专利名称：猪流感二价灭活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪流感疫苗的制备方法，特别涉及猪流感二价灭活疫苗的制备方法以及由该方法制备得到的二价灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪流感(Si)是由A型流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，是猪呼吸疾病综合征(PRDC)的常见成员。由猪流感病毒(SIV)引起的呼吸道疾病的特征是突发并在猪群中迅速传播、咳嗽、鼻液、呼吸困难、发热、衰竭、迅速康复或死亡，动物剖检可见肺脏牛肉样实变，病理组织观察可见病毒性肺炎，肺组织内大量炎性细胞侵润。猪流感会导致患病猪容易继发和并发其他病毒病和细菌病，如蓝耳病，传染性胸膜肺炎，猪链球菌病等并发或继发感染，使病情复杂化，严重化，导致猪死亡率急剧上升，从而造成严重的经济损失，已成为严重危害许多国家猪群的疾病。猪呼吸道内存在着能结合猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的受体，3种流感病毒在猪体内重组产生出新病毒的可能性很大，猪体充当着流感病毒的 “混合器”，是流感流行的潜在因素。因此，研制猪流感疫苗具有重要的公共卫生学意义。目前已发现的 SIV 至少有 HlNl、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2 7 种不同血清亚型，广泛流行于猪群中的主要有古典型猪Hmi、类禽型Hmi和类人型H3N2毒株。刘金华等对我国广东、福建、辽宁、北京、河南等省市猪群持续开展了的猪流感病毒及血清学监测， 结果，猪流感Hmi亚型病毒的分离率达0. 51 %，H3N2亚型分离率为0. 31 %。猪流感疫苗的效果主要取决于猪群中流行的病毒与疫苗中病毒株的抗原性的“匹配”程度，一般选用本地分离的优势毒株制备疫苗可有效预防当地的猪流感的发生。另外， 采用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和禽流感灭活疫苗经典的方法。
发明内容
本发明目的之一是提供一种能够对由Hmi或H3N2亚型流感病毒引起的猪流感起到很好预防作用的猪流感二价灭活疫苗；本发明目的之二是提供一种制备猪流感二价灭活疫苗的方法；本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一种预防Hmi或H3N2亚型流感病毒引起的猪流感的二价灭活疫苗，包括猪流感病毒Hmi亚型抗原、猪流感病毒H3N2亚型抗原和免疫佐剂。本发明猪流感二价灭活疫苗的毒种为Hmi亚型病毒和H3N2亚型病毒，其中，所述猪流感Hmi亚型病毒优选是猪流感Hmi LN株，其微生物保藏号是CGMCC No. 4141 ；所述 H3N2亚型病毒优选是猪流感H3N2 HLJ株，其微生物保藏号是CGMCC No. 4142。均具有很好的特异性和免疫原性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的Hmi 或H3N2亚型病毒引起的猪流感。一种制备上述猪流感二价灭活疫苗的方法，包括(1)将细胞系进行传代和培养，细胞长满90-100% ； (2)将猪流感Hmi亚型、猪流感H3N2亚型鸡胚毒分别接种长满90-100%细胞的介质上，用细胞维持液培养，制备生产种毒；C3)将所制备的生产种毒分别接种长满90-100%细胞的介质，用细胞维持液培养，得到猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液；(4)将猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感H3N2病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，混合均勻，加入免疫佐剂，乳化，即得。其中，步骤(1)、⑵或(3)中所述的传代细胞系如下列，但并不仅限于下列细胞MDCK细胞系、MDBK细胞系、vero细胞系、BHK-21细胞系、CEF细胞系、PBS-I细胞系、 Marc-145细胞系、PER-C6细胞系、MEK细胞系或FI hk-4细胞系。