专利名称：猪肺炎支原体dj-166株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医微生物技术领域，特别涉及猪肺炎支原体DJ-166株及其应用。
背景技术：
猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但分离株之间抗原性有很大差异。1992年Frey首次证实了猪肺炎支原体分离株之间抗原性的差异；1996年,Artiushin和Minion进一步证实了 Frey的观点；1999年,Kokotovic也同样证实了这一结论。因此，分离出一株抗原性较好的猪肺炎支原体菌株进行疫苗和诊断试剂盒应用，对防治猪支原体肺炎至关重要，特别是分离出一株适合制备灭活疫苗的菌株，将填补国内无自主研发猪喘气病灭活疫苗的空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一株新的抗原性好的猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)。本发明的另一目的在于提供该株猪肺炎支原体在制备用于猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药中的应用。本发明还提供了该株猪肺炎支原体在制备疫苗或免疫诊断用试剂盒中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的:本发明提 供一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株,其微生物保藏号为 CGMCC N0.4545。本发明的猪肺炎支原体DJ-166株可用于制备猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药。进一步，本发明的猪肺炎支原体DJ-166株可用于制备疫苗。所述的疫苗包括:灭活疫苗、基因工程疫苗。本发明的猪肺炎支原体DJ-166株也可用于制备免疫诊断用试剂盒。所述的免疫诊断用试剂盒包括抗体检测试剂盒、抗原检测试剂盒。有益效果本发明的猪肺炎支原体DJ-166株CGMCC N0.4545为申请人自行分离得到，在制备的无细胞培养基中培养，活菌滴度可达IOltl 10nCCU/ml，降低生产成本；其免疫原性好，平均肺炎病变减少率可达80%以上。本发明的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，以江苏省地方标准(DB32/T 1461-2009)猪肺炎支原体检测PCR法，设计引物扩增出特异性猪肺炎支原体P36基因片段，经过基因测序后，初步确定为猪肺炎支原体。然后又经多重PCR(猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体)、培养特性、生化特性和血清学特性鉴定，证明为猪肺炎支原体，纯净。菌株在人工合成培养基传8代稳定后，经过3次克隆纯化后制备得到该株猪肺炎支原体。本发明的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编:100101，保藏编号为=CGMCC N0.4545。
图1猪肺炎支原体DJ-166株PCR鉴定其中，M =DNA标准DL 2000 ； 1:DJ_166株扩增产物；2:阳性对照；3:阴性对照图2猪肺炎支原体DJ-166株多重PCR鉴定其中，M =DNA标准DL 2000 ；1:阴性对照；2:猪肺炎支原体阳性对照；3:组织样品(DJ-166株)；4:猪鼻支原体阳性对照；5:猪絮状支原体阳性对照；6:猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体阳性对照·图3猪肺炎支原体DJ-166株菌落间接表面荧光试验结果
具体实施例方式通过下列实施例将更具体说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。实施例1本发明猪肺炎支原体DJ-166株分离鉴定I培养基及其配制液体培养基:A液:脑心浸出液2.0g、PPLO肉汤5.0g、去离子水300ml以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116°C高压灭菌20分钟，冷却后备用；B液:10XHank’ s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠
0.8g、fe蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.lg、0.1%酹红10ml、青霉素400U/ml、去离子水545ml。以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；C液:健康马血清140ml将A液、B液和C液充分混合均匀，lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6，制得猪肺炎支原体液体培养基。固体培养基:在1000ml液体培养基的基础上添加:琼脂8.0g。2病肺组织采集用每毫升含2000个单位青霉素的生理盐水洗去血液和组织碎片后，无菌操作剪取有猪喘气病特征病变和健肺交界处肺组织块。3病料PCR鉴定按照江苏省地方标准(DB32/T 1461-2009)猪肺炎支原体检测PCR法进行。3.1引物设计与合成Pl (序列 I):5，-TTACAGCGGGAAGACC-3’P2(序列 2):5，-CGGCGAGAAACTGGATA-3’预计扩增片段长度约为427bp。3.2病料DNA提取
