2PCR反应体系试剂加入量
[0073]
[0074]
[0075] 表3PCR扩增使用的引物
[0076]
[0077] 步骤三：比对前Sl区域中P94肽段序列，确定患者感染的P94基因型
[0078] 委托生工生物工程（上海）股份有限公司，对202例PCR扩增产物进行DNA测序， 测序引物序列为GGTTGGTCTTCCAAACCTCG(序列如SEQ ID NO. 21所示），单向测通，测序片段 长度约600bp。
[0079] 将各样本的测序结果翻译为氨基酸序列后，分别与39个已报道的乙肝病毒P94肽 段序列进行比对分析，确定患者感染的P94基因型。202例样本中发现A基因型1例、B基 因型29例、C基因型166例、G基因型1例，不确定基因型5例（不确定样本与主要的A-H 基因型的P94肽段不一致，可能属于一些次要亚型，或是突变株），其中检测到的B基因型肽 段序列均为PASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHP(序列如SEQ ID NO. 1所示）、检测到的C基因型肽 段序列均为 PASSNRQSGKQPTPISPPLRDSHP(序列如 SEQ ID NO. 2 所示）。
[0080] 各基因型分布见图1，可见，B基因型和C基因型可以覆盖绝大部分患者（96%)感 染的P94基因型。
[0081] 实施例3 :相对保守的肽段偶联大蛋白
[0082] 将B基因型和C基因型P94肽段偶联KLH大蛋白，以提高其免疫原性
[0083] 分别订购B基因型肽段（序列如SEQ ID NO. 1所示）和C基因型P94肽段（序列 如SEQ ID NO. 2所示），并将其偶联KLH大蛋白（由安比奇生物科技有限公司完成）。
[0084] 实施例4 :肽段组合抗原检测特异性抗体
[0085] 分别采用单一 B基因型P94肽段、单一 C基因型P94肽段、组合B基因型和C基因 型P94肽段，作为抗原，检测患者血样。
[0086] (1)包被B基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7个、感染B基因型 的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个：
[0087] 将实施例3得到的偶联有B基因型P94肽段的KLH大蛋白在0. 05mol/L，PH9. 6的 碳酸盐缓冲液中以浓度100 μ g/ml稀释后，在96孔板（Fisher)上包被过夜。用含1% BSA 的PBS溶液将待测血清样本稀释125倍，37度孵育lh。酶标二抗（从山羊体内分离出的人 IGg抗体，目录号A-3187, SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育lh。使用碱性磷酸酶 (PNPP)作为显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内在酶 标仪上测定OD4tl5的值。
[0088] 每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-1所示。
[0089] (2)包被C基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7个、感染B基因型 的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个：
[0090] 将偶联有C基因型P94肽段的KLH大蛋白，在0. 05mol/L，PH9. 6的碳酸盐缓冲液 中以浓度100 μ g/ml稀释后，在96孔板（Fisher)上包被过夜。用含1 % BSA的PBS溶液将 待测血清样本稀释125倍，37度孵育lh。酶标二抗（从山羊体内分离出的人IGg抗体，目 录号A-3187, SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育lh。使用碱性磷酸酶（PNPP)作为 显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内在酶标仪上测定 OD4tl5 的值。
[0091] 每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-2所示。
[0092] (3)组合包被B基因型和C基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7 个、感染B基因型的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个，进行3次重复性实验
[0093] 分别将偶联有B基因型和C基因型P94肽段的KLH蛋白在0. 05mol/L，PH9. 6的碳 酸盐缓冲液中混合，以浓度50 μ g/ml稀释后，在96孔板（Fisher)上包被过夜。用含1 % BSA的PBS溶液将待测血清样本稀释125倍，37度孵育lh。酶标二抗（从山羊体内分离出 的人IGg抗体，目录号A-3187, SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育lh。使用碱性磷 酸酶（PNPP)作为显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内 在酶标仪上测定OD4tl5的值。
[0094] 每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-3所示。
[0095] (4)运用统计学方法分析保守区肽段组合检测法能否代替单一肽段检测特
[0096] 异性抗体。
[0097] 为验证包被组合肽段检测P94抗体与包被单一肽段检测P94抗体的结果是
[0098] 否一致，本专利人为将P94抗体检测结果分为5个等级，分别用符号
[0099] " + "、"++"、"+++"表示。假设各批次实验中的阴性对照组均值为1认为等级"_"
[0100] 代表检测结果〈2N的样品；等级代表检测结果在2N-3N的样品；等级" + "代
[0101] 表检测结果在3N-4N的样品；等级"++"代表检测结果在4N-5N的样品；等级
[0102] "+++"代表检测结果>5N的样品。代表阴性，没有抗体；代表可能是阴
[0103] 性、也可能是阳性；" + "、"++"、"+++"代表阳性，含有抗体。
[0104] 不同包被方式检测P94抗体数据分级结果如表4-1至表4-3所示，PXX代表
