一株猪肺炎支原体菌种及其应用
【专利说明】
[0001]
技术领域本发明涉及一株猪肺炎支原体菌种及其应用，属于兽医微生物学领域。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae， Mhp)引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地 分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但不同分离株之间基因组间有较大差异。1992 年 Frey 等(Frey, J. , Haldimann, A. &Nicolet, J. (1992). Chromosomal heterogeneity of various Mycoplasma hyopneumoniae field strains. Int J Syst Bacteriol 42, 275-280)首次证实了猪肺炎支原体不同分离株间基因组的差异，Artiushin和 Minion (1996^) (Artiushin, S. Minion, F. C. (1996). Arbitrarily primed PCR analysis of Mycoplasma hyopneumoniae field isolates demonstrates genetic heterogeneity. Int J Syst Bacteriol 46, 324-328.)进一步证实了 Frey 的观点，Kokotovic 等（1999 年)(Kokotovic, B. , Friis, N. F. , Jensen, J. S. Mhrens, P. (1999). Amplif ied-fragment length polymorphism fingerprinting of Mycoplasma species. J Clin Microbiol 37, 3300-3307.)的研宄结果也得出了同样的结论。
[0003] 支原体是可以自我复制的最小原核生物，生长缓慢，对培养基的要求较高。与其他 普通支原体相比，Mhp生长更为缓慢，对体外培养的要求显得更苛刻，被称为"挑剔的微生 物"。国内外专家学者通过长期研宄，研制了多种类型的营养培养基用于Mhp的分离、培养， 如A26支原体体形培养基、KM2培养基、Friis培养基和牛心汤培养基等。不过，这些培养依 然存在或多或少的不足，培养效果仍然不能令人满意。因此分离出抗原性、免疫原性好的疫 苗株具有十分重要的意义。
[0004] 猪肺炎支原体基因组含有稀有密码子，至今被鉴定的抗原蛋白只有少数几种。目 前认为猪肺炎支原体的主要抗原蛋白有P97、P65、P46、P36等，其中P46是Mhp具有很强种 属特异性的膜蛋白，其能够引起机体早期免疫反应。1995年，Futo等（Futo, S.，Seto, Y.，Mi tsuse, S. , Mori, Y., Suzuki, Τ. &Kawai, Κ. (1995). Molecular cloning of a 46-kilodalton surface antigen(P46)gene from Mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of CGG codon usage for arginine. J Bacteriol 177,1915-1917·)发现 P46 基因（1257bp)，在其 ORF中包含I个CGG(在Mhp中编码精氨酸，在其他支原体中为无义密码子）和3个TGA密 码子（在支原体中编码色氨酸，在通用密码子中为终止密码子）。P97是Mhp的主要粘附因 子，不同的毒株其Rl区包含不同个数的AAKPV/E基元（Hsu, T.，Artiushin, S.&Minion，F. C. (1997). Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae. J Bacteriol 179,1317-1323)。因此 P46 蛋白和 P97 蛋白 基因组的序列测定，可作为猪肺炎支原体不同毒株鉴定的分子生物学标记。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体菌种，该菌株在无细胞培养基上生长良 好，而且免疫原性强。经猪肺炎支原体16s RNA特异性引物鉴定为猪肺炎支原体菌株，将其 命名为猪肺炎支原体S株，经猪肺炎支原体P46引物和M7 Rl引物特异性扩增后也再次鉴 定为猪肺炎支原体，其碱基和氨基酸序列与其他猪肺炎支原体菌株如232株和JN F65株在 某些位置不同，可为该菌株的分子生物学鉴定做分子标记；该菌株可用于制备猪支原体灭 活疫苗。
