45。值）。
[0033] 检测结果的判定：
[0034] 1、阴性对照OD45tl平均值应该彡0. 15,否则无效。
[0035] 2、阳性对照每个检测值应该在0. 9-1. 9之间，否则无效。
[0036] 3、临界值的计算：临界值=0. 17X阳性对照OD45tl值平均值。
[0037] 待检血清测定OD45tl值多临界值者判为阳性；待检血清测定OD 45(|值<临界值者判 为阴性。
[0038] 本发明的试剂盒，可用于检测口蹄疫结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染口 蹄疫病毒或接种口蹄疫疫苗，其中，动物口蹄疫病毒病为牛口蹄疫病毒病，具体可以为牛口 蹄疫〇型病毒引起的牛口蹄疫病毒病。
[0039] 上述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽或权利要求2所述的口蹄疫病毒结构 蛋白VPl抗原表位多肽组合物在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用 也属于本发明的保护范围。
[0040] 本发明的积极效果在于：
[0041] 本发明采用生物信息学方法对结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从VPl蛋白上 的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性 高、特异性强的优点。
[0042] 同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试 剂盒中的阳性对照血清。
[0043] 另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一 步提高了检测口蹄疫结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫 苗。
[0044] 总之，本发明利用VPl结构蛋白，建立一种特异性、敏感性和重复性好的间接 ELISA方法，为牛口蹄疫免疫抗体的检测和感染抗体的诊断提供一种简便有效的新方法，为 口蹄疫综合防控提供技术支持。本发明的口蹄疫病毒结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂 盒用于检测动物是否感染口蹄疫病毒或接种口蹄疫疫苗，有利于减少我国口蹄疫爆发所带 来的损失，也有利于我国口蹄疫防控体系的建立。
[0045] 本发明试剂盒采用化学合成结构蛋白VPl主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应 板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测口蹄疫病毒感染或接种灭活疫苗后 产生的结构蛋白VPl抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫苗，与牛口蹄疫 病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒联用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。实验 结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具 有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
【具体实施方式】
[0046] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0047] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0048] 实施例1、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
[0049] 本试验针对国内口蹄疫流行毒株的不同，采用生物信息学方法对口蹄疫0型病毒 VPl结构蛋白多个亚型进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出 根据流行毒株序列设计的3条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2和序列3所示，制成纯 度约90%的更新更全的包被抗原，能够适应口蹄疫病毒不断突变的特性，提高抗体阳性的 检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本 发明试剂盒的包被原。
[0050] 本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪（型号433A)制 备。运用 Merrif ield 固相合成法，米用的是 Fmoc (9_f luorenylmethyIoxycarbony 1，9-荷甲 氧羰基）修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗 原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
[0051] 一、包被抗原固相合成
[0052] 1、合成试剂的准备
[0053] 合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
[0054] 依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸（购自NOVA公 司），加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子 拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装 入合成仪。配制适量的合成试剂包括100%的NMP、3%的AM(己酰咪唑）、35%的PIP(哌 啶）、100%的MeOH(甲醇）等放置到相对应的试剂瓶中。
[0055] 2、合成仪状态的检测
[0056] 检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪 器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常（433A正常表压 10. 2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A 合成仪：发送Flow Ratel-18到合成仪，选择Main Menu-Module Test-按Prer或next找 Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)-按 Start-按 more 进行测量或观察，若 流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求（具体检测要求见下表1)。
[0057] 表1.多肽合成仪流速检测标准表
[0058]
[0059]
[0060] 3、包被抗原合成开始
[0061] 在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0 Sol DIC90到 合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry 是否为Std Fmoc 1.0 Sol DIC 90 ;Sequence是否为所存名字；设定Cycles;保存。最后发 送到合成仪上。
[0062] Main Menu-Cycle Monitor-begin，开始运行。
[0063] 4、包被抗原合成进行
[0064] Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱 除去，反应时用哌啶（PIP)进攻9-Η，β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳 定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出"-ΝΗ2"基团以进行合成反应。然后加入活化的下 一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三挫（1-hydroxybenzotriazole，Η0ΒΤ)至反应 器内。
[0065] 如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断 地重复合成步骤（合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用 量及运行情况。
[0066] 表2.包被抗原合成循环步骤
[0067]
[0068] 5、包被抗原合成结束
[0069] 包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂（肽现在还连接在树脂上） 基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100%甲醇洗涤肽树脂3次后，在通 风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入_20°C冰箱内，封口膜密 封备用。
[0070] 二、包被抗原的裂解及鉴定
[0071] 1、多肽抗原的裂解
[0072] 经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定 的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保 护基。步骤如下：
[0073] 从冰箱内取出合成的多肽树酯（指肽还连接在树脂上），放入一只2L的圆底烧瓶 内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA)、IOml的三丙 基硅烷（TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌Ih至 反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30~120min除去粗产品中的 TFA。然后用二甲基甲酰氨（DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂 心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
[0074] 2、包被抗原的鉴定
[0075] 多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法
[0076] (M0DAL-T0F)和反相高压液相色谱法（RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨 基酸分析来鉴定所合成的肽。
[0077] 3、包被抗原纯化
[0078] 将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤（用PALL公司生产的 Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的懦动泵），多肽抗原作为大 分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程