一组结节病血清特异性标志蛋白及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术和医学检验领域，涉及用于识别结节病的检测标志物及其检测 试剂盒。尤其涉及一组结节病血清特异性标志蛋白及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 临床研究显示，结节病病因不明，以非干酪性上皮样肉芽肿为病理特征，全身各个 器官几乎均可受累，其中最为常见的受累器官是肺脏和胸内淋巴结。由于结节病临床表现 多样且缺乏特异性，其确诊主要依靠排他性诊断，需要除外许多其他肉芽肿性疾病，其中 最为困难的是结节病与菌阴结核病的鉴别诊断，尤其在中国这样的结核病高发国家显得 更为突出。目前对于两者的鉴别诊断多集中在寻找结核杆菌的证据方面，而且多侧重于 结核病的标志物的研究。有研究报道，结节病血清标志物有血清可溶性白细胞介素受体 2(sIL-2R)，血清血管紧张素转化酶（SACE)和II型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)等，但实践 证实，这些标志物的敏感性和特异性并不理想，并且对于结节病和结核病的鉴别诊断方面 未见后续报道。还有研究通过实时定量PCR方法检测结节病和结核病病理组织中结核分 枝杆菌DNA，从病理组织角度建立结节病和菌阴结核病的鉴别诊断方法；以及通过建立临 床-影像-病理综合评分系统用于二者的鉴别诊断，所述方法可以用于解决部分结节病与 菌阴结核病的鉴别难题，但仍然存在假阳性和假阴性的问题，并且所述方法必须以取得病 理活检为应用前提，而病理活检的方式及病理医师诊断经验常会对诊断的正确率产生很大 的影响；
[0003] 本申请的的发明人之前的研究中用结节病患者血清标本筛选出血清淀粉样物质 A(SAA)作为诊断标志物，其诊断结节病特异度仅为52. 5%，作为单一的指标用于结节病的 诊断明显不足。
[0004] 因此，寻找一种更为特异、敏感、简便、可靠的用于上述两种疾病的鉴别诊断的检 测试剂及其检测试剂盒已成为本领域研究人员较为关注的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于识别结节病的检测标志物及 其检测试剂盒。
[0006] 本发明中，所述的检测试剂含有一组或一组以上的相关结节病与结核病的血清学 差异蛋白，本发明的实施例中筛选相关结节病与结核病的血清学差异蛋白瘦素（leptin) 及细胞间粘附分子1 (ICAM-1)。
[0007] 本发明的另一目的是提供含有上述检测试剂的检测试剂盒。
[0008] 所述的检测试剂盒包含固相和上述相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，本发 明的实施例中优选血清学差异蛋白1印tin及ICAM-1。
[0009] 本发明的另一目的是提供上述相关结节病与结核病的血清学差异蛋白1印tin及 ICAM-1在制备用于鉴别诊断结节病的检测试剂中的用途。
[0010] 本发明通过下述技术方案实现：
[0011] 利用蛋白芯片技术，将筛选出的差异蛋白用酶联免疫吸附试验（ELISA)以及免疫 组化（IHC)的方法验证后，筛选其中的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，本发明的 实施例中优选血清学差异蛋白1印tin及ICAM-1 ;进一步的进行所述的差异蛋白的血清浓 度数据的统计学分析处理以及平行试验与序列实验的灵敏度及特异度分析处理，确定相关 结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差异蛋白1印tin及ICAM-1联合用于检测结节 病与结核病的血清浓度，为鉴别结节病和菌阴结核病提供便捷的特异度及灵敏度高的检测 试剂以及检测试剂盒。
[0012] 本发明中，还提供了采用所述的检测试剂以及检测试剂盒对于结节病以及菌阴结 核病进行检测的方法及其模型。
[0013] 本发明通过检测血清中差异表达的蛋白，联合采用统计学的方法分析处理，在不 需取得活检组织的情况下，仅仅通过检测患者的血清蛋白，既能在一定程度上获得两种疾 病的血清蛋白之间的差别后，基于受试者工作特征曲线（ROCcurve)对制备的诊断试剂及 其试剂盒的检测效力进行评价。
[0014] 本发明中将上述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差异蛋白 leptin及ICAM-1运用R0C曲线、逻辑回归（logisticregression)及平行序列实验分析等 统计学方法建立一组鉴别模型，对所述的差异蛋白的血清浓度数据以及平行试验与序列实 验的灵敏度及特异度分析处理，确定相关结节病与结核病的血清学差异蛋白表达的差异， 尤其是差异蛋白leptin及ICAM-1联合或单独使用的差异，分析结果有利于鉴别诊断参考。
[0015] 本发明中，采用所述的检测试剂盒通过下述步骤对结节病以及菌阴结核病进行检 测：
[0016] 1)包被
[0017] 取所要包被的商品化leptin和ICAM-1抗体，设计所需浓度，根据各包被孔数计算 所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中：
[0018] 包被条件：ELISA板直接置4°C过夜；或先置37°C孵育2小时再转入4°C过夜；
[0019] 2 洗涤
[0020] 包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min， 弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭；
[0021] 3 封闭
[0022] 常用10%小牛血清，取步骤2的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液 的两倍；封闭条件：置于4°C过夜，或置于37°C温育2-4h;
[0023] 4 洗涤