步骤(1)中所述细胞系的传代和培养包括将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90-100%时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞培养方法优选为以下任意一种在转瓶中培养，使其细胞密度达到2X 105-6X 105/ml ；在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使细胞密度达到 2X 106-5X 106/ml，所述的附着载体优选为微载体或纸片；步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度优选是33-37°C，所述的细胞培养环境是 5% CO2 ；所述的病毒培养时间优选为30-72小时；步骤⑵或(3)中所述的接种量为0. 15-2%细胞毒种或MOI为0. 002-0. 005细胞毒种。步骤⑵或(3)中所述的维持液的组成包括含0. 5-2 μ g/ml胰酶的无血清的MEM 或 DMEM，pH 7. 0-7. 2。步骤(4)中所述的灭活剂优选为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度优选为 0. 002-0. 003M ；所述的中和优选用3. 015M的硫代硫酸钠进行中和，硫代硫酸钠的终浓度为 0. 02M。步骤(4)中两种抗原液的以等抗原含量进行混合，所述的抗原为46体积份数，每剂量疫苗中两种抗原含量为480-960HAU，。步骤中所述的乳化剂优选是206佐剂，所述的佐剂为M体积份数。本发明还提供了另外一种制备上述猪流感二价灭活疫苗的方法，包括(1)将猪流感Hmi亚型病毒、猪流感H3N2亚型病毒鸡胚毒分别接种鸡胚，收获尿囊液，制备生产种毒；C3)将所制备的生产种毒分别接种鸡胚，收获尿囊液，得到猪流感Him亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液；(3)将猪流感Hmi亚型抗原液和猪流感H3N2抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，混合均勻，加入免疫佐剂，乳化，即得。其中，步骤(1)或O)中所述的鸡胚选自SPF或非免的9-11日龄鸡胚；步骤⑴ 或(2)中所述的接种量为0. 2-0. 5%鸡胚毒种；步骤(3)中所述的灭活剂优选为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度优选为0. 002-0. 003M ；所述的中和优选用3. 015M的硫代硫酸钠进行中和，其终浓度为0.02M;步骤(3)中两种抗原以等抗原含量进行混合，每剂量疫苗中两种抗原含量均为480-960HAU ；步骤( 中所述的乳化剂优选是206佐剂；更优选的，将抗原与佐剂按照46 M的体积比例进行混合乳化。采用本发明培养生产的猪流感二价灭活疫苗(Hmi+H3N》免疫猪后，有80%以上猪产生免疫保护，全部合格。
图1本发明二价灭活疫苗的工艺流程图。图2疫苗免疫动物后抗Hmi血凝抑制抗体效价增长曲线。图3疫苗免疫动物后抗H3N2血凝抑制抗体效价增长曲线。图4免疫动物在Hmi亚型强毒攻击后动物体温变化曲线。图5免疫动物在H3N2亚型强毒攻击后动物体温变化曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1猪流感Hmi和H3N2亚型病毒的分离鉴定利用鸡胚从辽宁省临床发病猪鼻拭子中分离出猪流感Hmi亚型病毒，从黑龙江省临床发病猪鼻拭子中分离出H3N2亚型病毒，利用RT-PCR，测序，血凝抑制试验和动物接种试验进行了鉴定，分别命名为猪流感病毒Hmi亚型辽宁株(SIV-H1N1LN株)和猪流感病毒H3N2亚型黑龙江株(SIV-H3N2HLJ株)，并在鸡胚或传代细胞系上传代适应，纯化，鉴定后作为毒种。将所分离的猪流感Hmi LN株和H3N2 HLJ株分别提交到专利认可的机构包藏，其中，猪流感Hmi LN株的微生物保藏号是CGMCC No. 4141 ；分类命名是猪流感病毒Hmi 亚型；另外，猪流感H3N2HLJ株的微生物保藏号是CGMCCNo. 4142 ；分类命名是猪流感病毒H3N2亚型；保藏时间是2010年9月3日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其中，猪流感Hmi亚型病毒LN株主要具有如下特性1、发病猪除出现明显的呼吸道症状外，喉头大量粘液，出血点，剖检可见肺脏大面积牛肉样实变，气管和支气管内大量泡沫样粘液；2、接种猪流感Hmi血凝抑制抗体效价不高于20的健康易感断乳仔猪可复制出与临床症状极为相似的病状，明显的吸道症状，肺脏大面积牛肉样实变，气管和支气管内大量泡沫样粘液；3、分离得到的病毒能凝集0. 5%鸡红细胞；4、将该毒株与Hmi阳性血清作用后，不能凝集0. 5%鸡红细胞，具有较好的特异性；5、灭活后制备疫苗对Hmi亚型强毒攻击具有较好的保护，LN株具有较好的免疫原性。