一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，属于生物技术和 特异性抗体检测领域。
【背景技术】
[0002] 特异性抗体的检测在医学、生物学等领域的研宄中，甚至临床应用中均占有重要 地位。其目的主要是协助临床诊断，在某些疾病中及预后的一个指标，在传染病流行病学调 查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。
[0003] 针对特异性抗体检测方法的研宄已相对成熟。传统方法有沉淀反应、凝集试验、补 体结合试验等，而现在医学、生物学研宄中更为常见的有酶联免疫吸附法（ELISA)、放射免 疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等标记免疫测定方法。各类特异性抗体的检测方法拥 有一个通用原理，即抗原与抗体的特异性结合。
[0004] 然而病毒、细菌等常见抗原的基因相当复杂多变。遗传多样性，即生物的遗传基因 多样性，是生命进化和物种分化的基础，主要是指生物种内基因的变化，包括同一种群内或 不同的种群之间的遗传变异。自然界中，种群内的个体之间往往没有完全一致的基因型。微 生物作为生物圈不可或缺的重要组成部分，拥有丰富的遗传多样性，尤其是野生型病毒、细 菌的基因型，更为复杂。近年来，随着药物的滥用、各类疫苗的普及、环境的污染、机体免疫 力普遍下降等诸多因素的共同影响，病毒和细菌变异株的出现频率逐渐升高。二者直接导 致病毒型抗原和细菌表面抗原的复杂多变，这种现状加大了使用抗原有效检测特异性抗体 的难度。
[0005] 目前医学、生物学研宄领域及临床应用中，通常采用单一抗原进行特异性抗体的 检测，由于突变株的增生，加上抗原本身就具有多种基因型，甚至基因亚型（尤其某些突变 频繁的流行性病毒），特异性抗体的检测时常会出现检测信号波动的情况。
[0006] 比如使用商业诊断试剂盒检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg)时，个别基因型的样本 或变异株可能由于结合的特异性不足，首次检测信号与再次检测信号出现很大差异。为满 足各基因型样本的检测需求，有学者提出，可在抗体检测前，先将样本进行分类，再有针对 性的选择对应抗原进行检测，但此举将大大增加样本检测的金钱成本和时间成本，临床应 用可行性不足。又如检测梅毒抗体时，ELISA检测试剂盒采用单一梅毒螺旋体（TP)外膜脂 蛋白作为抗原进行检测，但基因重组的TP抗原仅具有一级结构，与天然抗原存在差异，有 文献报道，阴性样本的复检与初检结果只有19. 3%的符合率。种种迹象表明，使用单一抗原 检测特异性抗体已经无法满足临床需求。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是面对某些抗原复杂多变的情况，或者抗原突变株增生的现状，在 传统单一抗原无法有效检测出特异性抗体的前提下，提供一种检测特异性抗体的新方法。 传统观念里，当抗原种类较复杂时，在使用单一抗原检测特异性抗体前，为了提高检测特异 性，需针对待测样品所感染的抗原进行分类，再选择适合的抗原进行特异性抗体的检测，本 发明可节省这一复杂的步骤，并提高检测结果的稳定性。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法。
[0009] 所述方法包括以下步骤：
[0010] (1)确定用于检测的抗原具有相对保守的氨基酸序列（序列间差异以不超过20% 为佳）；
[0011] (2)在相对保守的氨基酸序列中筛选出2-5条可覆盖90%以上目标检测人群的肽 段；
[0012] (3)当筛选的肽段长度小于50个氨基酸或由于其他原因造成肽段的免疫原性过 低时，采用偶联大蛋白的方式提高其免疫原性；将筛选的肽段组合起来，作为检测使用的抗 原；
[0013] (4)用上一步得到的抗原检测样本中的特异性抗体。
[0014] 所述肽段组合是指将筛选的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合， 作为检测抗原。
[0015] 所述步骤（4)中的检测，可以是任一常规抗体检测手段，比如ELISA。
[0016] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是用来检测抗乙型肝炎病毒前SI抗体。
[0017] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：
[0018] (1)确定抗乙型肝炎病毒前Sl抗体的P94序列相对保守；
[0019] (2)获取乙肝患者血样，扩增其血清中病毒DNA的前Sl区域并进行测序，将各样本 的测序结果翻译为氨基酸序列后，分别与已报道的乙肝病毒P94肽段序列进行比对分析， 确定患者感染的P94基因型，从而筛选获得2条以上可覆盖90%以上目标检测人群的肽段 (即90%的目标检测人群，含有筛选得到的肽段的任意一条）；
[0020] (3)将上一步筛选得到的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为 抗原；
[0021] (4)用上一步得到的抗原检测血清中的P94抗体。
[0022] 所述步骤（2)筛选得到的肽段，在本发明的一种实施方式中，必须包括序列为SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 的肽段。
[0023] 所述步骤（2)筛选得到的肽段，在本发明的一种实施方式中，还可以包括表1中除 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2序列以外的其他任意1-3种肽段。
[0024] 所述步骤（3)中的大蛋白，在本发明的一种实施方式中，可以是KLH、0VA、BSA。
[0025] 所述步骤（4)中的检测，在本发明的一种实施方式中，是将混合后的偶联的复合 物作为ELISA包被抗原，采用ELISA法检测抗体。
