无乳链球菌的胶体金快速检测试纸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无乳链球菌的胶体金快速检测试纸。
【背景技术】
[0002] 罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，上世界七八十年代我国多次从国外引种，并选 育出长势快、产量高、抗病力强的品种，此后迅速成功推广养殖。目前，我国不仅是世界上最 大的罗非鱼养殖生产国，也是最大的罗非鱼出口国。国内罗非鱼养殖集中在广东、海南、广 西、福建等南方地区。2009年开始在罗非鱼养殖密集区先后暴发罗非鱼"突眼症"，该病来 势凶猛，发病率高达35%，发病鱼死亡率接近100%，且病害持续时间长，药物防治难以控 制病情，养殖户损失惨痛。
[0003] 及时准确的发现和诊断病原，是成功预防和治疗罗非鱼链球菌病的前提。目前，对 于无乳链球菌的诊断，主要采用（1)分子生物学的方法，如PCR法进行诊断，该类方法依赖 于贵重的仪器设备和专业的技术人员，检测时间长达4-6个小时，非常不利于在基层推广 运用。（2)常规的分离培养法，依赖于专业操作人员的显微镜形态判断，容易造成误判，此类 方法的培养时间长达18-24个小时，也不适用于无乳链球菌的快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了 一种无乳链球菌的胶体金快速检测试纸。
[0005] 胶体金免疫层析检测试纸：是以硝酸纤维素膜为固相载体，以胶体金作为示踪标 记物，与抗体结合，在微孔膜的渗滤作用或毛细管作用下，利用抗原抗体的反应的高度特异 性和胶体金特有的颜色对金标抗体与抗原或二抗的结合进行示踪，显示肉眼可见的红色条 带或斑点，从而实现对待测物的定性或定量分析。
[0006] 本发明双抗体胶体金免疫层析试纸：即是以硝酸纤维素膜为固相载体，以胶体金 作为示踪标记物，特异性的抗体1以条带状固定在硝酸纤维素膜上，另一特异性的抗体2与 胶体金溶液结合形成的金标抗体。当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作 用向前移动，溶解结合垫上的金标抗体，相互反应后再移动至固定有抗体1的检测区时，待 测物和金标抗体形成的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可 目测的胶体金标记物得到肉眼可见的红色条带，从而实现对待测物的定性或定量分析。
[0007] 本发明无乳链球菌的胶体金免疫层析检测试纸，它是基于双抗体夹心检测原理 研制的胶体金免疫层析试纸，其中，采用的两种抗体为中国典型培养物保藏中心保藏的保 藏号：CCTCC NO :C2015177的细胞株分泌的抗体以及中国典型培养物保藏中心保藏的保藏 号：CCTCC NO :C2015178的细胞株分泌的抗体。
[0008] 本发明保藏号为：CCTCC NO :C2015177的细胞株，于2015年10月21日保藏在中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0009] 本发明保藏号为：CCTCC NO :C2015178的细胞株，于2015年10月21日保藏在中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0010] 其中，所述中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO :C2015177的细 胞株分泌的抗体用于制备金标抗体；中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO : C2015178的细胞株分泌的抗体用于包被硝酸纤维素膜，形成检测区。
[0011] 优选地，所述抗体的制备方法如下：
[0012] (1)分别取保藏号：CCTCC NO :C2015177 的细胞株和保藏号：CCTCC NO :C2015178 的杂交瘤细胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0013] (2)收集腹水，纯化，即可。
[0014] 优选地，步骤（2)中，所述纯化是是采用Protein G Sepharose亲和层析柱纯化。
[0015] 优选地，所述试纸的结构如下：包括PVC底板和设于其上的硝酸纤维素膜，样品垫 通过胶体金垫与硝酸纤维素膜一端连接，硝酸纤维素膜另一端搭接有吸水垫，所述硝酸纤 维素膜上靠近胶体金垫的一侧设有检测区，靠近吸水垫的一侧设有质控区。
[0016] 优选地，所述样品垫搭接在胶体金垫一端上表面，胶体金垫另一端搭接在硝酸纤 维素膜上表面。
[0017] 进一步优选地，所述质控区上包被有一层羊抗鼠的多克隆抗体层。
[0018] 本发明还提供了制备前述检测试纸的方法，步骤如下：
[0019] a、取中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO :C2015177的细胞株分泌 的抗体，与胶体金混合，制备金标抗体，喷涂于玻璃纤维膜上，制得胶体金垫；
[0020] b、取硝酸纤维素膜，粘贴于PVC底板（1)上，将样品垫通过胶体金垫与硝酸纤维素 膜的一端连接，再在硝酸纤维素膜的另一端搭接吸水垫；
