以及后期环化反应形成或引进的小分子杂 质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0. 2 μπι过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑 料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保 存条件，分装后，储存于-20°C或-40°C备用。
[0079] 4、包被抗原冷冻干燥
[0080] 为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多 肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的 包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保 存期限及保存条件。
[0081] 实施例2、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒的制备
[0082] 口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
[0083] (1)包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2X96孔。
[0084] (2)辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG多克隆抗体（购自SouthernBiotech公司， 货号 6030-05)，2 瓶（各 12ml)。
[0085] (3)阳性对照血清：是以实施例1中人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免疫6 月龄健康黄牛（口蹄疫病毒抗体阴性）制备的高免血清，加入lOOOU/ml链霉素和lOOOU/ml 青霉素，过0. 2 μ m滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。1管（Iml)。
[0086] (4)阴性对照血清：是用6月龄健康黄牛（口蹄疫病毒抗体阴性）隔离观察7日 后，颈静脉无菌采集血液，加入l〇〇〇U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0. 2 ym滤膜除菌， 作为试剂盒阴性对照血清。1管（1.5ml)。
[0087] (5)底物显色液：由两种溶液混合组成，溶液A为含0. 6mg/ml过氧化氢尿素的柠 檬酸磷酸盐缓冲液（1瓶（12ml));溶液B为0. 2mg/ml的四甲基联苯胺（TMB)溶液（1瓶 (12ml));使用时两者以体积比为I : 1的比例混合。
[0088] (6)浓缩洗涤液（20X):含有 0· 5% (ml/ml)Tween-20 和 0· 05% (g/ml)叠氮钠防 腐剂的0.0 lM磷酸盐缓冲液，pH为7. 4,后经过0. 2 μ m滤膜除菌。50ml/瓶，2瓶。
[0089] (7)终止液：2mol/L的硫酸溶液。1瓶（12ml).
[0090] (8)样品稀释液：含有0· 5% (g/ml)酪蛋白的0· 01M、pH为7. 4的PBS缓冲液，过 0· 45 μ m 滤膜。2 瓶（各 12ml)。
[0091] 根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板2块（96孔），用于血清样品的梯度稀释。
[0092] 其中，包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将 实施例1制备的多肽抗原溶于PH 9. 6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板， 每孔150ng(其中序列表中序列1所示的多肽与序列表中序列2所示的多肽及序列表中序 列3所示的多肽，三种多肽的质量比为I : 1 : 1)，在37°C放置2~4h，再4~8°C下放置 过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300 μ 1/孔加入含1 % (g/ml)牛血清白 蛋白（BSA)的PBS缓冲液（pH = 7. 4)，37°C封闭2~3h，用洗涤缓冲液（浓缩洗涤液用蒸 馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液）洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4°C密封保 存。
[0093] 实施例3、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验
[0094] -、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法
[0095] 1、平衡：将保存在4°C的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。
[0096] 2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
[0097] 3、设定：留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
[0098] 4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血 清按照1 : 21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加 100μΙ样本稀释液，分别加入5μ1待测 样本。
[0099] 5、加样：空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100 μ 1阴性对照，2个阳性对照孔各 加100 μ 1阳性对照；其余孔分别按预先设定加100 μ 1稀释的待测样本。加样过程时间跨 度应尽量短。
[0100] 6、温育：震荡混匀，置37°C温箱或水浴锅中，反应30min。
[0101] 7、洗板：弃去反应液，每孔加300 μ 1步骤2中得到的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃 洗液。连续洗板4次后拍干。
[0102] 8、加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100 μ 1辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG多 克隆抗体。
[0103] 9、温育：置37°C温箱或水浴锅中，反应30min。
[0104] 10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300 μ 1，浸泡15s，甩弃洗涤 液。连续洗板5次后拍干。
[0105] 11、显色：每孔分别加入100 μ 1的底物显色液（其中溶液A和溶液B以体积比为 I : 1的比例混合）。加盖，37°C恒温箱里反应15min;
[0106] 12、每孔分别加入50 μ 1终止液终止反应，混匀；
[0107] 13、测定每孔的0045。值（加终止液的反应板应在15min内读取OD 45。值）。
[0108] 检测结果的判定：
[0109] 1、阴性对照OD45tl平均值应该< 0. 15,否则无效。
[0110] 2、阳性对照每个检测值应该在0. 9-1. 9之间，否则无效。
[0111] 3、临界值的计算：临界值=0. 17X阳性对照OD45tl值平均值。
[0112] 待检血清测定OD45tl值多临界值者判为阳性；待检血清测定OD 45(|值< 临值者判为 阴性。
[0113] 二、乳鼠血清中和试验（MSN)方法
[0114] 目前国内常用的口蹄疫血清学检测方法之一是乳鼠中和试验（MSN)，因此用本试 剂盒同乳鼠中和试验进行符合率试验。
[0115] 材料
[0116] 1.免疫血清50份抗体阳性血清（牛口蹄灭活疫苗免疫后的阳性血清），由中牧实 业股份有限公司兰州生物药厂提供。
[0117] 2.健康牛血清50份由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。
[0118] 3.试验用病毒为口蹄疫OM II病毒（0型鼠化弱毒OMII毒株，购自兰州兽医研宄 所，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂保存和使用）将病毒经6~8日龄乳鼠 balb/c 传2代后，收集病毒。用3~4日龄乳鼠测定并调整其毒价至1000LD5(i/0. 2ml，置于-20°C 保存待用。
[0119] 乳鼠血清中和试验方法如下：将血清用PBS作2倍稀释，取Iml与等量IOOLD5cZml 的OM II系病毒液混合，于37°C孵育1小时，然后接种3日龄乳鼠（颈部皮下注射0. 2ml)， 每组（亦即每个待检血清）4只，同时设立病毒对照、健康对照及标准阳性血清对照组，每组 3只，观察7d，记录乳鼠死亡比率并判定结果，若乳鼠4/4或3/4健活，则待检血清为阳性 (R)，若乳鼠4/4或3/4死亡，则待检血清为阴性（-);若乳鼠2/4健活或2/4死亡，则判定 结果可疑（±)，需加倍重复测定，重复试验中，有1组呈阳性，则判定为阳性。
[0120] 敏感性=判定阳性血清样本数/待测血清样本数
[0121] 三、符合率试验结果：
[0122] 利用实施例2制备的牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠 中和试验（MSN)分别检测100份牛血清，其中阳性血清（上述免疫血清）50份，阴性血清 (上述健康牛血清）50份，结果显示如表3,牛口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测 试剂盒的敏感性为98%，而乳鼠血清中和试验的敏感性只有90%，在50份阳性血清中，两 种方法检测结果一致的为46份，因此，本试剂盒和乳鼠血清中和试验的符合率为92%，因 此本试剂盒具有较高的敏感性。对阴性血清的测试两者的符合率为100 %，检测结果均为阴 性（见表3)。
[0123] 牛口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验一共检测 100份牛血清，其中96份牛血清两种方法检测结果一致，4份牛血清检测结果有差异，符合 率为96%。
[0124] 表3.牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒（ELISA)及乳鼠血清 中和试验法（MSN)对阳性血清和阴性血清的检测结果
[0125]
[0126]
[0128] 实施例4、牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验
[0129] 敏感性试验是使用实施例2中制备的牛口蹄疫0型结构蛋白VPl抗体酶联免疫检 测试