[0024] 封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2,排干ELISA板；
[0025] 5加入待检样品（血清）
[0026] 按实验所需稀释倍数用包被液稀释进行稀释，至所需浓度后加入相应孔中，反应 条件为37°C孵育2h;
[0027] 6 洗涤
[0028] 具体同步骤4;
[0029] 7加相应HRP-标记的商品化二抗
[0030]加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般 也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书；将稀释好的二抗加入各孔，37°C反应1-1. 5h;
[0031] 8再洗涤
[0032] 具体同步骤4;
[0033] 9 显色
[0034] 用商品化TMB显色液作为底物，显色液分加至ELISA各孔中；然后将ELISA板置于 37°C反应约lOmin;
[0035] 10 终止：
[0036] 取出ELISA板，每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读数 (波长为450nm)，根据cutoff值判断对结节病鉴别效力程度。
[0037] 本发明的一个实施例中，ICAM-1 的cutoff值为 57740pg/ml，Leptin的cutoff值 为 1193. 186pg/ml。
[0038] 本发明实验研究结果表明，通过蛋白芯片技术发现差异表达蛋白，经ELISA及免 疫组化鉴定的1印tin及ICAM-1两种因子经过统计学模型的建立，为两者的鉴别诊断提供 有意义的辅助。该模型并不仅限于所述的差异蛋白1印tin及ICAM-1，还可以用于验证存在 差异表达的所有可能的差异蛋白，分别分析不同联合组合的鉴别效力。
[0039] 本发明的优点在于：
[0040] 本发明进行了免疫组化实验，验证了所述的差异蛋白Leptin、ICAM-1在结节病肺 组织及纵膈淋巴结中表达阳性率明显高于结核病组，两者表达有明显差异；并进行了两种 差异蛋白-细胞因子的血清浓度数据的统计学分析处理以及平行试验与序列实验的灵敏 度及特异度分析处理，结果显示，所述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差 异蛋白1印tin及ICAM-1联合用于检测结节病与结核病的血清后，特异度为73. 1%，敏感度 为 86. 5%。
【附图说明】
[0041] 图1为单因素方差分析及事后比较检验（PostHocTests)分析组间差异因子，
[0042] 其中显示，结节病分别与结核病和健康对照组间Leptin、ICAM-1差异均有显 著意义；结核病与健康组间两种因子均无统计学差异（P> 〇. 05);血小板衍生生长因子 BB(H)GF-BB)在三组间均无差异。
[0043] 图2为免疫组化验证活检组织中差异蛋白的表达，
[0044] 其中显示，Leptin在结节病肺组织中呈强阳性表达，弥漫性分布在肉芽肿及周围， 而结核病肺组织中肉芽肿为非特异性染色；Leptin在结节病淋巴结肉芽肿中央较浓聚，表 达呈强阳性，而其在结核病淋巴结肉芽肿中央有弱阳性表达，两者表达有明显差异。
[0045] 图3为免疫组化验证活检组织中差异蛋白的表达，
[0046] 其中显示，ICAM-1在结节病肺组织及淋巴结中强阳性表达，呈弥漫性和簇状分布， 结核病肺组织中肉芽肿周围为非特异性染色或者弱阳性表达。
[0047] 图4为R0C曲线模型，
[0048]其中分别显示了BMI、1印tin、ICAM-l三者单独检测结节病和结核的R0C曲线与运 用logstic回归联合形成联合因子检测结节病和结核病的R0C曲线。
【具体实施方式】
[0049] 实施例1
[0050] 1)蛋白芯片血清差异蛋白分析
[0051] 收集结节病以及健康献血者的外周血血清各3例，首先用蛋白芯片技术 (RayBiotechHumanCytokineAntibodyArrayGSeries1000)初筛比较 3 例结节病患 者及3例健康人血清中120种重要的炎症细胞因子水平，根据结果及文献报道定制了包括 30种重要分子的蛋白芯片（RayBiotechQAH-⑶ST);运用生物芯片系统分析所述细胞因子 在结节病（20例）及对照组（结核病组20例、正常对照组20例）外周血血清中的含量；
[0052] 所用试剂盒为广州RayBiotech公司定制的抗体芯片，扫描仪为美国Axon公司 Genepix荧光扫描仪；实验步骤按其说明书进行，采用Genepix荧光扫描仪Cy3通道扫描信 号，QAH-CUST-G数据分析软件进行数据分析；
[0053] 蛋白芯片血清差异蛋白分析结果如表1所示，筛选出结节病与结核病组之间3个 差异蛋白分别为 ICAM-1，L印tin，PDGF-BB，P < 0· 05。
[0054] 表1蛋白芯片筛选结果
[0055]
[005υ」
[0057] *a、SA结节病，TB结核病，HC健康对照
[0058] *b、p < 0· 05, /表示未检测到浓度。
[0059] 2)用ELISA验证蛋白芯片初筛出血清中的差异蛋白
[0060] 将蛋白芯片的初筛结果扩大样本量运用ELISA验证，ICAM-1、L印tin、TOGF-BB ELISA试剂盒购自上海欣奥盛公司（NeobioscienceTechnologyCompanyLimited),实验 所用酶标仪为BioTekInstruments公司ELX808,操作步骤按试剂盒说明书进行；在450nm 波长下测定吸光度值，计算各样品浓度；
[0061] 相关分析结果显示，leptin在血清中含量与BMI成正相关（p< 0· 0001)，r= 0.549 (Pearson相关系数），显示两者显著相关；回归分析显示BMI与1印tin含量存在直 线回归关系（P< 〇. 001)，即1印tin随着BMI的增加而升高；这与1印tin表达与体重有关 的报道一致，为了排除体重对1印tin的影响，以BMI为协变量，做结节病组与结核病组对 leptin血清浓度影响的协方差分析，经校正后的结节病和结核病组leptin血清浓度