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1. 一种猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，该菌株已于2014年12 月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。
[0008] 2.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株，其P46基因的部分碱基序列为：
[0009] AGTAATGATT CTATTCGAAT AGCACTAACC GATCCGGATA ATCCTCGATG AATTAGTGCC 60 CAAAAAGATA TTATTTCTTA TGTTGATGAA ACAGAGGCAG CAACTTCAAC AATTACAAAA 120 AACCAGGATG CACAGAATAA CTGACTCACT CAGCAAGCTA MtTTAAGCCC AGCGCCAAAA 180 GGATTTATTA TTGCGCCTGA AAATGGAAGT GGAGTTGGAA CTGCTGTTAA TACAATTGCT 240 GATAAAGGAA TTCCGATTGT TGCCTATGAT CGACTAATTA CTGGATCTGA TAAATATGAT 300 TGGTATGTTT CTTTTGATAA TGAAAAAGTT GGCGAATTAC AAGGTCTTTC ACTTGCGGCG 360 GGTCTATTAG GAAAAGAAGA TGGTGCTTTT GATTCAATTG ATCAAATGAA TGAATATCTA 420 AAATCACATA TGCCCCAAGA GACAATTTCT TTTTATACAA TCGCGGGTTC CCAAGATGAT 480 AATAATTCCC AATATTTTTA TAATGGTGCA ATGAAAGTAC TTAAAGAATT AATGAAAAAT 540 TCGGGAAATA AAATAATTGA TTTATCTCCT GAAGGCGAAA ATGCTGTTTA TGTCCCAGGA 600 TGAAATTATG GGACTGCCGG TCAAAGAATC CAATCTTTTC TAACAATTAA CAAAGATCCT 660 CAAGGCGGTA ATAAAATCAA AGCTGTTGGT TCAAAACCAG CTTCTATTTT CAAAGGATTT 720 CTTGCCCCAA ATGATGGAAT GGCCGAACAA GCAATCACCA AATTAAAACT TGAAGGATTT 780 GATACCCAAA AAATCTTTGT AACTGGTCAA GATTATAATG ATAAAGCCAA AACTTTTATC 840
[0010] AAAGACGGCG ATCAAAATAT GACAATTTAT AAACCTGATA AAGTTTTAGG AAAAGTTGCT 900 GTTGAAGTTC TTCGGGTTTT AATTGCAAAG AAAAATAAAG CATCTAGATC AGAAGTCGAA 960 AACGAACTAA AAGCAAAGCT ACCAAATATT TCATTTAAAT ATGATAATCA AACATATAAA 1020 GTGCAAGGTA AAAATATTAA TACAATTTTA GTAAGTCCAG TAAT 1064
[0011] 对应的氨基酸序列为：
[0012]
[0013]
)
[0018] 4.本发明所述猪肺炎支原体疫苗株S株的应用，其特征在该菌株可作为疫苗生产 菌株用于制备猪肺炎支原体灭活疫苗。
[0019] 本发明的详细描述
[0020] -、猪肺炎支原体的分离及鉴定
[0021] 1.病料来源：
[0022] 菌株分离自吉林松原某猪场发病猪的肺组织，经PCR检测该病料无蓝耳病、猪瘟、 伪狂犬、传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等病原感染，病料经匀浆处理后，按（V/ V) 1 : 10接种到本公司自制的LPS培养基（LPS培养基成分：PPLO 5g、酵母粉10g，葡萄糖 5g，Hanks液1000ml，猪血清10 %~20% ;适宜pH值：7. 4~7. 8,培养温度为37 °C )，37 °C 培养7~10日，连续传代3~5代，分离物可在LPS培养基上37°C培养72~96小时，培养 基pH值由L 6降至6. 8~6. 9。
[0023] 2.培养条件
[0024] 取以上液体培养物，按10% (V/V)接种LPS培养基，37°C培养72~96小时，培养 基pH值由7. 6降至6. 6~6. 8,培养物呈均一稍浑池的棕红色，无沉淀。培养物经无菌检 验，应无菌生长。
[0025] 3.血清学鉴定
[0026] 取以上培养物，将培养物稀释至KT4~l(T5(XU/mL，分别用猪肺炎支原体阳性血清 进行代谢抑制试验，结果显示猪肺炎支