取约1.0g病料，剪碎后匀浆器加5.0ml液体培养基研磨成糊状，先低速4000r/min离心2min,上清再以12000r/min离心20min,弃上清,沉淀用250 μ ITE缓冲液重悬。煮沸IOmin, 12000r/min离心3min,取上清-20°C保存备用。3.3PCR 反应PCR 扩增体系为:10 X buffer 5.0 μ I，MgCl2 (25mM) 2.0 μ I，dNTP (2.5mM) 3.0 μ I，引物 Ρ1(50ρπιο1/μ 1)0.5 μ 1，引物 Ρ2(50ρπιο1/μ 1)0.5 μ I，模板 DNA 2.0 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1)0.2μ 1，加双蒸水至50μ I。反应条件为:95°C预变性8min，80°C Imin进行热启动后加酶，98°C变性ls，49°C退火lmin，72°C延伸2min，34个循环，72°C终延伸lOmin。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。病料组织扩增片段长度约为427bp，见图1。4菌株驯化及克隆纯化4.1病料处理及菌株驯化将猪肺炎支原体PCR检测阳性病料用每毫升含2000个单位青霉素生理盐水洗去血液和组织碎片后，将猪肺炎病灶及其邻近健康组织剪成芝麻粒大颗粒，接入含50%猪鼻支原体特异性血清、0.001%醋酸铊和每毫升含800单位青霉素的液体培养基中，共接种2管，每管放入10粒，置37°C培养。每间隔6日盲传I次，每日观察培养基pH变化，前3代均加入50%猪鼻支原体特异性血清。在传至第5代时，培养基颜色发生改变，传至8代后，即可出现PH规律性下降。4.2克隆纯化将传至第8代收获的培养物进行10倍系列稀释至10_1(1，将10' 10_4、10_53个稀释度分别取出0.1ml接种于固体培养基平板上，置37±1°C 5% CO2培养箱培养10日，可见针尖大小菌落，在显微镜下挑取边缘整齐、外周质地疏松、中央致密单个菌落，接种液体培养基，37±1°C培养7日。按以上方法对菌落连续克隆3次后的培养液作为第I代菌种，命名为 DJ-166 株。5PCR鉴定及测序5.1PCR 鉴定将克隆后收获菌液提取的DNA按照上述3.3项进行PCR反应，结果均扩增出约427bp的目的片段。5.2多重PCR鉴定
5.2.1多重PCR引物序列mhp-f (序列 3):5’ -TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3，；mhr-f (序列 4):5，-GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3，；mfl-f (序列 5):5，-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3，；m-r (序列 6):5，-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3，；预计猪肺炎支原体扩增片段长度约为IOOObp ;猪鼻支原体扩增片段长度约为1129bp，猪絮状支原体扩增片段长度约为754bp。5.2.2 多重 PCR 反应PCR 扩增体系为:10Xbuffer 5.0 μ I, MgCl2 75nM, dNTP ΙΟηΜ，上游引物均为8pmol,下游引物为 12pmol,模板 DNA 2.0 μ I, Taq 酶(5U/ μ I) 0.2 μ 1，加双蒸水至 50 μ I。反应条件为:95°C预变性8min，94°C变性30s，54.6°C退火30s，68°C延伸lmin，30个循环，72°C终延伸lOmin。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。筛选出无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的猪肺炎支原体菌株。5.3PCR产物的回收与测序用凝胶回收试剂盒回收无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的猪肺炎支原体菌株PCR扩增为427bp的目的片段，将其克隆入pEASY-Tl载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定后由美国Invitrogen生命技术公司，用M13F引物测序,进行序列分析。