓度进行稀释，混匀，室温IOmin后，待用；
[0070] ③开始检测，打开密封袋，取出制备好的芯片，芯片管道平行放在检测台面上，然 后用移液器取20 y L待测样本对准加样孔，通入管道，室温孵育15-20min后抽出检测样本， 洗涤液洗涤4-5次；
[0071] ④向每个管道中通入20 y L检测抗体，室温孵育15-20min后抽出检测样本，洗涤 液洗涤4-5次；
[0072] ⑤向芯片中通入商品化的化学发光液，放入化学发光仪中，使用分析软件进行数 据分析；
[0073] ⑥结果判断：检测的原理如图2a_e所示，具体的检测结果判断如图3和图4所 示，通入样本后，在芯片左右共四列的对应位置都产生发光信号，仪器读取数值大于设定的 cutoff值，说明样品中同时含有肺炎支原体和流感病毒特异性的IgM。
[0074] 采用本发明所述肺炎支原体和流感病毒同时检测芯片对临床已经确诊的阳性血 清和阴性血清进行检测，结果如表1所示。
[0075] 表 1
[0076]
【权利要求】
1. 一种基于微流控芯片的肺炎支原体和流感病毒的特异抗体IgM的检测方法，其特征 在于，包括以下步骤： (1) 检测芯片的制作：将芯片与固相反应基底贴合后形成封闭的微流管道，向所述微 流管道中通入肺炎支原体和/或流感病毒的特异性重组蛋白抗原，所述特异性重组蛋白抗 原包被在基底上；包被好后，抽出包被液，揭去所述芯片，并贴上另一芯片，使两块芯片上的 管道相互交叉，将其与基底密封后，向微流管道通入封闭液，封闭后抽出封闭液； (2) 向步骤⑴所述检测芯片中的微流管道加样孔中加入被检测样品，孵育，洗涤； (3) 向步骤⑵所述微流管道中加入酶标记的检测抗体，洗涤； (4) 向步骤（3)所述微流管道中加入化学发光液，通过化学发光检测仪进行检测。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述两块芯片上的管道相互垂直， 交叉角度为90° ; 优选地，所述芯片为经手工翻模或注塑而成的带有并行微流管道的芯片； 优选地，所述芯片带有7条并行微流管道；优选地，所述微流管道长度为3-5cm，所述微 流管道直径500-600 ii m，高度500-600 ii m，所述微流管道的间距为l-3mm。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述固相反应基底为聚苯乙 烯、聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯，优选为聚苯乙烯。
4. 如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述被检测样品为血清。
5. 如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述孵育时间为10-20min， 优选为15min。
6. 如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述酶标记的检测抗体为经 过优化的HRP标记的羊抗人IgM抗体。
7. 如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步骤（4)所述化学发光液为鲁米诺化 学发光底物。
8. 如权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述洗涤用的洗涤液为经过优化的 含有0. 05%吐温的洗涤液。
9. 如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 检测芯片的制作：将芯片与固相反应基底贴合后形成封闭的微流管道，向所述微 流管道中分别通入肺炎支原体和流感病毒的特异性重组蛋白抗原，所述特异性重组蛋白抗 原包被在基底上；包被好后，抽出包被液，揭去所述芯片，并贴上另一芯片，使两块芯片上的 管道相互垂直，交叉角度为90°，将其与基底密封后，向微流管道通入BSA封闭液，封闭后 抽出封闭液； (2) 向步骤⑴所述检测芯片中的微流管道加样孔中加入血清，孵育15min，用经过优 化的含有〇. 05 %吐温的洗涤液进行洗涤； (3) 向步骤（2)所述微流管道中加入经过优化的HRP标记的羊抗人IgM抗体，用经过优 化的含有〇. 05 %吐温的洗涤液进行洗涤； (4) 向步骤（3)所述微流管道中加入鲁米诺化学发光底物，通过化学发光检测仪进行 检测。
10. 根据权利要求1-9之一所述的方法在肺炎和流感检测中的应用。
【文档编号】G01N21/76GK104360060SQ201410646199
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】蒋兴宇, 张晓青, 张伟, 曹丰晶, 陈翊平, 牛亚静, 沈海滢 申请人:国家纳米科学中心