基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的 试剂盒及方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界中广泛存在于空 气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。人和动物均有较高的带菌率，健康人的咽喉、鼻腔、皮 肤、头发等常带有产肠毒素（SE)的菌株，食品受其污染的机会很多。今年来，美国疾控控制 中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠 毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食品中毒，占整个细菌 性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。所 以，对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。
[0003] 传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验 结果大致需4~7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以建立快速而准确的检测方法一直病 原微生物检验研究的核心问题。免疫测定法，以其准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快 以及费用低等特点，成为检验中广泛应用的方法之一。
[0004] 免疫传感器开始应用于食源性致病菌的检测要追溯到上世纪70年代，是利用抗 原抗体特异免疫反应与高灵敏传感器件相结合构成的一种生物传感器件，它具有制备简 便、特异性好、操作快速、灵敏的特点，因此将免疫传感技术用于食品中金黄色葡萄球菌的 检测是当前一个新的发展方向。目前，国内外有食品中致病菌的免疫分析已有一些文献报 告，但大多采用酶联免疫分析（ELISA)法测定。有关免疫传感技术的研究也有一定报道，如 采用免疫磁珠捕获法结合经典PCR技术检测食品中的沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆 菌0157 :H7、志贺氏菌等致病菌；但这些工作离实际应用仍有相当距离，因此，用微间距叉 指阵列电极方法开展食品中金黄色葡萄球菌高通量的快速分析检测是一项非常有意义的 工作。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种基于微间距阵列电极的 免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] -种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包被 底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品 为金黄色葡萄球菌标准菌株。
[0008] 在上述方案中优选的是，阴性对照标准品为PBS缓冲液，封闭液为浓度为3%的 BSA溶液，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，底物溶解液为AAP浓度为lmmol/L 和AgN03浓度为5mmol/L的灭菌甘氨酸-NaOH溶液。
[0009] 在上述任一方案中优选的是，PBS缓冲溶液的制备方法：
[0010] Na2HP0442H20 3.62g： KH2P04 0.2 g； NaO 8.0 g: ΚΠ Q.2:f；
[0011] 加超纯水稀释至1000mL。
[0012] 在上述任一方案中优选的是，封闭液的制备方法：BSA 3g，加lOOmL灭菌的 0· 01mol/L PBS 配制。
[0013] 在上述任一方案中优选的是，还包括一抗的稀释液为含0. 1 % BSA的PBS溶液。
[0014] 在上述任一方案中优选的是，还包括二抗的稀释液，所述稀释液包括浓度如下的 各组分：10mmol/L HEPES，0. 15mol/L NaCl，0. 1% Tween 20,0· 1% BSA〇
[0015] 在上述任一方案中优选的是，所述底物溶解液的配制方法为：用灭菌的0. lmol/L 甘氨酸-NaOH溶液配制AAP浓度为lmmol/L和AgN(V^度为5mmol/L的溶液，4°C储存一周。
[0016] 在上述任一方案中优选的是，所述试剂盒包括包被微间隙生物芯片96T/盒，阳性 对照液4mLX 1瓶；阴性对照液4mLX 1瓶；一抗120 μ LX 1瓶；酶标二抗120 μ LX 1瓶；抗 体稀释液30mLX 1瓶；底物溶解液30mLX 1瓶；AAP lgX 1瓶，AgN03lgX 1瓶。
[0017] 所述免疫定量传感器包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵 列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指交叉排列形成叉指形状，所述 微间距阵列电极的正电极和负电极的梳形齿宽均为20-100 μm，电极间隙为20-100 μm，且 微间距阵列电极的表面固定有100 μ L的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，该金黄色葡萄球菌 多克隆抗体浓度为8 μ g/mL。
[0018] 本发明还提供一种应用所述试剂盒的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检 测金黄色葡萄球菌的方法，包括方法以下各步骤：
[0019] (1)以PBS缓冲溶液稀释的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，然后包被在96孔微间距 阵列电极芯片孔中，每孔l〇〇yL，4°C孵育过夜；用超纯水清洗微间距叉指阵列电极三次， 将清洗后的电极的每孔加入200 μ L封闭液，在37°C恒温孵育1小时，弃去封闭液，超纯水洗 涤三次后，真空抽干过塑，4°C冷藏保存；