[0026] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测抗乙型肝炎病毒抗体的组合抗原，该组 合抗原包含序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的肽段。
[0027] 所述组合抗原，在本发明的一种实施方式中，还包括表1中除SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2序列以外的其他任意1-3种肽段。
[0028] 所述组合抗原，在本发明的一种实施方式中，是将序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的肽段分别偶联大蛋白后，将偶联后的复合物混合得到的。
[0029] 本发明还要求保护所述组合抗原在检测抗乙型肝炎病毒抗体方面的应用，以及含 有所述组合抗原的试剂盒。
[0030] 本发明的有益效果：（1)本发明是从单一表位，根据基因型的不同，从保守区肽段 筛选获得能够覆盖大部分目标的肽段，通过保守区肽段组合来检测特异性抗体；本发明的 保守区肽段组合的方法不仅可代替单一抗原检测特异性抗体，而且具有可重复性高、数据 稳定性高等优点，可以克服目前单一抗原检测所存在的准确性低、稳定性低的缺陷；（2)本 发明创造性地采用保守区肽段，保守区肽段
[0031] 的突变相对较少，序列简单，临床应用的可行性较高；而且保守区肽段通常较短，
[0032] 便于人工合成，同时易于组合检测；（3)保守区肽段组合，相对单一抗原检测而
[0033] 言，可扩大检测群体的适用范围；(4)保守区肽段与所属物种（如病毒）的发展
[0034] 进化、生命周期、感染途径等有关，对应的特异性抗体检测意义显著。
【附图说明】
[0035] 图I :202例测序成功样本提供者感染的P94基因型分布图；
[0036] 图2 :批间变异系数对比图；其中a为变异系数柱状图；b为单一包被B基因型
[0037] P94肽段检测P94抗体时的变异系数散点图；c为单一包被C基因型P94肽
[0038] 段检测P94抗体时的变异系数散点图；d为组合包被B+C基因型P94肽段
[0039] 检测P94抗体时的变异系数散点图。
【具体实施方式】
[0040] 通过多基因型肽段组合的方式检测抗乙型肝炎病毒前Sl (94-117)抗体（简
[0041] 称P94抗体）来具体说明本发明方法。
[0042] 实施例1 :相对保守氨基酸序列的确定和分析
[0043] 乙肝病毒基因型分为A-H，共8种，其前Sl (94-117)氨基酸序列相对保
[0044] 守，但有所不同。通过分析从NIH的基因银行（GenBank)获取的39个已报道
[0045] 的乙肝病毒基因亚型序列，发现乙肝病毒基因亚型的P94肽段平均有5-10%的
[0046] 差异，极端情况20% (表1)，如Cl和Hl之间（5/24)。而使用单一前Sl (94-117)
[0047] 多肽（简称P94肽段）作为包被抗原来检测非相应抗体时，由于存在较多非特异
[0048] 性识别，信号必将出现波动。现有检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg)的商业诊断
[0049] 试剂盒也说明了类似问题：在检测变异株的HBsAg时，可能由于结合的特异性
[0050] 不足，而导致信号波动（如首次检测信号较低不能确定，而再次检测时出现高水
[0051] 平信号）。
[0052] 表1不同乙肝病毒基因型的P94肽段序列
[0053]
[0055] 注：表中加粗斜体，为同种基因型内细分基因型比较后的差别。
[0056] 结合实际情况（已验证P94序列相对保守），本发明的检测P94抗体的方法
[0057] 为：①确定2个可覆盖大部分患者群（90%以上）的相对保守的P94肽段；②将
[0058] 筛选出的P94肽段组进行优化（通过偶联KLH大蛋白提高P94肽段的免疫原性）；
[0059] ③将优化后的P94肽段组合起来作为ELISA包被抗原；④检测患者血清中的P94
[0060] 抗体。
[0061] 实施例2 :可覆盖大部分患者群的相对保守的肽段的筛选
[0062] 具体实施步骤如下：
[0063] 步骤一：提取慢性乙肝患者血清中的病毒DNA
[0064] 获取慢性乙肝患者血样213例，血样提供者年龄跨度较大（7岁-73岁），男性占 61% (130/213) 〇
[0065] 使用 TAKARA 公司的 DNA 提取试剂盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5. 0, Catalog No. 9766)，对213例样本进行病毒基因提取，将提取的乙肝病毒DNA作为 模板链进行PCR扩增。
[0066] 步骤二：PCR扩增病毒前Sl区域并进行测序
[0067] 通过PCR分别对213例DNA样本进行DNA模板链的扩增，同时设置进行对照品（未 添加 DNA模板的空白组），反应体系均为50 μ L，各试剂加入量详见表2。
[0068] 为提高产物纯度，采用巢式PCR进行扩增，使用的引物序列见表3。
[0069] 第一轮PCR反应程序设置为95°C预变性3min，95°C变性40sec，55°C退火30sec， 72°C链延长40sec，72°C稳定3min，共进行36个循环。第二轮PCR反应程序设置为95°C预 变性 3min，95°C变性 40sec，50°C 退火 30sec，72°C 链延长 40sec，72°C稳定 3min，共进行 36 个循环。扩增产物使用I. 2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0070] 213例DNA提取样品中，一次扩增不成功的样品将进行第二次扩增，以排除PCR实 验误差。若两次扩增均未成功（相应位置没有呈现条带），则认为该样品的DNA提取步骤未 成功。
[0071] PCR扩增结果为：202例DNA提取样品扩增成功；11例样品扩增失败。
[0072] 表