测序结果(序列7)如下:CGGCGAGAAACTGGATATTCAAGTTCTTATTCGTAATTTGAGCTATCAATTCCGGTTAGTTTAGAATAAGCACAGAAACATTCACCGGCAATTTTAATATTTGAATAAGCAACAAAAGATGAATCACCATGTTCACCCATCACGTAGGCCTGAACCGAATTAGGCGATACTTTTGCTCTTTTTGCGATTGCAAATTGAAGCCTTGCTGTATCTAAAACAGTTCCACTACCGATAACTTTTTGATCGGAAAATCCAGATGCATCCCGGTAAGCCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAACAATAATACTTATTCCACTAAAGCCACTTTCTTTGACTTTTAGTGCAATTTCCCGGATAATTCGGATGTTATCAGCTACTAATTCAAGCCGAGTTTCACCCGGTTTTTGTGGTCTTCCCGCTGTAA应用DNAStar软件将测序片段与猪肺炎支原体已公开序列的J株、168株、7448株和232株进行序列片段比对 ，猪肺炎支原体DJ-166株在碱基29位为A，J株为T ;在碱基47位，DJ-166株为C，168株为T ;在碱基48位，DJ-166株为A，7448株为G ;在碱基79位、258位和402位，DJ-166株分别为C、T、C，232株为T、A、T。经NCBI Blast分析结果显示，DJ-166株与J株、168株、7448株、232株同源性为99 %，进一步证明分离株为猪肺炎支原体。实施例2本发明猪肺炎支原体DJ-166株生物学特性I培养特性将猪肺炎支原体DJ-166株接种于液体培养基中，37土 1°C 5% CO2条件下，培养5-9日，菌液呈轻度混浊，pH由7.6下降至6.5-7.0 ;在固体培养基上，生长缓慢，5% 二氧化碳、37土 1°C条件下培养7-10日，可见针尖大小菌落，显微镜下观察可见边缘整齐、外周质地疏松、中央致密菌落；将猪肺炎支原体DJ-166株菌液接种含青霉素和醋酸铊的培养基中，菌液生长无抑制。2形态和生化特性菌液涂片姬姆萨染色后，油镜观察呈多形性，可见到环状、丝状、点状、杆状或两极状等无细胞壁菌体；具有代谢葡萄糖产酸的生化特性。3血清学特性3.1生长抑制试验在含有猪肺炎支原体抗血清的固体培养基表面，37°C 5% CO2恒温培养箱培养10，无菌落生长，呈现特异的猪肺炎支原体生长抑制。3.2代谢抑制试验在含有猪肺炎支原体抗血清的液体培养基中，37°C恒温培养箱培养15日，pH值不下降，呈现特异的葡萄糖代谢抑制。4间接菌落表面免疫荧光试验菌落与支原体特异性抗体反应，与标记抗体结合后，荧光显微镜下观察呈现明亮的黄绿色荧光，见图3。5溶血试验挑取菌落接种于含鸡红细胞的固体培养基上培养2-3，菌落周围无溶血现象。6精氨酸利用试验挑取菌落接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中，指示剂不变色，试验为阴性。7薄膜和斑点形成试验挑取菌落接种于含马血清的固体培养基上，菌落表面和周围不形成薄膜和斑点。8红细胞吸附试验
将0.25%鸡红细胞液滴加于菌落上，静止后弃去红细胞液，用生理盐水冲洗2-3次，低倍镜下菌落表面和周围吸附有大量红细胞。实施例3猪肺炎支原体DJ-166株活菌滴度测定猪肺炎支原体DJ-166株在制备的无细胞培养基中(配制原料及方法见实施例1)，活菌滴度测定结果为101(ι-10η(Χυ/πι1，见表I。表I猪肺炎支原体DJ-166株3次活菌浓度测定结果
权利要求
1.一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166 株，保藏号为 CGMCCN0.4545。
2.权I所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备用于猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药中的应用。
3.权I所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备疫苗中的应用。
4.权I所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备灭活疫苗或基因工程疫苗中的应用。
5.权I所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备免疫诊断用试剂盒中的应用。
6.权I所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备猪肺炎支原体抗体检测试剂盒中的应用。
7.权I所述的猪肺炎支 原体DJ-166株在制备猪肺炎支原体抗原检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于兽医微生物技术领域，特别涉及猪肺炎支原体DJ-166株及其应用。该株猪肺炎支原体可用于制备成预防用兽用生物制品或兽药。实验证实本发明的猪肺炎支原体DJ-166株在制备的无细胞培养培养基中，活菌滴度高，均达到1010-11CCU/ml，可大大降低生产成本；其免疫原性好，平均肺炎病变减少率可达80％以上。
文档编号C12R1/35GK103184171SQ201110450029
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者车艳杰, 王海燕, 王勇鹣, 张锋, 高玉梅, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司