牛口蹄疫o型结构蛋白vp1抗体酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是牛口蹄疫 〇型病毒结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触传染性和快速远 距离传播的动物疫病，以传染性强、传播速度快、危害严重而著称。世界动物卫生组织（OIE) 将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一，我国将其列为一类动物传染病。
[0003] 口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产 能力急剧下降。该病传播迅速，可以引起世界性的大流行，不仅对畜牧业造成巨大的经济损 失，而且严重影响动物及其产品的国际贸易和声誉。由于FMD的巨大危害性，美国权威著作 《家畜传染病》早在1981年版中就声明：FMD不仅是经济性疾病，同时也是政治性疫病。
[0004] 口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒属。由"假"20面体对称的衣壳和 病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包 括衣壳和RNA两部分，衣壳由VPl，VP2，VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。结构 蛋白VPl大部分暴露在病毒粒子表面，是决定病毒抗原性的主要成分，也是刺激机体产生 中和抗体的主要蛋白。4种结构蛋白中VPl变异性最大，VP2较为保守，VP4最保守。病毒 衣壳蛋白的功能有：保护RNA免遭核酸酶降解；识别特异性细胞受体，决定宿主范围和组织 嗜性；决定病毒的抗原性；释放和传递病毒RNA通过细胞膜进入易感细胞内；指导选择和包 装病毒RNA。
[0005] 2004年OIE公布的口蹄疫血清学检测方法有3种：病毒中和试验（VNT)、液相阻 断ELISA(LPB-ELISA)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)，其中病毒中和试验是3种方法中最为 经典的方法，是评价其他方法的黄金标准。1996年，口蹄疫世界参考实验室建立了液相阻 断ELISA方法，经过不断完善和健全，已成为各国大规模血清学检测的方法，用于检测动物 免疫抗体、评估动物免疫状况、进行血清学调查等，该方法的敏感性、特异性和稳定性一直 在国际上得到公认，是目前使用最广的口蹄疫血清学检测方法。2001年，口蹄疫世界参考实 验室建立了固相竞争ELISA方法，该方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特 异性更好，操作更为简单（其操作时间仅为3. 5h)，2004年被OIE确立为口蹄疫血清学调查 的最新推荐方法。
[0006] 口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病。目前，大多数发展中国家和地区 都通过接种疫苗的方法来控制口蹄疫的流行。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测 为主的综合防控政策，通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防口蹄疫的感染和传播。 因此口蹄疫感染的快速诊断、牛免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控 口蹄疫的部分关键技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新的用于诊断口蹄疫易感动物牛是否感染口蹄疫0型 病毒的结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
[0008] 本发明提供还一种口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽，为序列表中序列1所 示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。
[0009] 本发明提供还一种口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽组合物，为由序列表中 序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成的混合 物。
[0010] 本发明的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫病毒结构蛋 白VPl抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫0型病毒结构蛋白 VPl抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序 列3所示的多肽。
[0011] 所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3 所示的多肽的质量比为（0.5~2.0) : (0.5~2.0) : 1，优选为I : 1 : 1。所涉及的包 被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有口蹄疫病毒结构蛋白VPl的主要抗原 位点，可与口蹄疫病毒感染后或免疫后产生的结构蛋白VPl抗体特异结合。所述酶标记抗 抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗牛IgG ; 所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。
[0012] 所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多 肽为化学人工合成得到。
[0013] 所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽包被的酶联反应板的最佳制备条件 是：将所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽溶于100 μ 1的pH9. 6的碳酸盐溶液，然 后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng，在37°C放置2~4h，再4~8°C下放置过夜 (8-12小时），使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300 μ 1/孔加入含有1 % (g/ ml)牛血清白蛋白（BSA)的PBS缓冲液（pH = 7. 4)，37°C封闭处理2~3h，用洗涤缓冲液 (浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液）洗涤后甩干，待酶联反应板 干燥后4 °C密封保存。
[0014] 所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色 液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0. 6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓 冲液；所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺（TMB)溶液，使用时两者以I : 1的比 例混合；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/ L的硫酸溶液。
[0015] 所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄 疫抗体的正常牛血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽 为免疫原免疫牛得到的血清；
[0016] 所述的阳性对照血清具体是以上述人工化学合成的包被抗原（口蹄疫病毒结构 蛋白VPl抗原表位多肽）作为免疫原，免疫6月龄健康黄牛（口蹄疫病毒抗体阴性）牛，制 备高免血清，加入l〇〇〇U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0. 2 μ m滤膜除菌，作为试剂盒的 阳性对照血清。
[0017] 所述的阴性对照血清是用6月龄健康黄牛（口蹄疫病毒抗体阴性）隔离观察7日 后，颈静脉无菌采集血液，加入l〇〇〇U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0. 2 ym滤膜除菌， 作为试剂盒阴性对照血清。
[0018] 所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0. 5% (g/ml)酪 蛋白的0· 01M、pH为7. 4的PBS缓冲液（过0· 45 μ m滤膜）；浓缩洗涤液：0.0说，？!17.4，含 有0. 5% (ml/ml)Tween-20和0. 05% (g/ml)叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液（经过0. 2μπι 滤膜除菌）。
[0019] 本发明试剂盒的检测程序为：
[0020] 1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混 匀。
[0021] 2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
[0022] 3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
[0023] 4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血 清按照1 : 21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加 100μΙ样本稀释液，分别加入5μ1待测 样本。
[0024] 5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100 μ 1阴性对照，2个阳性对照孔各 加100 μ 1阳性对照；其余孔分别按预先设定加100 μ 1稀释的待测样本。加样过程时间跨 度应尽量短。
[0025] 6、温育：震荡混匀，置37°C温箱或水浴锅中，反应30min。
[0026] 7、洗板：弃去反应液，每孔加300 μ 1稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液。连 续洗板4次后拍干。
[0027] 8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100 μ 1辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。
[0028] 9、温育：置37°C温箱或水浴锅中，反应30min。
[0029] 10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300 μ 1，浸泡15s，甩弃洗涤 液。连续洗板5次后拍干。
[0030] 11、显色：每孔分别加入100 μ 1的底物显色液（其中溶液A和溶液B以体积比为 I : 1的比例混合）。加盖，37°C恒温箱里反应15min;
[0031] 12、每孔分别加入50 μ 1终止液终止反应，混匀；
[0032] 13、测定每孔的0045。值（加终止液的反应板应在15min内读取OD