剂盒检测牛感染血清（牛血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，经鉴定为 牛口蹄疫O型病毒感染血清）和疫苗免疫后血清（牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清，由 中牧实业股份有限公司云南保山厂提供）的结果。使用实施例2制备的三批口蹄疫病毒结 构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒（批次N0ZM001、N0ZM002、N0ZM003)，依照实施例 3中牛口蹄疫O型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对200份牛口蹄疫O型 病毒感染血清及200份牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清检测敏感性试验。
[0130] 批号为N0ZM001试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染牛血清的敏感性为 195/200X100%= 97. 5%;对200份牛口蹄疫疫苗免疫牛血清的敏感性为198/200X100% =99%。批号为N0ZM002试剂盒的检测结果显示本试剂盒对200份感染牛血清的敏感性 为197/200 X 100 % = 98. 5 %;对200份口蹄疫疫苗免疫牛血清的敏感性为197/200 X 100 % =98. 5%。批号为N0ZM003试剂盒的检测结果显示试剂盒对200份感染牛血清的敏感性为 197/200X100%= 98. 5%;对200份口蹄疫疫苗免疫牛血清的敏感性为195/200X100% = 97. 5%〇
[0131] 实施例5、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
[0132] 使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的口蹄疫合成肽结构蛋白抗体 酶联免疫检测试剂盒的使用方法对300份健康牛血清（中牧实业股份有限公司保山厂和兰 州生物药厂提供）、1〇份牛口蹄疫亚洲I型（Asial)阳性血清（中牧实业股份有限公司兰 州生物药厂提供）、1〇份牛口蹄疫A型（A)阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药 厂提供）和10份牛病毒性腹泻病毒（BVDV)阳性血清（中牧实业股份有限公司兰州生物药 厂提供）分别进行检测。
[0133] 试剂盒的特异性检测结果如下表（表4)显示，对300份健康牛血清的检测结果显 示，N0ZM001试剂盒的特异性为99. 0%，N0ZM002试剂盒的特异性为98. 6%，N0ZM003试剂 盒的特异性为99. 3%。对10份牛口蹄疫亚洲I型（Asia I)阳性血清、10份牛口蹄疫A型 (A)阳性血清和10份牛病毒性腹泻病毒阳性血清检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒 对这30份阳性血清检测的特异性均为100%。
[0134] 表4. 口蹄疫合成肽结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果
[0135]
[0136] 实施例6、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒与同类制品比较试 验
[0137] 使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的牛口蹄疫0型结构蛋白VPl 抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对276份临床血清样本（中牧实业股份有限公司云 南保山厂、兰州生物药厂提供）进行检测，同时使用上海优耐特生物医药公司（UBI)生产 的牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒对该276份临床血清 进行平行检测，操作方法与判定标准分别按照（UBI)说明书的操作步骤及判定标准进行。 上海优耐特生物医药公司的牛、羊口蹄疫病毒VPl结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试 剂盒的判定标准：（1)阴性对照孔平均OD值应< 0. 15,每个阳性对照孔OD值应多0. 9,且 < 1.9.否则，试验无效。临界值=0.23X阳性对照孔平均OD值。（2)被检样品孔OD值 <临界值时，判为阴性，即为抗口蹄疫病毒VPl结构蛋白抗体阴性。（3)被检样品孔(?值> 临界值，判为阳性。
[0138] 使用实施例4中的试剂盒检测276份血清，其阳性率为37. 0(102/276)，阴性率 为63.0% (174/276)。上海优耐特生物医药公司（UBI)的牛、羊口蹄疫病毒VPl结构蛋白 抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒检测的阳性率为36. 2% (100/276)，阴性率为63. 8% (176/276)。两者的阳性符合率为98. 0% (100/102)，阴性符合率为98. 9% (174/176)。两个 试剂盒对276份血清样本进行检测，共有258份血清的检测结果一致，其总符合率为93. 5 % (258/276)〇
【主权项】
1. 口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序 列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。2. 口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽组合物，为由序列表中序列1所示的多肽、 序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成的混合物；所述序列表中序 列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽的质量比为 (0.5 ~2.0) : (0.5 ~2.0) : 1〇3. -种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫病毒结构蛋白VPl 抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位 多肽选自序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示 多肽中的任意一种。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表 位多肽为由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所 示多肽组成的混合多肽；所述序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽及 序列表中序列3所示的多肽的质量比为（0.5~2.0) : (0.5~2.0) : 1;优选的，所述序 列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽的质量 比为I : 1 : 1。5. 根据权利要求3-4中任意一项，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过 氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗牛IgG ;优选的，所述酶标记抗抗 体优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG。6. 根据权利要求3-4中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96 孔酶标板；所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽为化学人工合成得到。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表 位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽溶 于100 y 1的pH 9. 6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙稀酶联反应板，每孔150ng，在 37°C放置2-4小时，再4-8°C下放置8-12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按 照300 y 1/孔加入含有lg/100ml牛血清白蛋白的pH7. 4的PBS缓冲液，37°C封闭处理2-3 小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4°C密封保存。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液； 当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为 含0. 6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0. 2mg/ml的四甲基 联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为 2mol/L的硫酸溶液。9. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳 性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常牛血清；所述阳性对照血清为以 所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽为免疫原免疫牛得到的血清；所述试剂盒还 包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有〇. 5% (g/100ml)酪蛋白的0. 01M、pH 为7. 4的PBS缓冲液；浓缩洗涤液：0. 01M，pH 7. 4,含有体积百分浓度为0. 8%~1. 2%的 Tween-20和0. 05g/100ml叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。10. 权利要求1所述的口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽或权利要求2所述的口 蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽组合物在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试 剂盒中的应用；其中，动物口蹄疫病毒病为牛口蹄疫病毒病；优选的，所述动物口蹄疫病毒 为牛口蹄疫O型病毒引起的牛口蹄疫病毒病。
【专利摘要】本发明公开了一种牛口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括牛口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。本试剂盒使用化学合成VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在口蹄疫病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
【IPC分类】G01N33/68, C07K14/09, G01N33/569
【公开号】CN104961809
【申请号】CN201510402149
【发明人】张蕾, 董春娜, 王楠, 肖进, 齐鹏, 栗利芳, 巴利民, 宋芳, 赵洪涛, 马爱荣, 蔺晓忠
【申请人】中牧实业股份有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月10日