[0020] (2)将金黄色葡萄球菌标准菌株浓度为10sCFU/mL的菌液100°C水浴加热15分钟， 作为阳性对照标准品，
[0021] (3)分别取一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌样品溶液，将所述每一种浓度的金 黄色葡萄球菌菌悬液和阳性对照标准品、阴性对照标准品分别加入到包埋有金黄色葡萄球 菌多克隆抗体的所述免疫定量传感器上，并在37°C恒温反应30分钟；
[0022] (4)用超纯水洗涤三次后加入金黄色葡萄球菌单克隆抗体作为一抗，并在37°C恒 温反应30分钟后再用超纯水洗涤三次，加入AP标记山羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，并在 37°C恒温反应30分钟后再用超纯水缓冲液洗涤三次；
[0023] (5)在所述免疫定量传感器的每孔中加入100 μ L含AgN(V^物溶液，并在37°C恒 温避光反应15分钟后再用超纯水洗涤三次，电极晾干；
[0024] (6)将步骤（5)的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站的工作电 极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与所述免疫定量传感器工作电极的负电 极连接，并采用线性扫描伏安法在0_50mV点位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位 变化的响应曲线，并计算其电导值。
[0025] 在上述任一方案中优选的是，在所述步骤（3)中，加入浓度分别为10sCFU/mL、 10 7CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的金黄色葡萄球菌样品溶液，和阴性对照。
[0026] 试验结果显示，金黄色葡萄球菌的电导率强，且浓度越高，其电导值越大，其他对 照菌则是很低的电导率，因此，利用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡 萄球菌具有非常好的检测效果。
[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0028] 1、本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器试剂盒在3小时内可完成检测， 操作步骤简单，可以快速准确完成检测，适合样品的大批量检测；
[0029] 2、本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器特异性强、灵敏度高，可实现 浓度为10 4CFU/mL的食品中金黄色葡萄球菌的检测，达到我国食品中金黄色葡萄球菌的限 量标准，且背景干扰小，可以对食品中金黄色葡萄球菌进行快速筛查和检测；
[0030] 3、检测温度适宜范围宽，在4°C -40°C都可使用，结果正常。
[0031] 4、本发明可以方便的对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行检测，适合于卫生、质 监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的金黄色葡萄球菌进 行快速检测。
【附图说明】
[0032] 图1 :本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒 灵敏度实验结果图。
[0033] 图2 :本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒 特异性实验结果图。
[0034] 图3 :本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒 实际检测时验结果图。
【具体实施方式】
[0035] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036] 金黄色葡萄球菌多克隆抗体购自江苏千人生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌单 克隆抗体购自江苏千人生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌菌株购自美国典型菌种保藏中 心。
[0037] 实施例1 :
[0038] -种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包被 底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品 为金黄色葡萄球菌标准菌株。
[0039] 实施例2 :
[0040] 本实施例在实施例1的基础上：还包括阴性对照标准品、封闭液、二抗和底物溶 液，阴性对照标准品为PBS缓冲液，封闭液为浓度为3 %的BSA溶液，二抗为碱性磷酸酶标记 的山羊抗鼠IgG(H+L)，底物溶解液为AAP浓度为lmmol/L和AgN03*度为5mmol/L的灭菌 甘氨酸-NaOH溶液。
[0041] 进一步地，PBS缓冲溶液的制备方法：
[0042] Na2HP04-12H20 3.62 g： KH2P04 0.2 g； NaCI 8:.,%;: KCl 0 2g：
[0043] 加超纯水稀释至1000mL。
[0044] 更进一步地，封闭液的制备方法：BSA 3g，加lOOmL灭菌的0.0 lmol/L PBS配制。
[0045] 更进一步地，还包括一抗的稀释液为含0. 1 % BSA的PBS溶液。
[0046] 更进一步地，还包括二抗的稀释液，所述稀释液包括浓度如下的各组分：10mmol/L HEPES，0. 15mol/L NaCl，0. 1% Tween 20,0· 1% BSA。
[0047] 更进一步地，所述底物溶解液的配制方法为：用灭菌的0. lmol/L甘氨酸-NaOH溶 液配制AAP浓度为lmmol/L和AgN03*度为5mmol/L的溶液，4°C储存一周。
[0048]