6、LN株病毒亚型鉴定以表1内特异性引物RT-PCR扩增HA和NA基因，其核苷酸序列序列分别为SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2所示。表1鉴定猪流感Hmi和H3N2亚型病毒引物表序列名称上游引物序列(5' -3')下游引物序列(5' -3')HlH l-F-AGCAMAGCAGGGGATAATCAAHl-R-ACAAGGGTGTTTTTCCATNlNl-F-CTACTTGTCAATGGTGAATGN1-R-TGAATCCAAATCMAAGATAATH3H3-F-AGCAMAGCAGGGGATACH3-R-ACAAGGGTGTTTTTAATCATN2N2-FGCAAAAGCAGGAGTGAAAAGATGAAN2-R-ACAACTTGAGCTGGACCATGCTA 其中，猪流感H3N2亚型病毒HLJ株具有如下特性1、发病猪除出现明显的呼吸道症状外，喉头大量粘液，出血点，剖检可见肺脏大面积牛肉样实变，气管和支气管内大量泡沫样粘液；2、接种猪流感H3N2血凝抑制抗体效价不高于20的健康易感断乳仔猪可复制出与临床症状极为相似的病状，明显的吸道症状，肺脏大面积牛肉样实变，气管和支气管内大量泡沫样粘液，喉头大量粘液，出血；3、分离得到的病毒能凝集0. 5%鸡红细胞；4、将该毒株与H3N2阳性血清作用后，不能凝集0. 5%鸡红细胞，具有较好的特异性；5、灭活后制备疫苗对H3N2亚型强毒攻击具有较好的保护，HLJ株具有较好的免疫原性。6、HLJ株病毒亚型鉴定以表1内特异性引物RT-PCR扩增HA和NA基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示。实施例2利用MDCK细胞培养生产猪流感二价灭活疫苗(1)将猪流感 HlNl LN 株(CGMCC No. 4141)和 H3N2 HLJ 株(CGMCCNo. 4142)鸡胚毒，按0. 2-0. 5%的接毒量接种于长满的MDCK细胞(购于中国科学院上海细胞资源中心)， 30-4 左右收获细胞培养物，-70°C冻融1次，按0. 15-2%或MOI 0. 002-0. 005的接毒量在 MDCK细胞上进行繁殖和噬斑克隆纯化，获得了纯净的种毒。(2)选择MDCK细胞系作为制苗用细胞；(3)上述MDCK细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，加细胞生长液(92_94% MEM液或DMEM液，6-8%的小牛血清，pH值为7. 0-7. 2)转瓶培养，细胞长满90-100%时，用于继续传代或接种病毒；微载体或纸片悬浮培养时，以转瓶培养的细胞消化后向细胞培养反应器中接种1 X 105-2X IO5细胞/mL的细胞，载体上80-90%汇满细胞，实现细胞的连续传代或接毒；(4)毒种的繁殖取生长良好的上述MDCK细胞，用PBS洗2次，将种毒按0. 15-2% 或MOI 0. 002-0. 005的接毒量进行接种；加入维持液(含0. 5-2 μ g/ml胰酶的无血清的 MEM或DMEM，pH 7. 0-7. 2)或用胰酶处理病毒1小时后，加入MEM或DMEM，胰酶终浓度为 0. 5-2 μ g/ml，33-37°c继续培养，30-60小时细胞80%出现CPE时收细胞培养毒液作为生产
用毒种；毒种鉴定按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且每毫升毒种病毒含量不低于105_tlTCID5tl ；
(5)制苗毒液的繁殖当上述细胞已长满90-100%时，弃去细胞生长液，用PBS洗 2次，按0. 15-2% MOI 0.002-0. 005的接毒量接入毒种，加入维持液(含0. 5-2 μ g/ml胰酶的无血清的MEM或DMEM，pH 7. 0-7. 2，或用胰酶(终浓度为0. 5-2 μ g/ml)处理病毒1小时后，加入MEM或DMEM，30-60小时细胞80%出现CPE时收细胞培养毒液作为制苗用毒液；收获的毒液置-20°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。每毫升病毒液血凝效价不低于2560HAU ；(6)灭活及乳化将检验合格的Hmi和H3N2病毒培养液，分置于不同容器内，加入BEI灭活剂终浓度为0. 002M-0. 003M,灭活M小时，充分摇勻，再加入3. 015M的硫代硫酸钠进行中和，终浓度为0. 02M。将灭活的两种抗原按等抗原含量进行混勻，每剂量疫苗中两种抗原含量为960HAU。将抗原缓缓注入206佐剂内，保持30°C，按抗原为46体积份数，佐剂为M的体积份数进行混合乳化。迅速降温至15°C，4°C放置M小时勿摇动，分装即得成