[0021] c、再在硝酸纤维素膜靠近胶体金垫的一侧喷涂取中国典型培养物保藏中心保藏 的保藏号：CCTCC NO :C2015178的细胞株包被的抗体作为检测区，在靠近吸水垫的一侧包 被羊抗鼠IgG作为质控区。
[0022] 本发明还提供了一种检测无乳链球菌的免疫检测试剂盒，它包括如下两种无乳链 球菌单克隆抗体：采用的两种无乳链球菌抗体为中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号： CCTCC NO :C2015177的细胞株分泌的抗体以及中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号： CCTCC NO :C2015178的细胞株分泌的抗体。
[0023] 所述抗体的制备方法如下：
[0024] (1)分别取保藏号：CCTCC NO :C2015177 的细胞株和保藏号：CCTCC NO :C2015178 的杂交瘤细胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0025] (2)收集腹水，纯化，即可。
[0026] 步骤（2)中，所述纯化是采用Protein G Sepharose亲和层析柱纯化。
[0027] 优选地，所述试剂盒还包括免疫荧光检测用试剂、放射免疫检测用试剂、酶联免疫 吸附检测用试剂或免疫金胶体检测用试剂。
[0028] 本发明两种单克隆抗体可以与无乳链球菌有效结合，带有的显色物质显色明显， 可以与现有任意的免疫检测技术常规用试剂联用，检测无乳链球菌。
[0029] 现有的免疫检测技术包括免疫荧光技术、放射免疫检测技术、酶联免疫吸附技术 和免疫金胶体技术，本发明两种单克隆抗体可以分别与常规的免疫荧光检测试剂、放射免 疫检测试剂、酶联免疫吸附检测试剂或免疫金胶体检测试剂联合使用，使用免疫荧光技术、 放射免疫检测技术、酶联免疫吸附技术或免疫金胶体技术，准确检测无乳链球菌。
[0030] 1.免疫荧光技术：免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、 细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。2.放射免疫检测技术：放射免疫检测技术是 目前灵敏度最高的检测技术，利用放射性同素标记抗原（或抗体），与相应抗体（或抗原） 结合后，通过测定抗原抗体结合物的放射检测结果。3.酶联免疫吸附检测技术（ELISA):酶 联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应 的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结 果，其敏感度可达ng水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP) 等。4.免疫金胶体技术：该方法是将二抗标记上胶体金颗粒，利用抗原抗体间的特异性反 应，最终将胶体金标记的二抗吸附于渗滤膜上，此方法简单，快速，广泛应用于临床筛查。
[0031] 本发明还提供了前述的检测试纸和检测试剂盒在制备检测无乳链球菌中的用途。
[0032] 本发明还提供了一种无乳链球菌的检测方法，步骤如下：用本发明检测试纸的样 品垫浸润待检样品，观察检测区和质控区是否显色，即可。
[0033] 本发明还提供了一种无乳链球菌的检测方法，步骤如下：取待检样本，用前所述的 检测试剂盒检测，即可。
[0034] 优选地，所述待检样本为鱼体或者养殖水体。
[0035] 本发明无乳链球菌单克隆抗体制备的胶体金快速检测试纸，其灵敏度高，特异性 好，操作方便、快速，解决了现有无乳链球菌检测的问题，应用前景良好。
[0036] 在本试纸成功研制之前，国际上尚无针对无乳链球菌的胶体金快速检测试纸的报 道。从已有文献来看，研制该试纸所需要的生物材料非常难以制备和获取。因此，本试纸的 成功研制在世界上尚属首次，处于世界领先水平。
[0037] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0038] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0039] 图1单抗的纯化结果
[0040] 图2试纸的结构，1 :PVC底板；2 :硝酸纤维素膜；3 :胶体金垫；4 :吸水垫；5 :检测 区；6 :质控区；7 :样品塾；
[0041] 图 3 1 :6X1010CFU/ml ;2 :6X109CFU/ml ;3 :6X10sCFU/ml ;4 :6X107CFU/ml ;5 : 6X106CFU/ml ;C Line :质控线；T Line :检测线；
[0042] 图4试纸条的特异性测试；
[0043] 图5发病鱼组织及水体的检测结果。
【具体实施方式】
[0044] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒 说明书选择。
[0045] 实验材料：
[0046] 细菌：无乳链球菌TW3用于克隆和制备重组抗原，无乳链球菌（ATCC 51487)、无乳 链球菌C918 (牛源）、无乳链球菌TW7 (鱼源）、无乳链球菌TW10