[0105] 患者样本序号。
[0106] 表4-1包被B基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
[0107]
[0108] 表4-2包被C基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
[0109]
[0111] 表4-3组合包被B基因型和C基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
[0112]
[0113] 显而易见，检测B基因型样本时，包被组合肽段的检测结果与包被单一 B
[0114] 基因型肽段的检测结果基本一致；检测C基因型样本时，包被组合肽段的检测
[0115] 结果与包被单一 C基因型肽段的检测结果基本一致；当检测样本基因型与包被
[0116] 肽段基因型不匹配时（包B-血清C ;包C-血清B)，检测结果不一致，证明通过
[0117] 保守区肽段组合的方式检测特异性抗体，可以代替任一单一包被肽段检测特异性
[0118] 抗体的方法。
[0119] 分析三组重复性实验的数据时，发现包被B基因型P94肽段检测C基因型
[0120] 样本时、或包被C基因型P94肽段检测B基因型样本（即基因型不匹配）时，
[0121] 批间变异系数较大（见表5、表6,图2b、2c)，检测信号波动较大。而组合包
[0122] 被两种基因型的P94肽段时，变异系数小于单一包被P94肽段时的变异系数（图
[0123] 2a)，且均小于15% (表7,图2d)，证明通过保守区肽段组合的方式检测特异性
[0124] 抗体，具有更高的可重复性和数据稳定性。
[0125] 表5单一包被B基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
[0126]
[0127] 表6单一包被C基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
[0128]
[0129] 表7组合包被B+C基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
[0130]
[0131] 综上所述，通过保守区肽段组合的方式检测特异性抗体，不仅具可以代替单一肽 段检测特异性抗体，还有更高的可重复性和数据稳定性。
[0132] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤：（1)确定用于检测的抗原具有相对保守的氨基酸序列；（2)在相对保守的氨基酸序 列中筛选出2-5条肽段，其中90%以上目标检测人群的抗原中含有这2-5条肽段中的任意 一条；（3)当筛选的肽段长度小于50个氨基酸或免疫原性过低时，偶联大蛋白以提高其免 疫原性；将筛选的肽段组合起来，作为检测使用的抗原；(4)用上一步得到的抗原检测样本 中的特异性抗体。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽段组合是指将筛选的肽段分别偶 联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为抗原。3. -种利用保守区肽段组合来检测抗乙型肝炎病毒前Sl抗体的方法，其特征在于，所 述方法包括：（1)确定抗乙型肝炎病毒前Sl抗体的P94序列相对保守；（2)获取乙肝患者血 样，扩增其血清中病毒DNA的前Sl区域并进行测序，将各样本的测序结果翻译为氨基酸序 列后，分别与已报道的乙肝病毒P94肽段序列进行比对分析，确定患者感染的P94基因型， 从而筛选获得2条以上可覆盖90%以上目标检测人群的肽段；（3)将上一步筛选得到的肽 段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为抗原；(4)用上一步得到的抗原检测 血清中的P94抗体。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大蛋白是KLH、OVA或BSA。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中的检测是将混合后的偶联 的复合物作为ELISA包被抗原，采用ELISA法检测抗体。6. -种用于检测抗乙型肝炎病毒抗体的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原包含序 列为 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 的肽段。7. 根据权利要求6所述的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原还包括SEQ ID NO. 3至 SEQ ID NO. 16中的任意1-3条肽段。8. 根据权利要求6所述的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原是将序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的肽段分别偶联大蛋白后，将偶联后的复合物混合得到的。9. 权利要求6-8任一所述组合抗原在检测抗乙型肝炎病毒抗体方面的应用。10. 含有权利要求6-8任一所述组合抗原的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，属于生物技术和特异性抗体检测领域。本发明方法从具有相对保守氨基酸序列的抗原中筛选出2-5条可覆盖90％以上目标检测人群的肽段，然后将肽段偶联大蛋白以提高其免疫原性，将筛选的肽段组合起来作为检测使用的抗原，用于检测样本中的特异性抗体。本发明的方法不仅可代替单一抗原检测特异性抗体，而且具有可重复性高、数据稳定性高等优点。此外采用保守区肽段，由于突变相对较少，序列简单，临床应用的可行性较高，便于人工合成，易于组合检测；相对单一抗原检测而言，可扩大检测群体的适用范围。
【IPC分类】G01N33/576, G01N33/68, C07K14/02
【公开号】CN104961806
【申请号】CN201510309800
【发明人】刘镇宁, 何欣悦, 李家亿, 张晓晨, 温晓玉, 牛俊奇, 康新迪, 蔡林君, 王放
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月8日