P
ΡΠ O成品检验按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌和支原体生长。本实施例制备的猪流感二价灭活疫苗(H1N1 LN株+H3N2 HLJ株)，每剂量内每种抗原的血凝价为960HAU，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。实施例3利用Vero细胞培养生产猪流感二价灭活疫苗参照与实施例2基本相同的步骤进行本实施例猪流感二价灭活疫苗的制备，采用 Vero细胞培养猪流感Hmi和H3N2病毒，制备猪流感二价灭活疫苗(1)将猪流感Hmi LN株和H3N2 HLJ株鸡胚毒，按0. 2-0. 5%的接毒量接种长满 90-100%的Vero细胞上(购于中国科学院上海细胞资源中心)，30-48h左右收获细胞培养物，-70°C冻融1次，按0. 15-2%或MOI为0. 002-0. 005的接毒量在Vero细胞上进行扩繁和噬斑纯化共7代，获得了纯净的种毒。(2)选择Vero细胞系作为制苗用细胞；(3)其余步骤完全同实施例2进行。本实施例制备的猪流感二价灭活疫苗(HmiLN株+H3N2HLJ株)，每批疫苗每剂量内每种抗原的血凝价为960HAU，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。实施例4利用MDBK细胞培养生产猪流感二价灭活疫苗参照与实施例2基本相同的步骤进行，采用MDBK细胞培养猪流感Hmi和H3N2病毒，制备猪流感二价灭活疫苗(1)将猪流感HmiLN株和H3N2HLJ株鸡胚毒，按0.2-0. 5%的接毒量接种长满 90-100%的MDBK细胞上(购于中国科学院上海细胞资源中心)，30-48h左右收获细胞培养物，-70°C冻融1次，按0. 15-2%或MOI为0. 002-0. 005的接毒量在MDBK细胞上进行扩繁和纯化共7代，获得了纯净的种毒。(2)选择MDBK细胞系作为制苗用细胞；(3)其余步骤与实施例2相同。本实施例制备的猪流感二价灭活疫苗(HmiLN株+H3N2HLJ株)，每批疫苗每剂量内每种抗原的血凝价为960HAU，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。
实施例5利用鸡胚培养生产猪流感二价灭活疫苗采用9-11日龄SPF鸡胚或非免鸡胚培养猪流感Hmi和H3N2病毒，制备猪流感二价灭活疫苗(1)将猪流感HmiLN株和H3N2HLJ株鸡胚毒按0. 2-0. 5 %的接毒量尿囊腔接种 9-11日龄SPF或非免鸡胚，弃去M小时内死亡鸡胚，24-72h后，置4°C过夜，无菌收获尿囊液。(2)选择9-11日龄SPF鸡胚或非免鸡胚作为制苗用鸡胚；(3)按0.2-0. 5%的接毒量接种9-11日龄SPF鸡胚或非免鸡胚，弃去M小时内死亡鸡胚，24-72h后，置4°C过夜，无菌收获尿囊液，获得制苗用抗原液。(4)其余步骤同实施例2相同。本实施例制备的猪流感二价灭活疫苗(HmiLN株+H3N2HLJ株)，每批疫苗每剂量内每种抗原的血凝价为960HAU，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。试验例1本发明猪流感二价灭活疫苗免疫效力试验使用4周龄猪流感Hmi亚型和H3N2亚型抗体阴性健康断乳仔猪20头，试验分二组。一组为免疫组，10头猪，颈部肌肉接种猪流感二价灭活疫苗(本发明实施例2-5所制备)，aiil/头，首免14日后进行二免；另一组为对照组，10头猪。二次免疫接种后14日，将免疫组和对照组平分为两组，一组用SIV-Hmi亚型强毒(为本发明人实验室保存)进行攻击；一组用SIV-H3N2亚型强毒(为本发明人实验室保存)进行攻击。结果Hmi攻毒组对照猪有5/5发病，免疫猪4/5保护，H3N2攻毒组对照猪5/5发病，免疫猪5/5保护。
权利要求
1.一种猪流感二价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪流感的二价灭活疫苗包括抗原和免疫佐剂所述的抗原由二乙烯亚胺灭活的猪流感一个亚型病毒和另一亚型病毒以等抗原含量混合而成，所述的抗原为46体积份数；所述的免疫佐剂为206佐剂，所述免疫佐剂为 54体积份数。
2.根据权利要求1所述的猪流感二价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪流感抗原为猪流感Hmi亚型病毒和猪流感H3N2亚型病毒。
3.一种制备权利要求1或2所述猪流感二价灭活疫苗的方法，包括(1)将细胞系进行传代和培养；(2)将猪流感Him亚型病毒和猪流感H3N2亚型病毒分别接种长满90-100%细胞的介质上，用维持液培养，制备生产种毒；(3)将所制备的生产种毒分别接种长满90-100%细胞的介质上，用维持液培养增殖得到猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液；(4)将猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，混合均勻，加入免疫佐剂，乳化，即得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)、(2)或(3)中所述的传代细胞系MDCK细胞系、MDBK细胞系、vero细胞系、BHK-21细胞系、CEF细胞系、PBS-I细胞系、 Marc-145细胞系、PER-C6细胞系、MEK细胞系或FI hk-4细胞系。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的细胞培养方法为以下任意一种在转瓶中培养，使其细胞密度达到2X 105-6X 105/ml ；在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使细胞密度达到2 X 106-5 X 106/ml。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)或(3)中所述的接种量为 0. 15-2%细胞毒种或MOI为0. 002 0. 005细胞毒种。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)或(3)中所述的细胞维持液的组成包括含0. 5-2 μ g/ml胰酶的无血清的MEM或DMEM。
8.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺， 其终浓度为0. 002 0. 003M ；所述的中和剂为3. 015M的硫代硫酸钠，其终浓度为0. 02M。
9.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)中两种抗原液以等抗原含量，每剂量疫苗中两种抗原含量为960HAU;步骤(4)中将抗原与佐剂按照46 M的体积比例进行混合乳化。
10.一种制备权利要求1所述猪流感二价灭活疫苗的方法，包括(1)将猪流感Hmi亚型和H3N2亚型病毒分别接种鸡胚，制备生产种毒；其中，所述猪流感Hmi亚型是猪流感Hmi LN株，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4141 ；所述H3N2亚型病毒是猪流感H3N2 HLJ株，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4142 ；(2)将所制备的生产种毒分别接种鸡胚，得到猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感 H3N2病毒抗原液；(3)将猪流感Hmi亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，混合均勻，加入免疫佐剂，乳化，即得。
11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于步骤(1)或(2)中所述的鸡胚选自9-11 日龄的SPF鸡胚或非免鸡胚；步骤(1)或O)中所述的接种量为0.2% 0.5%鸡胚毒种。
12.按照权利要求10所述的方法，其特征在于步骤(3)中两种抗原液以等抗原含量， 每剂量疫苗中两种抗原含量为480-960HAU ；步骤(3)中将抗原与佐剂按照46 54的体积比例进行混合乳化。
13.权利要求1或2所述的猪流感二价灭活疫苗在制备预防猪流感Hmi或H3N2亚型病毒的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供一种猪流感二价灭活疫苗，包括两种不同血清亚型的猪流感病毒抗原和佐剂，可以预防由该两种不同血清亚型的猪流感病毒引起的感染，降低临床上使用的成本，一针两防，且安全可靠。本发明还提供一种猪流感二价灭活疫苗的制备方法，采用鸡胚或传代细胞系培养生产猪流感二价灭活疫苗，本发明还对该灭活疫苗制备工艺中的各参数进行了优化。安全和效力检验结果显示本发明猪流感二价灭活疫苗免疫猪后有80％以上的猪产生了免疫保护。
文档编号A61K39/145GK102166352SQ20111009193
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者武华, 路伟 申请人:北京华威特生物科技有限公司